探索解剖学和化学标记物以表征和区分不同种类的Bidens（菊科植物）

《Revista Brasileira de Farmacognosia》：Exploring Anatomical and Chemical Markers to Characterize and Differentiate Among Bidens Species

　　摘要：Bidens pilosa L.、Bidens alba (L.) DC. 和 Bidens subalternans DC. 属于菊科植物，由于它们的形态相似性，经常被误认。本研究对这些物种的形态解剖特征、组织化学特性以及通过液相色谱-质谱法获得的化学指纹进行了比较分析。使用光学显微镜、场发射扫描电子显微镜和能量分散X射线光谱技术来表征诊断结构。通过组织化学检测和液相色谱-质谱法从叶片、茎和根的提取物中获取化学信息，并采用多元化学计量学方法（包括主成分分析）对数据集进行分类。形态解剖和组织化学分析有助于识别和区分这三个物种；此外，液相色谱-质谱分析显示Bidens提取物中的主要化合物是酚类物质，利用化学计量学方法可以区分不同物种和植物部位。这些互补的方法为区分密切相关的Bidens物种提供了坚实的基础，并支持更可靠的药用植物鉴定。

引言：Bidens属（菊科）是全球分布的，包含约223个物种（POWO 2025）。在美国，Bidens物种通常被称为Spanish needles、beggar’s ticks、devil’s needles、cobbler’s pegs、broom stick、pitchforks、bur-marigold、black Jack和farmers’ friends（Bartolome等人2013）；在委内瑞拉称为“cadillo rocero”；在秘鲁称为“amor-seco”和“pirca”；在中国称为“pinyin”和“jin zhan yin pan”；在巴西称为“pico-pico”、“pic?o”、“pic?o-preto”、“carrapicho”、“piolho-de-padre”、“pic?o-do-campo”、“erva-pic?o”和“fura-capa”（Gilbert等人2013；Bringel等人2025）。其中19个物种原产于巴西，Bidens pilosa L.、B. alba (L.) DC. 和 Bidens subalternans DC. 具有相同的通用名称，并且在形态上相似（Grombone-Guaratini等人2004；Lorenzi和Matos 2008），形成了“Bidens pilosa复合体”。这一复合体的界定可能因地区而异；在巴西东南部，该复合体被认为包括B. pilosa、B. alba 和 B. subalternans这三个在诊断特征上有广泛重叠的密切相关的分类单元（Grombone-Guaratini等人2005, 2006）。传统的分类主要依赖于形态特征，特别是头状花序的特征和瘦果的特征（包括冠毛）；然而，这些特征在物种内部和不同种群之间可能存在变异，使得仅基于外部形态的鉴定不精确且常常存在争议（Grombone-Guaratini等人2004）。细胞遗传学证据进一步支持了这种复杂性，并提供了额外的鉴别依据，因为据报道B. pilosa的染色体数为2n=72，而B. subalternans和B. alba的染色体数为2n=48，表明多倍性和细胞型差异加剧了分类难度，并有助于物种分离（Grombone-Guaratini等人2006）。此外，在传统医药系统中，这三个物种被交替用于抗炎、抗菌、保护肝脏、降低血压、抗溃疡、治疗消化系统疾病、糖尿病、癌症、黄疸、疟疾、心绞痛、流感、感冒、疼痛、发热和水肿。这些生物特性归因于次生代谢物的存在，如苯丙素类、萜类和多炔类化合物，尤其是黄酮类和酚酸类化合物（Ortega等人2000；Grombone-Guaratini等人2005；Lans 2006；Ong等人2008；Bartolome等人2013；Borges等人2013；Silva等人2013；Gbashi等人2017）。多项关于菊科植物的研究表明，结合形态解剖学证据与化学指纹方法（包括高效液相色谱和基于高分辨率液相色谱-质谱的分析）可以提高物种鉴定的准确性，并加强植物原料的质量控制（Antunes等人2024；Gempo等人2024）。在Bidens属中，药植物学研究确定了B. pilosa的有用解剖和组织化学标志物，包括表皮和毛状体的特征以及酚类成分的定位（Duarte和Estelita 1999；Sá等人2017）。此外，还应用了高效液相色谱、液相色谱-质谱化学指纹技术和基于特征的谱型分析来表征B. pilosa提取物并区分植物器官（Chiang等人2004；Cortés-Rojas等人2013；Chagas-Paula等人2015；Ramabulana等人2020）。因此，本研究旨在通过结合形态学、显微镜技术、微观形态学和液相色谱-质谱技术，比较这三个Bidens物种的形态解剖和化学特征，为准确鉴定和区分这些物种提供坚实的基础。

材料与方法：
植物材料：每种物种采集了五株个体植物（B. alba、B. pilosa和B. subalternans，每种5株，总计15株）。Bidens pilosa样本采集于巴西Ponta Grossa的Fazenda Escola Cap?o da On?a（南纬25° 5′ 43″，西经50° 3′ 26″）。B. subalternans和B. alba的样本分别采集于Ponta Grossa州立大学（南纬25° 5′ 23″，西经50° 6′ 23″；南纬25° 5′ 23″，西经50° 6′ 23″）。所有三个物种均采集于2021年11月，由Claudio A. Mondin鉴定，标本存放在Ponta Grossa州立大学标本馆（HUPG），编号分别为Bidens pilosa（22498）、Bidens subalternans（21262）和Bidens alba（22499）。

光学显微镜技术：
从健康且完整的成熟叶片、茎和根中获取新鲜样本，用福尔马林-醋酸-酒精（FAA70）固定3天（Johansen 1940），然后用蒸馏水洗涤，并储存在70%乙醇溶液中（v/v）（Berlyn和Miksche 1976）。使用剃须刀将叶片、茎和根切成横截面和纵截面。切片用astra blue和basic fuchsin染色（Roeser 1972），并固定在含有50%甘油的玻璃载玻片上，加盖透明指甲油密封。对于表皮表面的分析，将叶片的小片段洗涤后用次氯酸盐溶液（5%）处理至半透明，再用蒸馏水洗涤并中和至醋酸溶液（5%），最后用藏红花素（Fuchs 1963）染色并按照上述方法固定。

微测量：
通过对多个叶片样本进行20次测量来定量研究气孔。气孔指数（SI）通过以下公式计算：S = 每单位面积的气孔数量，E = 同单位面积内的表皮细胞（包括毛状体）数量。测量每个物种叶片不同位置20个气孔的长度和宽度，以确定平均气孔大小。

场发射扫描电子显微镜：
对于场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析，将FAA固定的样本通过逐渐增加浓度的乙醇（30%、50%、70%、95%和100%）脱水，并在Leica EM CPD300临界点干燥器（Leica Microsystems，德国Wetzlar）中用液态CO2作为过渡流体干燥。干燥后的样本用Quorum SC7620溅射镀膜机（Quorum Technologies Ltd., 英国Kent）镀金。电子显微照片使用Tescan Mira3场发射SEM在高真空模式下制备，加速电压为15 kV。该过程在Ponta Grossa州立大学的多用户实验室（C-Labmu）进行。

能量分散X射线光谱：
在FESEM观察期间进行能量分散X射线光谱（EDS）分析，以表征晶体的化学组成。测量来自晶体及其周围无晶体的细胞的数据，后者作为内部对照。分析使用EDS检测器与FESEM结合进行，操作电压为15 kV。所有程序均在Ponta Grossa州立大学的多用户实验室复合体（C-Labmu）进行。

组织化学测试：
对FAA固定的Bidens pilosa、B. alba和B. subalternans的叶片、茎和根进行组织化学测试。固定后，样本转移到70%乙醇中保存直至切片。手工制备横截面并进行组织化学反应。染色反应在切片后立即进行，并作为原位定位指标进行定性解释，不用于定量推断。由于FAA固定和随后的乙醇储存可能会影响易提取成分（尤其是脂质物质和某些酚类化合物）的检测性，因此对组织化学结果进行了保守解释。植物材料的切片用标准试剂进行测试，如苏丹III检测脂质物质（Foster 1949）、碘溶液检测淀粉（Berlyn和Miksche 1976）、floroglucinol/HCl检测木质化成分（Sass 1951）、10%重铬酸钾（Gabe 1968）和2%氯化铁检测酚类化合物（Johansen 1940）。在相同条件下同时处理适当的对照样本。

提取物制备和液相色谱-质谱分析：
将根、茎和叶的样本分别在循环烤箱中干燥。使用750毫升96° GL乙醇在Soxhlet提取器中提取。UPLC/QTOF分析在Waters? Ultra Performance Liquid Chromatography上进行，包括以下模块：二元泵、真空溶剂微脱气器、自动采样器、温控柱室，以及与Xevo Waters?质谱仪连接。色谱分离使用BEH C18（1.7 μm，2.1 × 100 mm）反相柱。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.01%甲酸甲醇溶液（B）组成。梯度洗脱程序从5% B开始，12分钟内达到100% B，保持3分钟，然后在16分钟内恢复到初始条件。流速为0.3 ml/min，进样体积为4 μl，柱温保持在30°C。质谱仪采用负离子模式运行，配备ESI源，碰撞能量和锥电压均设为40 V。通过使用m/z 112.9856的参考质量进行离子校正技术获得准确的质量测量（去质子化的三氟乙酸-TFA）。质量基于MONA（Mass Bank of North America —https://www.massbank.us/）和文献中发表的一些文章（Chiang等人2004；Safer等人2011；Saltos等人2015；Chen等人2016；Lusa等人2016；Khoza等人2016；Gbashi等人2017；Machinski等人2024）进行研究。

多元和单变量统计分析：
液相色谱-质谱色谱图（范围2至8分钟）使用Masslynx版本4.1进行预处理。数据集（27 × 2108）导入Matlab版本2020a，并使用Icoshift进行对齐。在平滑、基线校正和变量中心化处理后，应用奇异值分解算法进行PCA。通过方差分析和Tukey检验（p < 0.05）评估特定化合物数据，并应用Levene检验验证方差齐性。

结果与讨论：
本研究调查并比较了三种Bidens物种的关键形态特征。总体而言，这三个物种（图1a–c）均为草本植物，高度为0.3–1.2米，具有基本的形态特征。茎呈绿色至红紫色，四棱形，直立或匍匐生长。叶片对生且有叶柄。然而，这三个物种具有一些独特的叶片形态特征，有助于其鉴定。Bidens alba的叶片通常为三出复叶或羽状复叶，裂片呈卵状披针形，边缘有锯齿或深锯齿（图1a, d），表面无毛或略带绒毛，尤其是在叶脉上。Bidens pilosa的叶片为羽状复叶或二回羽状复叶，裂片为披针形或卵状披针形，边缘有锯齿（图1b, e），表面有明显的绒毛或短柔毛，通常两侧都有。而B. subalternans的特征在于其叶片分裂更为明显，通常为二回羽状复叶，叶片小段呈卵状披针形，边缘具有深锯齿（图1c, f），并且叶片表面主要覆盖着粗糙的毛状物，使得叶片触感较为粗糙。图1中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的形态特征如下：a, d, g 为Bidens alba；b, e, h 为Bidens pilosa；c, f, i 为Bidens subalternans（ad为上表面，ab为下表面）。比例尺：a–c, e, g = 5厘米；d = 1厘米；f, h, i = 2厘米。

此外，Bidens alba的花序由辐射状的头状花序组成，其舌状花为白色、反折且不育，长度约为14–16毫米；管状花为黄色、可育且两性，长度约为5.5毫米（图1g）；Bidens pilosa的花序由盘状或辐射状的头状花序组成，舌状花为白色至鲑鱼色、不育，长度约为3–4毫米，而管状花为黄色、长度约为3.5–4毫米（图1h）；而Bidens subalternans的花序同样由盘状或辐射状的头状花序组成，舌状花为黄色、不育，长度为4–6毫米；管状花为黄色、长度约为3–4毫米（图1i）。这些差异，尤其是花序结构、叶片分裂程度、叶片小段形状以及毛状物类型，对于区分这些物种的形态特征非常重要。

在光学显微镜和扫描电子显微镜观察中，根据Yang等人（2012年）提出的标准，将反折表皮细胞的壁分为光滑角或（轻微）弯曲角。在Bidens alba的上表面和下表面，细胞壁均为光滑角（图2a, d），而在Bidens pilosa的两表面，细胞壁均为弯曲角（图2b, e）；Bidens subalternans的上表面细胞壁为弯曲角，下表面细胞壁为轻微弯曲角（图2f）。三种研究物种的表皮均覆盖着条纹状的角质层（图2g–l）。此外，三种物种的表皮上均观察到异型细胞和不等型细胞的气孔，表明这些叶片具有双面气孔结构（图2a–f）。Sa等人（2017年）也在Bidens pilosa中观察到了弯曲角的反折细胞壁、双面气孔、异型细胞和不等型细胞气孔。Essiett和Archibong（2014年）在Bidens pilosa的叶片两面发现了双型细胞和星型细胞气孔，同时仅在下表面发现了短副型细胞气孔。

图2中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的叶片表皮——正面视图（光学显微镜：a–f（用甲苯胺蓝染色）；扫描电子显微镜：g–l）。B. alba a, d, g, g′, j；B. pilosa b, e, h, k；B. subalternans c, f, i, l。上表面a–c, g–i；下表面d–f, j–l（ct为角质层；cr为晶体；st为气孔）。比例尺：a–f = 50微米，g–l = 5微米，g′ = 3微米。

在B. alba的上表面表皮细胞上发现了金字塔形晶体（图2g′），而在下表面表皮的气孔处观察到了无定形晶体（图2j）。草酸钙晶体的存在是不同植物群中的常见解剖特征（Raeski等人，2023年），它们具有抵御食草动物、调节离子平衡和储存钙的功能（Franceschi和Nakata，2005年）。

气孔的大小和气孔指数具有较高的分类学意义（Cutter，1986年）。微测量显示，所有样本中下表面的气孔指数均高于上表面。Bidens alba的上表面气孔指数为26.7%，下表面为43.9%，两者差异最为显著；Bidens pilosa的上表面气孔指数为33.6%，下表面为45.7%，下表面的气孔指数最高；而Bidens subalternans的上表面和下表面气孔指数差异最小，分别为32.7%和36.3%（Essiett和Archibong，2014年）。Essiett和Archibong（2014年）记录的Bidens pilosa的气孔指数为上表面34%，下表面46%。

考虑到气孔的平均大小，B. alba的下表面气孔（21×15微米）通常比上表面气孔（18×12微米）更大。然而，Bidens pilosa的情况相反，其上表面气孔（18×14微米）比下表面气孔（17×13微米）更大。Bidens subalternans的两表面气孔大小相当，分别为20×11微米和19×13微米。此外，气孔的宽度比长度更稳定。

本研究中识别出三种类型的毛状体（图3a–i）：I型为不分枝、无腺体的单细胞毛状体，基部宽大，由4–6个细胞组成，细胞壁厚，顶端细胞细长（图3a–f, i）。这些毛状体表面覆盖着条纹状的角质层（图3a, c），某些细胞内部观察到了微小晶体。围绕这种毛状体的表皮细胞呈莲座状排列。所有物种的叶片边缘也分布着无腺体毛状体，其顶端细胞均匀朝向叶片顶端（图3d–f），使得叶片表面呈现粗糙的毛状结构。

图3中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的叶片毛状体（d–i，m：光学显微镜；a–c，j–l，n：扫描电子显微镜）。B. alba（a, d, g, j–l），B. pilosa（b, e, h, m），B. subalternans（c, f, i, n）（bc为基部细胞；gf为鞭毛状腺体毛状体（III型）；fl为鞭毛；ns为不分枝无腺体毛状体（I型）；np为多细胞单细胞无腺体毛状体（II型）。比例尺：a–c = 10微米，d–l = 50微米，m = 25微米，n = 100微米。

II型毛状体为无腺体、多细胞、单细胞结构，由4–10个细胞组成，基部细胞呈基座状，表面覆盖着条纹状角质层，顶端细胞略长于其他细胞（图3g, j, k, m）。Essiett和Archibong（2014年）以及Sá等人（2017年）将这种毛状体称为腺体毛状体，但未观察到腺体头部或油脂分泌现象。III型为鞭毛状腺体毛状体（图3h, l），由基部的1–3个细胞和顶端的一个细长圆柱形管组成，管内含有透明分泌物。Bidens alba和B. pilosa具有这三种类型的毛状体，而B. subalternans仅具有I型和II型毛状体。

所有物种的叶片横截面均显示单层表皮，外部覆盖着中等厚度的角质层，该角质层能与苏丹III试剂发生阳性反应。叶肉组织为背腹对称结构，包含一层栅栏组织和平约四层海绵组织。较小的维管束位于叶肉中部，并被一层薄壁组织包裹（图4a–c）。中脉在上表面呈双凸形状，在下表面呈圆形或略微平凸形状。之前在叶片表皮中描述的毛状体也存在于中脉中。表皮下方，两侧各有一到两层角质层；然而，上表面的光合组织是连续的。维管系统由三个开放的弧形维管束组成，其中中央的维管束最大。分泌导管由单层上皮细胞形成，靠近维管束的薄壁组织中分泌亲脂性物质（图4d–f）。叶柄横截面也呈双凸形状，上表面有两个翼（图4g–i）。中脉的整体解剖结构与叶柄相似。

图4中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的叶片解剖结构——叶片横截面（a–c为叶片，d–f为中脉，g–i为叶柄）。B. alba（a, d, g），B. pilosa（b, e, h），B. subalternans（c, f, i）（co为角质层；ep为表皮；gp为薄壁组织；pp为栅栏组织；sd为分泌导管；sp为海绵组织；vb为维管束）。比例尺：a–c = 50微米，d–i = 300微米。

茎的横截面呈四边形，具有四个角状突起，在所有三个物种中这些突起可能略微或明显突出（图5c, f, i）。表皮为单层，覆盖着薄而带条纹的角质层。皮层中，厚角组织与角质层交替排列（图5d–f）。在突起区域，三种物种中均观察到多层角质层（图5g–i）。该区域还发现了分泌导管（图5h, i）。厚角组织中含有棕色物质，这些物质可能是酚类化合物。皮层的内层是内皮层（图5g–k），其中含有能与碘溶液发生阳性反应的淀粉颗粒（图5g）。

图5中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的茎解剖结构——横截面。B. alba（a, d, g），B. pilosa（b, e, h），B. subalternans（c, f, i）（co为角质层；en为内皮层；ep为表皮；fi为纤维；ph为韧皮部；pi为髓；sg为淀粉颗粒；sd为分泌导管；vb为维管束）。比例尺：a–c = 500微米，d–f = 200微米。

茎的维管系统由大约20个维管束组成，形成一个环状结构，包围着髓（图5a–c）。每个突起中也存在一个维管束（图5c, f）。在韧皮部附近还发现了一个围绕维管束的纤维帽（图5）。髓占据了茎的大部分中央区域，由薄壁组织构成（图5a–c）。三种Bidens物种的髓中均含有金字塔形晶体（图6a–c），但只有B. alba的髓中也含有立方形晶体。

图6中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

扫描电子显微镜下的Bidens属植物茎横截面晶体图像。B. alba（a），B. pilosa（b），B. subalternans（c）。比例尺：a, b = 10微米，c = 20微米。

三种研究物种的根横截面呈圆形。可以观察到次生生长以及周皮的形成。皮层由大约五层薄壁组织构成，并包裹着分泌导管。内皮层包围着皮层，具有卡斯帕里条纹。韧皮部围绕着木质部，木质部占据根的中央区域，并含有薄壁组织射线。韧皮部中还发现了纤维群（图7a–f）。

图7中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens属植物的根解剖结构——横截面。B. alba（a, d），B. pilosa（b, e），B. subalternans（c, f）（co为角质层；cp为皮层薄壁组织；en为内皮层；fi为纤维；pe为周皮；xy为木质部）。比例尺：a–c = 500微米，d–f = 300微米。

通过对晶体进行元素分析（图2j和8a, b），发现从气孔中产生的无定形晶体表明存在一种排泄机制，可能与其排除过量钙或调节渗透压平衡有关，同时也起到抵御微生物和昆虫的物理屏障作用。尽管这种气孔现象记录较少，但它被认为与某些物种适应富含矿物质盐的环境的能力有关（Nakata，2015年）。

图8中的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

Bidens alba的场发射扫描电子显微镜图像和能量色散X射线光谱图。无定形晶体（a, b）和立方形晶体（c）。0 keV处的突出峰为噪声峰，2.1 keV处的峰为用于SEM分析样品溅射镀金的金（Au）。

EDS分析后，无定形晶体中检测到了钾、硫和钠等元素（图8a, b），而当化学成分仅为草酸钙时，则观察到立方形晶体结构（图8c）。这一发现表明，异质离子的掺入可能会影响草酸钙的有序排列，从而导致晶体形态的变化。

在本研究中，采用LC-MS分析对三种物种的茎、根和叶中初步鉴定出的不同化合物进行了表征。分析结果显示，这些化合物主要为多酚类（包括酚酸及其衍生物）和黄酮类（及其糖苷形式），它们存在于所有植物部位。这些化合物之前也在Bidens属植物中被鉴定过（Chiang等人，2004年；Silva等人，2013年；Yang，2014年；Bartolome等人，2013年；Liang和Xu，2016年）。表S1列出了在三种物种中鉴定出的化合物。这些化合物在所有分析样本中的浓度存在差异；咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸以及某些黄酮类（如槲皮素和奥卡宁衍生物）的浓度变化较大（图S1和图S2）。与其他Bidens属物种一样，酚类化合物在Bidens属植物中普遍存在，其化学结构和独特特性共同影响了植物的整体生物活性。

此外，如表S2所示，共鉴定出21种化合物和2种未知化合物。咖啡酰奎宁酸和二-O-咖啡酰奎宁酸在m/z 353和515处显示出离子峰；奥卡宁衍生物在m/z 533、575和679处显示出离子峰；槲皮素和木犀草素衍生物在m/z 609、447和531处显示出离子峰。其他化合物包括二羟基苯甲酰己糖苷（m/z 315）、奎宁酸（m/z 191）和咖啡酰木糖（m/z 311）。尽管这些样品的类别是已知的，但仍采用了无监督模式识别方法来观察数据集的结构。PCA得分图（PC1 × PC2）能够根据物种、组织和热/蒸汽处理方式清晰地分离Bidens样品（图9a）。PC1（解释了70%的方差）是主要的区分因素，它将那些主要含有标记物1-9的样品区分开来，这些标记物分别对应于咖啡酰奎宁酸衍生物（1和4-5）、咖啡酰木糖（2）、槲皮素-O-葡萄糖苷（3）和乙酰化奥卡宁糖苷（6-9），而将那些含有这些化合物相对较少的样品区分开来（图9b）。PC2（解释了18%的方差）通过对比相对富集在后期洗脱的乙酰化奥卡宁糖苷（6-9；PC2正向）与更与早期洗脱的酚类标记物相关的谱型（尤其是咖啡酰奎宁酸和槲皮素-O-葡萄糖苷（1-5；PC2负向）进一步细化了分离（图9c）。总体而言，载荷图表明这些酚类和奥卡宁衍生物相对丰度的变化驱动了观察到的聚类现象，这表明植物基质（叶与根）和处理方式（蒸汽/热处理时间）都对Bidens样品之间的化学差异有所贡献。

图9
该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
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不同热处理时间下Bidens的PC1 × PC2得分图。a. 载荷与PC1和PC2的得分相对应。数字表示以下化合物：1，3-O-咖啡酰奎宁酸；2，咖啡酰木糖；3，槲皮素-O-葡萄糖苷；4和5，二-O-咖啡酰奎宁酸；6和7，奥卡宁-O-(二乙酰)-己糖苷；8和9，奥卡宁-O-(三乙酰)葡萄糖苷。物种分别标记为Alb（B. alba）、Pil（B. pilosa）、Sub（B. subalternans）；L（叶）、R（根）和S（茎）。

为了了解成分含量的变化，通过验证不同物种间的化合物含量进行了半定量分析（图10a, b），结果显示B. subalternans的根和叶在PC1载荷图的正向区域含有较高的咖啡酰和二咖啡酰含量。此外，B. pilosa的叶子和B. alba的叶子和根在咖啡酰和二咖啡酰含量上也存在差异（B. pilosa的叶子两者含量都较高——图10c），并且B. pilosa的叶子在奥卡宁-O-(二乙酰)-己糖苷的含量上也较高，位于PC2的正向区域。

图10
该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
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使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）对Bidens物种中的咖啡酰奎宁酸（a，化合物4）、二咖啡酰奎宁酸（b，化合物10）和奥卡宁-O-(二乙酰)-己糖苷（c，化合物14）进行半定量（相对峰面积）评估：Alb（B. alba）、Pil（B. pilosa）、Sub（B. subalternans）、L（叶）、R（根）、S（茎）。

需要注意的是，本研究基于在单一地理区域和单一采集期间收集的材料，每个物种分析了五个个体。鉴于Bidens类群具有较高的表型可塑性和广泛的地理分布（Grombone-Guaratini等人，2005年），如果在更多种群、季节和环境条件下进行更广泛的采样，将进一步增强这些诊断特征及其相关化学指纹的普遍性。然而，同一物种内个体间观察到的一致性，以及形态解剖学和LC-MS指纹分析提供的补充证据，支持了此处提出的诊断方法的一致性。

结论
在研究的三种Bidens物种中，形态学鉴定常常会导致混淆。本研究表明，结合使用形态解剖学和化学技术对于它们的区分是决定性的。某些形态解剖学特征显示出作为可靠物种划分标志物的潜力，特别是花序类型、叶片分裂程度、节段形状、表皮细胞壁类型、气孔大小和指数、毛状体组合、形态类型以及晶体组成。同样，对物种提取物谱型的化学计量分析有助于强化三种物种之间的差异。因此，这种综合分析方法成为确定B. pilosa、B. alba和B. subalternans之间的形态解剖学和化学差异的强大工具，使它们能够被清晰地区分。总体而言，这种综合方法为Bidens物种的鉴定和植物原材料的质量控制提供了有用的框架。由于本研究基于在单一地区和时期收集的材料（每个物种5个个体），如果在更多种群、季节和环境条件下进行更广泛的采样，将进一步增强这些诊断特征和化学指纹的普遍性，并支持将这一策略扩展到B. pilosa复合群中的其他物种。