LINC01420作为一种致癌长链非编码RNA（lncRNA）：在胆管癌中的表达特征、功能作用及其预后意义

《Irish Journal of Medical Science (1971 -)》：LINC01420 as a oncogenic lncRNA: Expression signatures, functional roles, and prognostic significance in cholangiocarcinoma

　　摘要
背景
胆管癌（CCA）是一种常见的恶性肿瘤，其生存率令人担忧。本研究旨在探讨长链非编码RNA LINC01420与CCA患者总体生存率之间的关系，并探索LINC01420在CCA进展中的生物学功能和机制。

方法
通过定量实时PCR检测LINC01420和miR-320a的水平。使用Kaplan-Meier生存曲线分析LINC01420表达与总体生存率之间的相关性。CCK-8和Transwell实验分别评估CCA细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过双荧光素酶报告基因实验研究LINC01420与miR-320a之间的相互作用。生物信息学分析预测miR-320a的靶基因及其相关功能和通路信息。

结果
CCA肿瘤组织和细胞中LINC01420的表达显著增加。LINC01420的过表达与较大的肿瘤体积、淋巴结转移和晚期TNM分期显著相关。LINC01420过表达的CCA患者预后较差。敲低LINC01420可抑制CCA细胞的增殖、迁移和侵袭，而这些效应可通过降低miR-320a来消除，miR-320a被确定为LINC01420在CCA中的靶基因。

结论
LINC01420作为miR-320的竞争内源RNA（ceRNA）在CCA细胞中起作用，从而抑制肿瘤进展。LINC01420/miR-320a轴可能为CCA的治疗提供新的生物标志物和靶点。

引言
胆管癌（CCA）是一种起源于胆管上皮细胞的异质性恶性肿瘤[1]。它可发生于肝内、肝门部和远端胆管[2]。由于其强烈的侵袭性和高淋巴结转移倾向，以及对放疗和化疗等辅助治疗的低敏感性，患者的总体治疗效果较差，生存时间显著缩短，预后通常较差[3, 4]。因此，迫切需要寻找新的策略来改善CCA的预后和治疗。

目前，越来越多的研究发现长链非编码RNA（lncRNAs）在肿瘤发展中起重要作用[5, 6, 7]。例如，7.5 kb长的lncRNA MALAT1在多种癌症中表达异常，是肺癌细胞转移表型的关键调控因子[8, 9]。Lujambio等人发现lncRNA T-UCR的异常表达会促进结直肠癌的进展[10]。多项研究还表明，HOTAIR的高表达可能是乳腺癌的潜在生物标志物[11, 12]。lncRNAs的差异表达与患者的预后密切相关，可能作为预测患者生存的潜在生物标志物[5, 13]。其中，lncRNA LINC01420在甲状腺癌和鼻咽癌中均高表达，并与患者的不良预后显著相关。Luo等人认为LINC01420的过表达具有作为TC的预后标志物和潜在治疗靶点的潜力[14]。Yang等人发现LINC01420高表达的NPC患者预后较差，且LINC01420调节NPC细胞的迁移和侵袭[15]。然而，LINC01420是否与CCA的预后相关及其在CCA中的生物学功能仍不清楚。

最近，lncRNAs通过与microRNAs（miRNAs）竞争性结合，作为竞争性内源RNA（ceRNAs）来调控关键肿瘤基因的表达[16, 17]。例如，Lian等人证实lncRNA AFAP1-AS1与miR-423-5p结合并激活Rho/Rac通路，促进鼻咽癌的转移[18]。Cui等人发现LINC01420与miR-149-5p形成靶向结合关系，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[19]。这表明LINC01420可能通过ceRNA机制在肿瘤中发挥致癌作用。基于生物信息学预测的结果，我们进一步发现LINC01420具有与miR-320的潜在靶结合位点。鉴于LINC01420在CCA中的功能和调控机制尚不明确，本研究旨在确认LINC01420在CCA进展中的生物学作用，并基于ceRNA理论深入探讨其与miR-320的相互作用。本研究的结果可能帮助研究人员更好地理解LINC01420的功能和机制，为CCA的预后和治疗提供新的生物标志物和靶点。

材料与方法
患者和组织收集
组织收集和分析的方案均符合伦理委员会的指导原则，并已获得伦理委员会的批准。在采样前，从患者或监护人处获得了签署的知情同意书。本研究从2019年至2023年间在南京医科大学附属南京鼓楼医院接受根治性切除的96名CCA患者中收集了肿瘤组织样本和相邻的非肿瘤组织样本。所有组织样本均经过组织病理学验证，并冷冻保存以供后续使用。接受过任何抗肿瘤治疗的患者被排除在研究之外。通过电话沟通或门诊随访收集所有患者的生存信息，用于进一步分析。

细胞培养和转染
从中国科学院上海分院购买了2种CCA细胞系（TFK-1和HUCCT1）和1种正常胆管上皮细胞系（H69）。所有细胞在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）中培养，添加10%胎牛血清（FBS，Invitrogen）、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素，并在37℃、5% CO2的饱和湿润环境中维持。

模拟阴性对照（mimic NC）、抑制剂NC、小干扰RNA NC（siRNA NC）、si-LINC01420、miR-320a模拟物和miR-320a抑制剂由GenePharma（中国上海）合成。载体序列如下：si-LINC01420：5’-CAUCUCAGGUCUCUUGGCUUUGCCA-3’；mimic NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’；miR-320a模拟物：5’-AAAAGCUGGGUUGAG-3’；抑制剂NC：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’；miR-320a抑制剂：5’-CUCAACCCAGCUUUU-3’。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国加州）按照制造商的方案将mimic NC、抑制剂NC、siRNA NC、si-LINC01420、miR-320a模拟物和miR-320a抑制剂转染到CCA细胞系TFK-1和HUCCT1中。转染48小时后评估转染效率。

RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）
使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）从组织样本和细胞中提取总RNA。按照制造商的指南，使用PrimeScript逆转录酶试剂盒（TaKaRa，日本滋贺）将RNA逆转录为单链cDNA。使用SYBR green I Master Mix试剂盒（Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）在7500实时聚合酶链反应系统（Applied Biosystems，美国）上检测LINC01420和miR-320的表达。GAPDH和U6分别作为LINC01420和miR-320的内源对照。相对表达数据使用2?ΔΔCt方法计算。

CCK-8实验
使用CCK-8实验评估TFK-1和HUCCT1细胞系的增殖能力。将细胞以1×10^3个细胞的密度接种到96孔板中，在37℃、5% CO2的湿润培养箱中培养。分别在0、24、48和72小时时向孔中加入10 μL CCK-8试剂，读取并记录450 nm处的OD（光密度）。

Transwell实验
使用Transwell实验评估TFK-1和HUCCT1细胞系的迁移和侵袭能力。细胞侵袭实验使用预先涂有Matrigel（Corning，美国纽约）的Transwell孔板，细胞迁移实验使用未涂Matrigel的Transwell孔板。上层孔板填充无血清培养基，下层孔板填充添加10% FBS的培养基作为趋化剂。将转染后的细胞以2×10^4个细胞的密度接种到上层孔板中。培养48小时后，对下层孔板中的细胞进行染色和计数。

双荧光素酶报告基因实验
使用lncBase Predicted v.2（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2%2Findex）[20]预测LINC01420和miR-320的结合位点。将突变型（MUT）LINC01420序列和含有miR-320a结合序列的野生型（WT）LINC01420序列克隆到pGL3载体（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）中。LINC01420-MUT和LINC01420-WT分别与miR-320a模拟物或mimic NC一起使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国加州）转染到TFK-1细胞中。48小时后，使用双荧光素酶报告基因系统（Promega）测量相对荧光素酶活性。

生物信息学分析
通过TargetScan、ENCORI和miRDB靶基因数据库预测miR-320的靶基因。使用在线工具STRING构建重叠靶基因的PPI网络图。使用Cytoscape软件可视化网络。通过GO和KEGG生物信息学数据库进行重叠靶基因的功能注释和通路富集分析。

统计分析
使用SPSS 22.0（IBM Corp.）和GraphPad Prism 7.0软件（GraphPad Software, Inc.）进行数据统计分析。所有测量数据均通过Shapiro-Wilk检验验证正态分布。符合正态分布的数据使用Student’s t检验（两组）或单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验（多组）进行统计分析。使用卡方检验检查LINC01420表达与CCA患者临床病理数据之间的关系。使用Kaplan-Meier曲线建立CCA患者的生存曲线，并使用log-rank检验比较CCA患者生存曲线的差异。使用皮尔逊相关系数确认LINC01420和miR-320在CCA患者中的关系。每个实验至少重复3次。P<0.05表示统计学上显著差异。

结果
LINC01420的过表达预测CCA患者的总体生存率较差
在公共平台GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）上，基于TCGA数据库的数据，提取了36例CCA组织和9例正常组织进行分析。结果显示CCA组织中的LINC01420表达显著高于正常组织（图1A，P<0.05）。qRT-PCR用于测量CCA组织和细胞系中的LINC01420表达水平。对纳入本研究的96名CCA患者组织的数据分析显示，CCA患者中的LINC01420表达显著高于正常组织（图1B，P<0.001），且晚期TNM分期（III-IV）患者的LINC01420表达显著高于早期TNM分期（I-II）患者（图1C，P<0.001）。Kaplan-Meier曲线表明高LINC01420表达与较差的总体生存预后相关（图1D，Log-rank P=0.004）。

图1
A. 使用GEPIA数据库搜索CCA中上调的LINC01420。B. CCA患者中LINC01420的表达水平显著高于正常组织。C. 晚期TNM分期（III-IV）患者的LINC01420表达显著高于早期TNM分期（I-II）患者。D. Kaplan-Meier曲线表明高LINC01420表达与较差的总体生存预后相关（Log-rank P=0.004）。（** P<0.01，*** P<0.001）

LINC01420与CCA患者临床病理特征的关联
如表1所示，LINC01420表达与肿瘤体积（P=0.021）、淋巴结转移（P=0.004）和TNM分期（P=0.001）显著相关。然而，LINC01420表达与年龄、性别和吸烟无关（所有P>0.05）。LINC01420表达与结肠癌（CCA）患者临床病理特征之间的关联分析结果表明，LINC01420可能参与了CCA的发展。表1显示了LINC01420与CCA患者临床病理特征之间的关联。LINC01420是CCA预后的独立预测因子。我们进行了单变量和多变量Cox回归分析，以更好地理解LINC01420在CCA患者中的预后意义（表2）。单变量分析结果显示，肿瘤大小（HR=0.231，95% CI：0.122–0.439，P<0.001）、淋巴结转移（HR=0.261，95% CI：0.134–0.509，P<0.001）、TNM分期（HR=0.292，95% CI：0.147–0.579，P<0.001）以及LINC01420表达（HR=0.072，95% CI：0.028–0.185，P<0.001）均与患者的总生存率显著相关。多变量Cox回归分析进一步证实，肿瘤大小（HR=0.443，95% CI：0.228–0.863，P=0.017）、淋巴结转移（HR=0.362，95% CI：0.182–0.719，P=0.004）、TNM分期（HR=0.404，95% CI：0.199–0.819，P=0.012）和LINC01420表达（HR=0.110，95% CI：0.041–0.294，P<0.001）是CCA患者的独立预后因素。

图2显示，CCA细胞系中的LINC01420表达水平高于正常细胞。如图2A所示，与正常H69细胞系相比，两种CCA细胞系TFK-1（P<0.001）和HUCCT1（P=0.0003）中的LINC01420表达显著升高（所有P<0.001）。转染实验结果显示，与转染siRNA NC相比，转染si-LINC01420后，TFK-1（图2B，P<0.001）和HUCCT1细胞系（图2C，P<0.001）中的LINC01420表达显著降低，这表明si-LINC01420显著抑制了LINC01420的表达。

LINC01420的敲低抑制了CCA细胞的增殖、迁移和侵袭能力。细胞增殖实验表明，与siRNA NC相比，si-LINC01420显著抑制了TFK-1（48小时：P<0.05，72小时：P<0.001）和HUCCT1细胞系（72小时：P<0.01）的增殖能力（图3A）。在TFK-1细胞和HUCCT1细胞中，与siRNA NC相比，si-LINC01420显著抑制了细胞的迁移能力（图3B，所有P<0.01）和侵袭能力（图3C，所有P<0.01）。此外，LINC01420的敲低显著促进了TFK-1细胞中miR-320a的表达（图4C，P=0.001）。LINC01420作为miR-320的ceRNA，其表达水平在CCA肿瘤组织中下调，与相邻正常组织相比（P<0.001），且miR-320a的表达与LINC01420的表达呈负相关（r=-0.535，P<0.001）。miR-320a抑制剂显著抑制了LINC01420敲低引起的TFK-1细胞生物功能的变化。

此外，本研究还调查了同时转染si-LINC01420和miR-320抑制剂对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。与仅转染抑制剂NC相比，共同转染si-LINC01420和miR-320抑制剂显著增强了细胞的增殖（P<0.01）、迁移（P<0.001）和侵袭（P<0.001）能力。然而，在同时沉默LINC01420和miR-320的情况下，这些能力得到了逆转。miR-320抑制剂显著增强了细胞的迁移能力（P<0.01）和侵袭能力（P<0.001）。进一步的研究表明，miR-320抑制剂显著增强了细胞的迁移和侵袭能力。江等人证明了miR-181b-5p通过靶向PARK2并调节PTEN/PI3K/AKT轴来促进细胞生长、迁移和侵袭[32]。此外，张等人发现miR-22-3p通过PTEN/PI3K/AKT轴抑制5-氟尿嘧啶耐药性，从而调控胆管癌细胞的增殖和迁移[33]。基于这些发现，我们推测miR-320a可能通过直接靶向和结合PTEN/PI3K/AKT轴来减缓胆管癌的进展，从而调节细胞的生物学功能。KEGG通路分析显示，这些基因在肿瘤相关信号通路中显著富集，如癌症信号通路中的转录失调、AMPK信号通路和癌症中的微小RNA通路（补充表S2）。这些通路在肿瘤发生和进展中起着关键作用。结合GO功能注释的结果（补充表S1），表明miR-320a可能通过调节这些枢纽基因参与这些通路，进而影响CCA细胞的生物学行为。尽管这项研究初步揭示了LINC01420作为ceRNA调节miR-320a并影响CCA进展的核心机制，但仍存在一些局限性。首先，该研究缺乏对LINC01420/miR-320a信号轴通过调节特定靶基因影响CCA细胞功能的详细分子机制的验证。在未来的研究中，我们将验证这些靶基因在该信号轴中的作用，以进一步改进对分子机制的研究。其次，我们使用了两种细胞系：HuCCT1（肝内胆管癌细胞系）和TFK-1（肝外胆管癌细胞系）。这两种细胞系无法全面涵盖肝内和肝外CCA的分子异质性，这在一定程度上限制了研究结论的普遍适用性。在后续研究中，我们将扩大细胞系的选择范围，包括具有不同分化程度和不同遗传背景的更多CCA细胞系，并同时使用临床样本来源的原代细胞进行验证，以提高研究结果的代表性和可靠性。

结论：总之，LINC01420在CCA肿瘤组织和细胞中的表达显著增加，高水平的LINC01420与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期以及较差的整体生存预后相关，可能作为CCA患者的预后生物标志物。此外，在CCA细胞中，敲低LINC01420通过作为miR-320a的ceRNA抑制CCA细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究的所有发现使研究人员对CCA的发病机制有了新的理解，并表明异常的LINC01420和miR-320可能成为CCA的新型生物标志物和治疗靶点。