儿童过敏性鼻炎中的系统性内皮激活与嗜酸性粒细胞炎症：endocan及嗜酸性粒细胞衍生神经毒素的诊断价值

《European Journal of Pediatrics》：Systemic endothelial activation and eosinophilic inflammation in pediatric allergic rhinitis: diagnostic value of endocan and eosinophil-derived neurotoxin

　　摘要
目标：寻找能够反映儿童过敏性鼻炎中系统性炎症的生物标志物，以支持临床诊断。本研究旨在评估患有过敏性鼻炎的儿童血清中内皮激活标志物内皮坎（endocan）和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素（EDN）的水平，探讨它们的诊断性能以及与疾病严重程度和传统炎症标志物的关联。在这项前瞻性病例对照研究中，共纳入85名过敏性鼻炎患儿和67名健康对照组。通过夹心ELISA方法检测血清中的内皮坎和EDN水平。主要结果包括比较两组生物标志物的水平，并通过接收者操作特征（ROC）曲线分析确定其诊断准确性。与对照组相比，过敏性鼻炎患儿血清中的内皮坎和EDN水平显著升高（p<0.001）。这两种生物标志物的诊断性能均较高，内皮坎的曲线下面积（AUC）为0.931，EDN的AUC为0.929，其诊断准确性优于绝对嗜酸性粒细胞计数（AUC为0.871）。内皮坎和EDN之间存在显著的正相关（r=0.88，p<0.001），并且与总IgE和嗜酸性粒细胞计数也呈显著正相关。然而，这些生物标志物与疾病严重程度、症状控制评分或过敏原致敏模式之间未观察到显著关联。

结论：过敏性鼻炎患儿血清中的内皮坎和EDN水平显著升高，在该队列中表现出较高的诊断区分度。这些发现表明内皮坎和EDN可能作为评估儿童过敏性炎症的有希望的补充生物标志物，尽管需要进一步的多中心研究来确认其临床实用性。

已知信息：
• 过敏性鼻炎（AR）在儿童中较为常见，涉及系统性炎症途径；然而，支持儿科临床诊断的客观生物标志物仍然有限。
• 内皮坎和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素（EDN）分别反映内皮激活和嗜酸性粒细胞脱颗粒，已在其他特应性和炎症性疾病中进行研究。

新发现：
• 本研究采用前瞻性病例对照设计，同时评估了过敏性鼻炎患儿血清中的内皮坎和EDN水平。
• 两种生物标志物的诊断区分度均较高（AUC约为0.93），其诊断准确性优于绝对嗜酸性粒细胞计数。
• 内皮坎和EDN在很大程度上独立于全身性炎症指标（NLR、SII、SIRI），这支持了它们在儿童过敏性鼻炎中的内皮-嗜酸性粒细胞轴的特异性。

图解摘要
（该图像的替代文本可能是使用AI生成的。）

引言
过敏性鼻炎（AR）是一种慢性鼻黏膜炎症性疾病，其特征是对空气过敏原（如花粉、尘螨和动物皮屑）的IgE介导的反应。临床表现为流鼻涕、打喷嚏以及鼻部和眼部瘙痒，影响全球大量儿童[1]。
内皮坎（endothelial cell-specific molecule-1）是一种主要由肺和肾脏血管内皮细胞表达的 dermatan sulfate 蛋白聚糖[2, 3]。它通过上调粘附分子、重组内皮细胞骨架以及与 NF-κB 信号通路相互作用，在促炎反应中起关键作用，因此被认为是内皮激活的标志物[3]。内皮坎水平升高与多种过敏性疾病相关，包括哮喘、特应性皮炎和遗传性血管性水肿，研究显示其浓度与疾病严重程度相关[4,5,6,7]。值得注意的是，哮喘患儿的血清内皮坎水平高于健康对照组，且通常与气道阻塞程度成正比[4]。同样，儿童过敏性鼻炎患者的鼻内皮坎水平也升高[8]，这表明内皮坎可能是全身性或局部特应性致敏和慢性过敏性炎症的指标[4,5,6,7,8]。
嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素（EDN）是一种在嗜酸性粒细胞激活时释放的颗粒蛋白，已成为儿童过敏性呼吸道疾病的重要生物标志物[9]。幼儿期高水平的EDN与未来3年内发生过敏性疾病的风险增加相关[10]。鉴于“特应性进程”（描述了许多过敏个体从特应性皮炎和食物过敏发展到哮喘和过敏性鼻炎的过程），识别反映这种潜在进展的生物标志物具有临床意义，EDN被认为是一个有前景的候选标志物。具体而言，EDN水平在过敏性呼吸道疾病中显著升高，尤其是在3岁以后[9,10,11]。虽然EDN对哮喘存在和严重程度的预测价值已有充分文献记载，但其在过敏性鼻炎中的作用尚未得到充分研究[4, 9, 12]。在各种嗜酸性粒细胞指标中（包括血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白和绝对嗜酸性粒细胞计数（AEC）中，EDN已被证明能显著区分急性加重的哮喘严重程度[9]，表明EDN可能是比传统嗜酸性粒细胞标志物更敏感的疾病活动指标。然而，同时评估内皮激活和嗜酸性粒细胞脱颗粒在儿童过敏性鼻炎中的临床实用性尚未系统研究。因此，我们旨在评估过敏性鼻炎患儿的血清内皮坎和EDN水平，并探讨它们与疾病严重程度、症状评分和炎症指标的关联，以明确其潜在的临床效用。

材料与方法
研究设计与人群
这项前瞻性病例对照研究于2024年3月至2025年3月在吉雷松大学培训和研究医院的儿科门诊进行，该医院是一家三级护理中心。
过敏性鼻炎组包括18岁以下被诊断为过敏性鼻炎的患者。根据《过敏性鼻炎及其对哮喘的影响》（ARIA）指南[13]，患者被分为四类：轻度间歇性、中度至重度间歇性、轻度持续性以及中度至重度持续性。对照组由18岁以下、无过敏或慢性疾病史的健康志愿者组成。
两组排除标准包括年龄超过18岁、存在慢性疾病（如糖尿病、慢性肾病和心脏或神经系统疾病）、共病过敏性疾病（哮喘和特应性皮炎）以及常规使用任何全身性药物。排除共病是为了单独研究所调查生物标志物与过敏性鼻炎的关联。

样本量计算
样本量基于先前关于哮喘患儿嗜酸性粒细胞衍生神经毒素水平的研究[12]确定。假设效应量为0.80，1型错误率为5%，效力为80%，计算得出每组至少需要40名参与者。

数据收集与炎症指标
记录了社会人口统计学特征、特应性状态和家族过敏史。对于过敏性鼻炎组，根据ARIA标准对疾病严重程度进行分类，并使用鼻炎控制评估测试（RCAT）评估症状控制情况。实验室数据包括全血细胞计数（CBC）参数、AEC、总IgE水平和皮肤点刺试验（SPT）结果，均来自医疗记录。
全身性炎症指标根据入院时获得的CBC参数计算：
- 中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）：中性粒细胞计数/淋巴细胞计数
- 血小板与淋巴细胞比率（PLR）：血小板计数/淋巴细胞计数
- 淋巴细胞与单核细胞比率（LMR）：淋巴细胞计数/单核细胞计数
- 全身性免疫炎症指数（SII）：（血小板计数×中性粒细胞计数）/淋巴细胞计数
- 全身性炎症反应指数（SIRI）：（中性粒细胞计数×单核细胞计数）/淋巴细胞计数

样本收集与生化分析
为确保标准化条件并减少生物标志物水平的变异性，采血在空腹10-12小时后进行。采集后立即以1500×g离心15分钟。上清液分装到Eppendorf管中，置于-80°C保存直至分析。分析前将血清样本逐渐解冻至室温。使用市售的体外夹心ELISA试剂盒（Elabscience，美国德克萨斯州）根据制造商说明测定血清内皮坎和EDN浓度。血清EDN和内皮坎的吸光度测量使用微孔板读取器（AccuReader，Metertech Inc.，台湾台北）进行。

统计分析
数据分析使用SPSS 26.0版本（IBM公司，美国阿蒙克）进行。正态分布变量的描述性统计以均值±标准差（SD）表示，非正态分布变量以中位数（第25-75百分位数）表示，分类变量以频率（百分比）表示。数据分布的正态性使用Kolmogorov–Smirnov检验进行评估。过敏性鼻炎组和对照组之间血清内皮坎、EDN和炎症指标的差异使用独立样本t检验或Mann–Whitney U检验进行分析。定量变量之间的相关性使用Pearson或Spearman相关系数进行评估。为了解决血清生物标志物与全身性炎症指标（NLR、PLR、LMR、SII和SIRI）之间的多重比较问题，使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）程序调整p值，q值为0.05。通过接收者操作特征（ROC）曲线分析确定绝对嗜酸性粒细胞计数、内皮坎和EDN的诊断性能，p值<0.05被视为具有统计学意义。

结果
共纳入152名儿童：85名过敏性鼻炎患儿和67名健康对照组。过敏性鼻炎组的平均年龄为8.5±3.1岁（中位数7岁，范围4-17岁），对照组为9.7±3.7岁（中位数10岁，范围4-17岁，p>0.05）。在过敏性鼻炎患儿中，56%为首胎，84%为足月出生。母亲（31%）、父亲（22%）和兄弟姐妹（40%）有过敏家族史；家庭成员中过敏性鼻炎的患病率为母亲13%、父亲8.4%、兄弟姐妹15.9%。最常见的症状是鼻塞（91%），其次是打喷嚏（89%）、流鼻涕（86.7%）、鼻/腭部瘙痒（77%）和眼部分泌物（67.5%）。53%的过敏性鼻炎患儿有家庭被动吸烟暴露史。皮肤点刺试验显示多过敏原致敏是最常见的模式（44%），其中尘螨是单过敏原患者的最常见过敏原（10%）。

血清EDN、内皮坎和绝对嗜酸性粒细胞计数（AEC）在过敏性鼻炎组显著高于对照组（所有p<0.001；表1）。全身性炎症指标（NLR、PLR、LMR、SII、SIRI）无显著差异（表1）。

相关性分析显示，血清内皮坎和EDN与绝对嗜酸性粒细胞计数和总IgE水平显著相关（表2）。关于全身性炎症指标，尽管名义p值表明生物标志物与某些指标（PLR、LMR和SIRI）之间存在弱相关性，但经过Benjamini–Hochberg FDR校正后，只有内皮坎与LMR（r=-0.24，p=0.004）和EDN与LMR（r=-0.22，p=0.01）的关联仍具有统计学意义。与RCAT评分、被动吸烟暴露、过敏原致敏模式（单过敏原 vs. 多过敏原）或ARIA定义的疾病严重程度无显著相关性（表2）。

在ROC曲线分析中，内皮坎的AUC值为0.931（95% CI 0.893–0.971），在748.2 pg/mL的切点处敏感性为85.9%，特异性为86.7%；EDN的AUC值为0.929（95% CI 0.891–0.968），在50.77 ng/mL的切点处敏感性为89.4%，特异性为82.1%。两种生物标志物的AUC值均高于AEC（AUC为0.871，95% CI 0.816–0.927，在455细胞/μL的切点处敏感性为70.2%，特异性为93.3%，所有p<0.001）（图1，表3）。

图1
（该图像的替代文本可能是使用AI生成的。）

接收者操作特征（ROC）曲线显示了血清EDN、内皮坎和绝对嗜酸性粒细胞计数在过敏性鼻炎中的诊断性能。EDN的AUC为0.929（95% CI 0.891–0.968），内皮坎的AUC为0.931（95% CI 0.893–0.971）。在最佳切点值（EDN，50.77 ng/mL；内皮坎，748.2 ng/mL）处，敏感性和特异性分别为89.4%和85.9%和86.7%。绝对嗜酸性粒细胞计数的AUC为0.871（95% CI 0.816–0.927）；在455细胞/μL的切点处，敏感性和特异性分别为70.2%和93.3%。虚线表示随机区分（AUC=0.5）。所有AUC值均具有统计学意义（p<0.001）。

讨论
在这项前瞻性病例对照研究中，我们比较了过敏性鼻炎患儿和健康对照组之间的血清内皮坎和EDN水平，并探讨了它们与经典过敏炎症标志物的关联。主要发现如下：（i）过敏性鼻炎患儿的血清内皮坎、EDN和AEC显著升高；（ii）内皮坎和EDN之间具有强正相关，与总IgE和AEC具有中等到强相关；（iii）这两种生物标志物的诊断性能较高，在ROC分析中优于AEC。相比之下，这两种生物标志物与全身性炎症指标、RCAT评分或过敏性鼻炎严重程度无关。
过敏性鼻炎患儿的血清内皮坎水平显著升高，具有较高的区分能力（AUC 0.931）。这一发现表明，传统上认为局限于鼻黏膜的过敏性鼻炎炎症反应也可能涉及全身性内皮激活。尽管在多种炎症和过敏性疾病中已经报告了内皮素（endocan）水平的升高[4, 14,15,16,17,18]，但针对儿童过敏性鼻炎（AR）中内皮素的研究仍然较少。据我们所知，只有一项研究报道了患有AR的儿童鼻内内皮素水平升高[8]。因此，我们的结果提供了新的证据，支持血清内皮素作为儿童AR中内皮激活潜在系统生物标志物的可能性。然而，需要指出的是，内皮素并非疾病特异性指标，也可能在其他炎症性疾病中升高；因此，其解释应在适当的临床背景下进行。

同样，血清嗜酸性粒细胞趋化因子（EDN）水平也显著升高，并显示出较高的诊断准确性（AUC 0.929）。由于EDN反映了嗜酸性粒细胞的激活状态而不仅仅是数量，其升高表明AR中存在活跃的嗜酸性粒细胞脱颗粒现象。先前的研究表明，EDN与哮喘严重程度和过敏性疾病的发展有关[9, 11]。然而，据我们所知，还没有研究同时评估过儿童AR中的内皮素和EDN。我们的发现支持血清EDN作为儿童AR中嗜酸性粒细胞激活的可测量系统标志物的潜在用途。

内皮素与EDN之间的强正相关（r = 0.88）以及它们与总IgE和AEC的中等到强相关性尤其值得注意。这些结果表明，在儿童AR中，内皮激活和嗜酸性粒细胞炎症密切相关，可能代表了共同的炎症途径的组成部分。随着IgE介导的过敏反应和嗜酸性粒细胞募集的加剧，内皮细胞激活也可能增加，从而导致血清内皮素水平升高。这种解释与当前的病理生理学模型一致，这些模型认为AR不仅仅是一种局部鼻部疾病，还可能包括系统性的炎症和血管成分[1, 13]。

值得注意的是，在调整了多重比较后，内皮素和EDN与大多数系统炎症指标基本无关，仅与淋巴细胞计数（LMR）有弱相关性。这种与NLR或SII等一般标志物缺乏强关联的事实表明，内皮素和EDN不仅仅是全身性炎症的替代指标，而可能是AR中内皮-嗜酸性粒细胞轴的特异性指标。这些发现表明，这些生物标志物可能反映了潜在的慢性疾病过程，而不仅仅是急性症状波动。这一点还得到了与RCAT评分无关的结果的支持，意味着内皮素和EDN可能比日常症状控制更能敏感地反映疾病的存在。

此外，不同过敏原致敏模式或AR严重程度类别之间没有显著差异，这表明与儿童哮喘[7, 9]不同，这些生物标志物在分层AR严重程度方面的敏感性可能有限，尽管它们在区分患病儿童和健康个体方面表现良好。与ARIA严重程度无关的结果表明，一旦超过全身性过敏致敏的阈值，内皮素和EDN可能会达到“平台期”，这表明它们可能更多地作为诊断辅助工具，而不是用于严重程度分层的工具。同样，被动吸烟暴露没有显著影响也表明，这些生物标志物可能相对独立于环境烟草烟雾引起的外在炎症负担，尽管需要进一步研究剂量-反应关系。

我们研究中最具有临床意义的结果之一是内皮素和EDN作为儿童AR诊断评估中互补生物标志物的潜在用途。高AUC值和平衡的敏感性/特异性比率表明，这些标志物可能有助于区分AR患儿和健康对照组。尽管AEC也显示出良好的区分能力（AUC 0.871），但内皮素和EDN反映了嗜酸性粒细胞炎症和内皮激活的功能方面，使它们比传统的血液学参数更有价值。尽管如此，重要的是要强调这些生物标志物并不旨在替代指南推荐的诊断工具（如临床评估、皮肤点刺试验和特异性IgE测量），而是为了补充这些工具。

我们的发现通过支持内皮激活和嗜酸性粒细胞炎症在儿童AR中的同时参与，有助于理解AR的病理生理学。内皮素水平的升高表明内皮细胞在过敏炎症期间介导白细胞黏附和血管通透性变化中起积极作用，而EDN水平的升高则指向了涉及嗜酸性粒细胞介导的组织损伤以及对神经结构的潜在影响，这些可能有助于症状的产生。对这些机制的更深入理解可能为未来开发针对性治疗策略提供信息。

**优势与局限性**
我们的研究有几个优势。前瞻性病例对照设计增强了研究结果的可靠性。纳入年龄匹配的健康对照组最小化了年龄带来的潜在混淆。一个关键优势是在同一队列中同时评估内皮素和EDN，提供了探索内皮激活和嗜酸性粒细胞炎症之间相互作用的机会。此外，纳入新的系统炎症指标（SII、SIRI）并应用严格的多重比较统计调整（FDR校正）提高了分析的方法学质量。据我们所知，这是首次在儿童AR中同时研究这两种生物标志物的研究，为文献做出了新的贡献。

然而，也有一些局限性。单中心设计可能限制了我们的发现对其他地理和种族人群的普遍性。虽然我们的样本量在主要比较中统计上是足够的，但对于基于特定过敏原特征或合并症的亚组分析可能不够充分。此外，为了分离AR的影响，排除了伴有其他过敏性疾病（如哮喘和特应性皮炎）的儿童；然而，这可能会限制我们的发现在实际临床环境中的适用性，因为在这些情况下这些合并症很常见。

此外，生物标志物的测量是在一个时间点进行的，并未设计用于评估治疗反应或时间变化。连续测量将有助于更好地了解疾病加重期间和治疗后生物标志物水平的变化。还应注意的是，内皮素并非疾病特异性指标，可能在多种炎症性疾病中升高，这可能限制其作为独立生物标志物的特异性。

此外，尽管所有样本都在标准化条件下收集和处理，但无法完全排除与分析前和分析因素（如样本处理和ELISA方法）相关的潜在变异性。尽管存在这些局限性，我们的研究仍提供了关于内皮素和EDN与儿童AR中的经典过敏参数之间关联的宝贵见解。

未来的研究应集中在更大的多中心儿童队列中验证内皮素和EDN的水平，并探索它们与AR表型之间的关联。评估药物治疗或过敏原免疫治疗前后的连续测量对于评估其对治疗反应的预测价值至关重要。此外，还需要进行长期随访研究，以探讨这些生物标志物对疾病进程的预后影响及其在个性化管理策略中的潜在作用。

**结论**
总之，在这个队列中，与健康对照组相比，患有过敏性鼻炎的儿童血清内皮素和EDN水平显著升高。这些生物标志物与总IgE、AEC以及彼此之间存在强相关性，表明儿童AR中同时存在系统性内皮激活和嗜酸性粒细胞炎症。虽然观察到的高AUC值表明它们具有潜在的辅助诊断价值，但由于研究是单中心、横断面设计，这些发现应谨慎解释。需要更大规模的多中心前瞻性研究来确认这些发现，并在常规应用之前确定其临床效用。