非孕妇成人中无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）菌血症的临床和分子特征：日本广岛市一家医院16年的单中心分析

《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》：Clinical and molecular characteristics of Streptococcus agalactiae bacteremia in nonpregnant adults: a single-center analysis over 16 years in Hiroshima, Japan

　　摘要
目的
关于在日本非孕妇中引起菌血症的B群链球菌（Streptococcus agalactiae [GBS]）的分子流行病学数据仍然有限。本研究阐明了导致该人群菌血症的GBS菌株的临床特征和分子流行病学情况。

方法
回顾性分析了2008年至2023年间在广岛大学医院接受治疗的非孕妇GBS患者的资料。收集了临床数据，并通过药敏测试和全基因组测序对菌株进行了抗菌敏感性分析。

结果
共识别出73名成人患者，发生了74次GBS菌血症。最常见的感染部位是皮肤和软组织（25.7%）以及来源不明的菌血症（20.3%）。17名患者（23.0%）出现了链球菌性中毒性休克综合征（STSS），30天死亡率为25.7%。主要的血清型/克隆复合体（CC）谱系为Ib/CC12（n=14，18.9%）、V/CC1（n=12，16.2%）和Ia/CC23（n=7，9.5%）。值得注意的是，所有7株Ia/CC23菌株和10株（83.3%）V/CC1菌株均是在2016年后分离出的。基于单核苷酸多态性的分析显示，存在在儿童和成人人群中传播的ST17和ST464谱系菌株。

结论
本研究表明，在过去10年中，Ia/CC23和V/CC1谱系在日本非孕妇中的侵袭性GBS菌株中出现了新的流行趋势。确定不同年龄组之间的传播途径可能有助于减少儿童和成人人群中的侵袭性GBS感染负担，并制定有效的公共卫生和预防策略。

引言
B群链球菌（Streptococcus agalactiae [GBS]）是新生儿和孕妇侵袭性疾病的主要原因[1, 2]。尽管历史上被认为是一种围产期病原体，但GBS越来越多地被认作是全球非孕妇（尤其是老年人和有基础疾病的人群）中侵袭性感染的重要原因[3]。根据Active Bacterial Core监测网络进行的人群监测显示，2008年至2016年间美国有21,250名非孕妇发生了侵袭性GBS感染（iGBS）[4]。研究期间，iGBS的发病率从每10万人8.1例显著增加到10.9例。发病率随年龄增长而增加，在80岁及以上的老年人中达到峰值，占所有患者的17.7%。总体病例死亡率为6.5%，从2008年的7.5%下降到2016年的5.6%。此外，至少有一种基础疾病的iGBS患者比例从2008年的90.7%增加到2016年的94.6%（趋势p = 0.005）。

自Stevens首次描述以来，链球菌性中毒性休克综合征（STSS）已被广泛认为是A群链球菌（Streptococcus pyogenes）感染的严重临床表现[5]。在这种背景下，由其他β-溶血性链球菌（BHS）引起的严重感染有时也被归类为“侵袭性/暴发性链球菌感染”，即使缺乏提示超抗原介导机制的临床证据。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）2010年制定的STSS诊断标准[6]，无论是严重的GAS感染还是由B、C、G群其他链球菌引起的感染都被指定为应报告的疾病。诊断这些疾病的医生有法律义务向当地公共卫生机构报告此类病例。

尽管日本有关于iGBS参与基于症状的STS样综合征的流行病学数据，例如与其他Lancefield群链球菌相比的相对频率，但iGBS患者的总体死亡率仍然有限。目前，针对GBS的母体疫苗正在积极开发中[7, 8]。类似于肺炎球菌疫苗，这些疫苗最终也可能扩展到成人。在这种情况下，关于成人iGBS发病率和死亡率的可靠流行病学数据对于准确评估此类疫苗策略的成本效益至关重要。

最近的一项系统评价显示，非孕妇中的GBS菌株存在显著的分子多样性，主要克隆复合体（CC）和抗菌耐药性谱存在地理差异[3]。在日本，几项区域性和全国性的研究已经描述了iGBS菌株的分子特征；然而，大多数研究集中在婴儿或混合年龄队列上，针对非孕妇的全面分子流行病学数据仍然有限[9,10,11]。此外，Kasai等人最近证明，在儿童iGBS中检测到密切相关的菌株在广泛的时间和空间范围内存在，表明儿童GBS菌株在环境中传播[12]。然而，迄今为止，还没有研究探讨来自儿童iGBS的菌株与非孕妇中检测到的菌株之间的关系。

本研究分析了在一家教学医院接受治疗的成人iGBS患者的临床数据和全基因组测序信息，以阐明日本成人iGBS的临床特征与致病菌株的细菌特性之间的关联。此外，通过将本研究中收集的菌株基因组数据与之前报道的日本儿童iGBS菌株的数据进行比较，我们探讨了成人和儿童人群之间可能的流行病学联系。

材料与方法
研究设计和参与者
这项回顾性队列研究包括了2008年1月1日至2023年12月31日期间入住广岛大学医院的所有成人iGBS患者。从医院实验室信息系统中检索了研究期间从血液培养中分离出的所有GBS菌株的数据。只有年龄≥18岁的患者被纳入研究。怀孕或在细菌分离前30天内分娩的女性被排除在外。在同一住院期间经历反复菌血症发作的患者也被排除。即使发生在同一患者身上，符合上述纳入标准的发作也被视为独立事件。本研究获得了广岛大学流行病学伦理委员会（E2020-2133-01）和日本国立传染病研究所（提交ID：1512）的批准。由于研究的非侵入性性质，无需获得知情同意。

临床数据的收集
临床数据包括患者人口统计信息、合并症、Charlson合并症指数[13]、菌血症来源、血液培养时是否存在败血症休克、血液培养结果以及28天死亡率，均从医院的电子医疗系统中收集。败血症休克的定义如前所述[14]。STSS的诊断基于以下三个标准[6]：(1) 由上述BHS引起的感染；(2) 低血压，定义为收缩压≤90 mm Hg；(3) 多器官受累，定义为以下两种或更多情况的存在：肾功能障碍（肌酐≥2 mg/dL或对于已有肾病患者而言比基线水平增加>2倍）、凝血功能障碍（血小板计数≤100,000细胞/μL或存在弥散性血管内凝血）、肝功能障碍（丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶或总胆红素水平≥患者年龄的正常上限的2倍，或对于已有肝病患者而言比基线水平增加2倍）、急性呼吸窘迫综合征，或全身性红斑丘疹或软组织坏死。败血症休克和STSS的诊断随后通过两名传染病医生的病历回顾得到确认。

微生物学程序
2008年1月1日至2022年4月17日使用BacT/ALERT 3D系统（bioMérieux，Marcy l’étoile，法国）进行血液培养，2022年4月18日至2023年12月31日使用BacT/ALERT Virtuo系统（bioMérieux）进行血液培养。两个时期都使用了Bact/ALERT FA和FN Plus瓶（bioMérieux）。2016年1月1日至2021年3月31日使用Vitek 2 compact系统和Vitek 2 GP ID卡（bioMérieux）进行细菌鉴定，2021年4月1日至2023年12月31日使用matrix-assisted激光解吸/离子飞行时间质谱仪和MALDI Biotyper Sirius系统（Bruker Daltonik GmbH，不来梅，德国）进行鉴定。GBS菌株储存在Microbank?（Pro Lab Diagnostics Inc., Richmond Hill，加拿大）中，温度为-80°C，以备进一步使用。

抗菌敏感性测试和血清分型
抗菌敏感性测试使用IA40 MIC-i Dry Plates（Eiken Chemical Co., Ltd., 东京，日本）进行肉汤稀释法，并遵循临床和实验室标准协会（CLSI）参考标准[15]。确定了青霉素（PEN）、头孢噻肟（CTX）、红霉素（ERY）、克林霉素（CLI）和左氧氟沙星（LVX）的最小抑制浓度。此外，我们还使用含有0.5 μg/mL CLI和1 μg/mL ERY的组合孔评估了可诱导的CLI耐药性[15]。根据CLSI 2024指南，将敏感性分为敏感（S）、中间（I）和耐药（R）三类。对于没有CLSI定义的I或R类别的抗菌药物，未分类为“S”的菌株被视为“R”以保持一致性。

血清分型使用GBS乳胶凝集试验试剂盒ImmuLex Strep-B Kit（SSI Diagnostica，Hiller?d，丹麦）进行，按照制造商的说明进行。

全基因组测序
根据制造商的说明，使用QIAamp? DNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，德国）提取基因组DNA。多重样本在Illumina NovaSeq X Plus平台上进行300圈测序，生成150 bp的配对末端读段。经过修剪和质量控制后，数据使用内部管道进行分析[16]。简要来说，使用mlst（https://github.com/tseemann/mlst）进行了计算机多基因座序列分型[17]，并使用ABRicate版本1.0.1（https://github.com/tseemann/abricate）和NCBI [18]及ResFinder数据库[19]识别耐药基因。表面蛋白包括高毒力GBS粘附素（HvgA）、Srr蛋白（Srr1和Srr2）、α蛋白家族成员（BCA、Rib、Alp2/3和Alp1）和菌毛岛（PI-1、PI-2 A和PI-2B）的检测方法如前所述[20]。使用kSNP4 v4.1 [21]为所有测试菌株构建了基于k-mer的最大似然系统发育树。为了识别潜在的本地化GBS亚群，使用CFSAN SNP Pipeline版本2.2.1 [22]对每种序列类型的菌株进行了单核苷酸多态性（SNP）分析，并与2004年至2023年间日本儿童iGBS的菌株进行了比较[12]。在这项比较中，我们将具有≤15个成对SNP的菌株定义为具有遗传联系，基于2015年新加坡GBS-ST283暴发菌株的全基因组分析中一年内累积的SNP总数（每年14个SNP）。此外，相差16-20个成对SNP的菌株被任意分类为具有潜在的遗传联系。

统计分析
分类变量以频率和百分比（%）表示，连续变量以中位数和四分位数范围表示。使用Fisher精确检验比较分类变量。统计显著性设定为p < 0.05。所有分析均使用JMP Pro软件（版本18.0；SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）进行。

结果
在研究期间，73名成人患者经历了74次iGBS发作。患者的人口统计信息和临床特征总结在表1中。中位年龄为69岁（四分位数范围[IQR]：58–77岁），47名（63.5%）患者年龄≥65岁。研究队列包括48名男性患者（64.8%）。最常见的合并症是实体器官恶性肿瘤（37.8%），其次是糖尿病（36.5%）和肝病（24.3%）。iGBS的主要来源是皮肤和软组织感染（25.7%）、无明显感染灶的菌血症（20.3%）以及导管相关血流感染（9.5%）。13名患者发展为多重细菌菌血症，其中金黄色葡萄球菌是最常共分离出的菌种（53.8%）。23%的患者出现了Staphylococcus STSS（葡萄球菌性败血症综合征），30天死亡率为25.7%。表1显示了非妊娠成人GBS菌血症患者的人口统计和临床特征。

血清型与多位点序列分型
血清型与克隆复合体（CC）之间的关系在表2和图1、图2中进行了总结。在从非妊娠成人患者的血液培养中分离出的74株GBS菌株中，最常见的血清型是Ib/CC12（n=15，20.3%），其次是V/CC1（n=12，16.2%）和Ia/CC23（n=7，9.5%）。

按研究时期分层显示，菌株分布存在明显的时间变化。2008年至2015年间，Ib/CC12占主导地位（37.5%，9/24），而III/CC19、V/CC1、V/CC26和VI/CC1仅在8.3%（2/24）的菌株中被检测到。相比之下，2016年至2023年间，V/CC1成为主要菌株（20.0%，10/50），其次是Ia/CC23（14.0%，7/50）、Ib/CC12（12.0%，6/50）和IV/CC452（8.0%，4/50）。

最大似然系统发育树显示了本研究中分析的74株无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的进化关系。（A）系统发育树标注了血清型、基因型（克隆复合体）和分离年份的元数据。临床综合征用浅绿色样本名称表示，紫色表示STSS。红星（★）表示年龄≥65岁的患者。（B）系统发育树标注了血清型、基因型（克隆复合体）和耐药基因的元数据。（C）系统发育树标注了血清型、基因型（克隆复合体）和主要GBS疫苗靶点的元数据。

比较分析显示，2008年至2015年间以及2016年至2023年间，Ib/CC12的比例显著下降（37.5% vs 12.0%，p=0.015）。相反，Ia/CC23（0% vs 14.0%，p=0.088）和V/CC1（8.3% vs 20.0%，p=0.32）的比例有所增加，尽管这些变化在统计学上不显著。值得注意的是，所有7株Ia/CC23菌株和10株（83.3%）V/CC1菌株都是在2016年后分离到的，表明这些菌株在最近十年中有所扩展。所有IV/CC452菌株均仅在2016年被发现。

条形图显示了2008–2015年和2016–2023年各血清型/克隆复合体的比例。其他还包括以下血清型：Ia/CC1、Ia/singleton、II/CC1、II/CC12、III/CC17、III/CC283、III/CC452、IV/CC459、VIII/CC1和NT/CC1。

在11株单微生物STSS菌株中，Ia/CC23、Ib/CC12、III/CC19和V/CC12最为常见，每种菌株各占两株（18.2%）。

所有菌株对青霉素（PEN）和头孢曲松（CTX）均敏感。其中一株GBSIR0652的PEN最低抑菌浓度（MIC）为0.125 μg/mL，属于III/ST464（CC452）血清型。该菌株在PBP2X中携带I377V、G398A、Q412L和H438Y氨基酸替换。它对 erythromycin（ERY）、clindamycin（CLI）和 levofloxacin（LVX）具有耐药性，并在gyrase A（GyrA）中携带ermB耐药基因，在parC中携带S81L耐药基因。

GBS菌株的耐药基因谱在表3和图1B中呈现。对LVX、ERY和CLI的耐药率分别为32.4%、23.0%和17.6%。所有携带ermB的菌株（n=12；16.2%）对ERY和CLI均耐药，其中V/CC1（n=4；30.0%）和III-CC19（n=3；25.0%）菌株也表现出耐药性。5株（6.8%）携带ermA基因，主要存在于Ib-CC12（n=2；40.0%）和III-CC19（n=2；40.0%）菌株中。2株（2.7%），Ia-CC23和V-CC19菌株，携带mefA/msrD基因。在24株耐LVX的菌株中，22株（91.6%）在GyrA（S81L）和parC（S79F/Y）中具有双重替换，其中Ib-CC12（n=14；58.3%）和Ib-CC1（n=4；16.6%）菌株占多数。

疫苗靶点覆盖率估计
表4总结了疫苗候选物的覆盖率。在所有菌株中，48.6%和87.8%分别被三价（血清型Ia、Ib和III）和六价（Ia、Ib和II–V）多糖疫苗覆盖。针对Alp1、Alp2/3、AlphaC和Rib N端结构域的GBS-NN/NN2疫苗的覆盖率为94.5%。值得注意的是，所有III-ST27菌株（n=3）对Srr1和Srr2检测结果均为阴性。

本研究中的菌株与日本先前儿童iGBS菌株的成对SNP距离显示，两种ST464菌株之间的成对SNP距离≤15（具体为13），表明这两种菌株之间存在遗传联系。其中一株（GBSIR0652）于2009年1月从一名成年男性体内分离，并在本研究中进行了测序。另一株（GBSIRa0060）于2010年9月从同一地区的50天大婴儿血液中分离，并在之前的研究中进行了测序[12]。此外，本研究中的一株ST23菌株和两株ST452菌株与之前儿童iGBS监测研究中收集的菌株存在潜在的遗传联系，成对SNP距离在16至20之间（表S1–S13）。同一患者的另一组菌株（GBSIR0707和GBSIR0709）的SNP距离为零。一名60岁男性最初因蜂窝织炎发展为GBS菌血症，经过适当的抗菌治疗后临床情况得到缓解。四个月后，该患者在同一解剖部位再次发生蜂窝织炎，并并发GBS菌血症。这两株菌株都属于Ib/CC1血清型。

关于本研究中分析的菌株的详细信息，请参阅补充数据。

讨论
在本研究中，从非妊娠成人患者的血液培养中分离出的74株GBS菌株中，最常见的菌株是Ib/CC12，其次是V/CC1和Ia/CC23。值得注意的是，尽管统计上不显著，但我们的发现表明自2016年以来，Ia/CC23和V/CC1菌株在非妊娠成人侵袭性GBS菌株中的比例有所增加。2008–2015年间观察到的主要分子血清型和CC分布与日本先前关于成人GBS侵袭性感染的研究结果一致[9, 10]。相比之下，本研究中的血清型和CC分布与先前从孕妇和婴儿阴道样本中分离出的GBS菌株的研究结果不同，后者中III/CC17、Ia/CC23和III/CC19是主要流行的菌株[12, 24, 25]。

在本研究中，约18%的GBS菌血症患者血液培养中检测到了其他细菌种类。最常共分离出的菌种是金黄色葡萄球菌，其次是大肠杆菌。多项关于非妊娠成人iGBS的研究表明，多重细菌菌血症可能与较差的预后相关[26, 27]。然而，共检测到的细菌种类是否直接与GBS相互作用以增强其毒力尚不清楚，先前iGBS研究中观察到的STSS可能是由GBS以外的其他微生物引起的病理生理效应。综合组学方法，如宏转录组学，可能为这些相互作用提供更深入的见解。

在本研究中，鉴定出6株IV型GBS菌株：ST452/CC452（n=4）、ST3/CC1（n=1）和ST196/CC459（n=1）。IV型/CC452 GBS菌株最初于2018年在本机构被检测到。自2000年代初以来，美国和加拿大记录到IV型/CC452的流行率逐渐增加[28, 29]。然而，先前关注成人iGBS的研究并未发现这一菌株[9, 10]。相比之下，日本最近的研究表明IV型/CC452在孕妇和儿童中有所出现[12, 16]。Kasai等人分析了2004至2023年的儿童侵袭性GBS感染，报告称IV型/CC452首次出现在2019年[12]。总体而言，这些发现表明IV型/CC452 GBS近年来在日本逐渐流行，影响了孕妇、儿童和成人。

我们鉴定出一株对PCG（penicillin-binding protein 2X）具有高MIC的III/ST464（CC452）菌株。在日本，先前已有报道过具有相同氨基酸替换的III/ST464（CC452）PEN耐药GBS（PRGBS）[1, 30]。日本PRGBS菌株主要从老年患者的呼吸道标本中分离出来，其中VI/ST1或ST458（CC1内的单一位点变异）常与PRGBS相关[1, 30, 31, 32, 33]。尽管本研究中仅检测到一株对PEN敏感性降低的菌株，但世界卫生组织在其2024年细菌优先病原体名单中将PRGBS列为中等优先级病原体[34]，这强调了持续监测和研究的必要性。

在本研究中，对ERY和CLI的耐药率分别为22.6%和17.3%，低于日本儿童iGBS菌株的报告值（分别为61.2%和43.5%[12]）。这种差异可能是因为几乎一半的儿童菌株属于III型，其中大多数属于ST17。在日本，III/ST17菌株通常携带ermB基因并对ERY和CLI具有耐药性；然而，我们的样本中仅鉴定出一株此类菌株。

在本研究中，基于α样蛋白的GBS-NN/NN2疫苗和六价多糖疫苗的覆盖率较高，超过90%，而三价多糖疫苗的覆盖率显著较低（48.6%）。相比之下，2004至2023年间日本儿童iGBS的三价和六价多糖疫苗的覆盖率分别为87.8%和98.3%[12]。本研究中三价疫苗较低的覆盖率可能是由于近年来V/CC1菌株的流行率增加所致。

先前关于儿童iGBS的研究提供了持续区域传播的证据，尤其是在ST17和ST23菌株中[12]。在本研究中收集的菌株中，有一株与同一县另一家医院治疗的儿童患者先前报告的菌株在13个SNP上存在差异，表明在有限的地理区域内可能存在流行病学联系。此外，尽管其他三例的SNP距离稍大（16–20个SNP），但这些发现也表明可能存在跨区域和人群的传播。综合这些观察结果，与先前的报告一致，表明在有限的地理区域内，克隆相关的GBS菌株可能在不同人群中传播，但鉴于这项单中心研究的范围，这一结论需要谨慎解读。需要使用更大、更具代表性的数据集进行进一步研究，以明确潜在的传播途径及其对预防策略的相关性。

在一名经历两次GBS菌血症发作的患者中，SNP分析显示两次发作中的菌株在基因组上完全相同。然而，由于缺乏关于定植和菌株基因分型的数据，这些发作背后的机制仍不清楚。

本研究存在几个局限性。它是在一个三级护理中心进行的，且患者数量相对较少。因此，这些发现不应被视为日本全国iGBS流行情况的代表。此外，本研究中观察到的GBS血清型、基因型、临床特征和患者人口统计学分布可能无法完全反映其他国家的实际情况。需要更大规模的多中心或全国性监测研究来验证和推广这些发现。

总之，我们明确了日本某中心非妊娠成人iGBS患者的STSS发生率和30天死亡率，并对74株GBS菌株进行了分子特征分析。这些结果表明，Ia/CC23和V/CC1菌株在该人群中最近有所增加，并表明三价多糖疫苗的覆盖率较低。我们的SNP分析发现，一些成人iGBS菌株与日本先前报道的儿童iGBS菌株在最多20个SNP上存在差异。这一发现表明，GBS不仅可以通过传统的母婴垂直传播途径传播，还可能通过其他途径传播，从而导致不同人群中的侵袭性感染。尽管尚无法确定直接的传播途径，但对来自多种临床和生态来源的GBS菌株进行基因组分析有助于更好地理解人群结构和可能的流行病学联系，从而为未来的预防策略提供依据。