兆赫兹声学微泡动态的计算光学条纹显微镜研究

《PhotoniX》：Computational optical streak microscopy of megahertz acoustic microbubble dynamics

　　摘要
实时动态成像微气泡对于理解它们的微观生物物理相互作用以及推进超声治疗至关重要。尽管时间分辨光学成像技术取得了进展，现有技术仍然在采集速度、空间分辨率、成本效益和系统复杂性之间面临着权衡。在这里，我们介绍了压缩光条纹暗场超高速显微镜（COSDUM），这是一种紧凑的成像平台，它结合了压缩感知、条纹成像、暗场显微镜和深度学习技术。COSDUM能够以压缩的方式记录宽视野内的兆赫兹声学微气泡动态，并使用基于卷积神经网络的算法重建空间分辨的动态图像。利用COSDUM，我们捕捉到了半径在0.5到2.1微米范围内的微气泡的稳定空化现象、非线性振荡、激发后的自由振荡和惯性坍塌。将COSDUM应用于全血中的微气泡-细胞相互作用，我们首次观察到了振动微气泡与血细胞之间的相互作用，包括微气泡驱动的血小板动态以及微气泡在相邻红细胞周围的高度不对称变形和构象变化。

引言
超声响应微气泡代表了靶向药物输送的一种有前景的策略。这些微气泡可以通过高空间精度被激活，以暂时增加生物屏障的通透性并增强局部药物释放，从而提高治疗效果并最小化全身副作用[1,2,3,4]。在这些微气泡中，由磷脂或聚合物壳稳定的封装全氟丙烷微气泡在临床前和临床环境中显示出强大的潜力[5,6,7]。在声学激发下，这些充满气体的微球会发生体积振荡，产生局部机械力，包括剪切应力[8, 9]、微流[10, 11]和瞬态孔隙形成[12, 13]。这些效应可以暂时破坏细胞膜或调节血管通透性，使治疗剂能够穿过其他限制性界面，如内皮[14, 15]和血脑屏障[16, 17]。然而，尽管取得了有希望的治疗结果，尤其是与兆赫兹（MHz）声学激发相关的物理机制尚未完全阐明[18, 19]。这一挑战部分源于微气泡-细胞相互作用的不可重复性以及它们发生在超短时间窗口内，通常在微秒级别，这超出了传统成像系统的帧率，从而限制了捕捉单个事件的完整时空动态的能力。
捕捉微气泡的快速非线性振荡需要能够实时（即在事件发生期间）解析超高速动态的成像模式。这项任务同时需要四种技术能力：亚微秒级的时间分辨率来跟踪由MHz范围超声驱动的振荡周期；微米级的空间分辨率来分辨单个微气泡；足够的序列深度来捕捉它们在多个周期内的完整时间演变；以及单次数据采集时间分辨图像，鉴于这些事件在生物学相关环境中的高度非重复性。在现有的方法中，先进的高分辨率显微镜系统通常具有大约100帧每秒（fps）的成像速度[20,21,22,23]，不足以捕捉亚微秒级的时间特征。商用高速相机提供紧凑的设计，可以达到高达1000万fps（Mfps）的全帧成像速度，并且序列深度超过100帧[24]，这使它们适用于时间分辨成像。然而，要实现这样的帧率需要昂贵和专门的传感器架构，例如原位图像存储CCD，这些传感器通常由于填充因子低而表现出有限的光学灵敏度[25]。为了进一步提高成像速度，通常使用像素合并或交错曝光等技术[26]，但这进一步降低了空间分辨率或增加了实现的复杂性。
为了摆脱对专门传感器的需求，超高速成像摄影[27,28,29,30,31,32]通过将时间门控帧分配给一个或多个二维（2D）探测器记录的不同空间区域提供了一种解决方案。该领域的一个里程碑式发展是Brandaris 128系统[29]，它使用一个快速旋转的镜子和128个CCD探测器的弧形阵列，以高达25 Mfps的帧率捕获128帧连续图像。Brandaris 128使得对微气泡振荡[33]、坍塌动态[34]以及与生物结构的相互作用[35]的详细研究成为可能。尽管消除了对超高速传感器的需求，但Brandaris 128依赖于机械复杂的硬件。操作上的挑战，例如采集过程中的热量产生限制了连续操作时间约为30秒，随后需要强制冷却，进一步降低了实验吞吐量。最后，该系统的大型尺寸（150厘米×150厘米×20厘米）和高成本使其难以在专门研究实验室之外广泛采用。
为了克服这些光学仪器的限制，我们提出了压缩光条纹暗场超高速显微镜（COSDUM），其具有0.52微米的空间分辨率、6 Mfps的成像速度和144帧的序列深度，使用现成的相机和光学元件。作为一种紧凑且经济的解决方案，COSDUM能够实时可视化MHz微气泡的空化动态，包括振荡、脱气和坍塌。这种成像模式进一步应用于捕捉由相邻微气泡驱动的血小板的微观运动以及微气泡在红细胞（RBC）周围的适应性膨胀。

结果
COSDUM系统和原理
COSDUM系统的示意图如图1a所示。一个589纳米的连续波激光器（CNI Lasers, MGL-F-589-200mW）作为光源，被引导到倒置显微镜（Olympus, IX73）中，为样品提供宽视野照明。封装的全氟丙烷微气泡由一个单元素超声换能器（Olympus, A303S）以1 MHz的频率激发。产生的微气泡动态通过一个60倍物镜（Olympus, LUCPANFL N, NA=0.7）成像，该物镜将光线通过管状透镜传输到显微镜输出端的中间图像平面。随后，光束由一个由两个焦距分别为30毫米和200毫米的透镜组成的4f成像系统（透镜1，Thorlabs, AC254-030-A-ML；透镜2，Thorlabs, AC254-200-A-ML）传递，提供6.67倍的放大倍率，从而使COSDUM系统的总放大倍率达到400倍。通过在4f成像系统的傅里叶平面上放置一个直径为100微米的高通空间滤波器（Thorlabs, R1D100P）来抑制低频成分（补充说明S1），从而增强微气泡振荡的图像对比度并增加空间稀疏性，这非常适合压缩感知。结果场景表示为\(\mathbf{F}\in {\mathbb{R}}^{{N}_{y}\times {N}_{x}\times {N}_{t}\)，其中\({N}_{x}\text{和}{N}_{y}\)代表两个空间维度的数据长度，\({N}_{t}\)代表时间维度的数据长度。
图1
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
压缩光条纹暗场超高速显微镜（COSDUM）的原理。a 系统示意图。CMOS，互补金属氧化物半导体；CNN，卷积神经网络。b CNN示意图。Conv：卷积；ReLU：修正线性单元。c 三个代表性的重建帧，显示了1 MHz激光脉冲列照射在50纳米直径的纳米颗粒上。d 基于横向强度轮廓的空间分辨率分析。两个黑色箭头之间的距离对应于半高全宽。e 横跨视野的平均时间强度轮廓。
然后，分光镜将光线以90/10（透射/反射）的比例分开。反射光由CMOS相机（FLIR, GS3-U3-41C6NIR-C）通过时空积分（表示为操作符\({\mathbf{T}}_{\text{tu}}\in {\mathbb{R}}^{{m}_{\text{tu}}\times n}\)，其中\({m}_{\text{tu}}={N}_{x}{N}_{y}\)和\(n={N}_{x}{N}_{y}{N}_{t}\）进行成像，得到时间未剪切的视图，其光学能量表示为\({\mathbf{g}}_{\text{tu}}\in {\mathbb{R}}^{{m}_{\text{tu}}\times 1}\)。透射组分在透射编码掩模（Fineline Imaging，50%透射率和22微米编码像素大小）上形成动态场景的图像，该掩模使用端到端方法设计（详细信息见补充说明S2和图S1），生成空间编码的动态场景。这个空间编码过程由操作符\(\mathbf{C}\in {\mathbb{R}}^{n\times n}\)表示。然后，这个图像由第二个4f成像系统传递，该系统由两个焦距为100毫米的透镜（透镜3和透镜4，Thorlabs, AC254-100-A-ML）组成，在傅里叶平面上放置了一个伽利略扫描仪（Thorlabs, GVS201）来引入时间剪切，表示为操作符\(\mathbf{S}\in {\mathbb{R}}^{({m}_{\text{ts}}{N}_{t})\times n}\)，其中\({m}_{\text{ts}}={N}_{y}\left[{N}_{x}+\left({N}_{t}-1\right)\right]\)。最后，空间编码和时间剪切的场景通过第二个CMOS相机（FLIR, GS3-U3-23S6M-C）进行时空积分（表示为操作符\({\mathbf{T}}_{\text{ts}}{\in {\mathbb{R}}}^{{m}_{\text{ts}}\times \left({m}_{\text{ts}}{N}_{t}\right)}），产生时间剪切的视图，其光学能量表示为\({\mathbf{g}}_{\text{ts}}{\in {\mathbb{R}}}^{{m}_{\text{ts}}\times 1}\)。
总体而言，COSDUM的前向模型表示为
$$\begin{array}{c}\mathbf{g}=\left[\begin{array}{c}{\mathbf{g}}_{\text{ts}}\\ {\mathbf{g}}_{\text{tu}}\end{array}\right]=\left[\begin{array}{c}{\mathbf{T}}_{\text{ts}}\mathbf{S}\mathbf{C}\\ {\mathbf{T}}_{\text{tu}}\end{array}\right]\mathbf{f}+\boldsymbol{\epsilon}.\end{array}$$
(1)
这里，\(\mathbf{f}\in {\mathbb{R}}^{n\times 1}\)是动态场景\(\mathbf{F}\)的离散向量化表示。\({\mathbf{g}}_{\text{ts}}\in {\mathbb{R}}^{{m}_{\text{ts}}\times 1}\)和\({\mathbf{g}}_{\text{tu}}\in {\mathbb{R}}^{{m}_{\text{tu}}\times 1}\)分别是时间剪切视图\({\mathbf{G}}_{\text{ts}}\in {\mathbb{R}}^{{N}_{y}\times \left[{N}_{x}+\left({N}_{t}-1\right)\right]}\)和时间未剪切视图\({\mathbf{G}}_{\text{tu}}\in {\mathbb{R}}^{{N}_{y}\times {N}_{x}}\)的向量化表示。\({\varvec{\boldsymbol{\epsilon}}}\in {\mathbb{R}}^{m\times 1}\)表示在数据采集过程中添加到快照中的噪声，其中\(m={m}_{\text{tu}}+{m}_{\text{ts}}\)。\({{\varvec{\Phi}}}_{\text{ts}}={\mathbf{T}}_{\text{ts}}\mathbf{S}\mathbf{C}\in {\mathbb{R}}^{{m}_{\text{ts}}\times n}\)是时间剪切视图的感觉矩阵。\(\boldsymbol{\Phi} \in {\mathbb{R}}^{m\times n}\)是COSDUM的感觉矩阵，由矩阵\(\boldsymbol{\Phi }_{\text{ts}}\)和\({\mathbf{\text{T}}}_{\text{tu}}\)的垂直连接组成。COSDUM的前向模型的详细信息在补充说明S3中有解释。
为了重建动态场景，采集的快照由基于卷积神经网络（CNN）的算法处理，该算法由两个级联模块组成（图1b）。第一个模块是一个深度展开网络，它通过将交替方向乘子法（ADMM）[36]的单次迭代映射到一组结构化的卷积和感觉操作[37, 38]上来结合COSDUM的前向模型。这些层共同近似逆模型并生成初始估计。第二个模块是一个U-Net [39]，具有三级编码器-解码器结构，它细化了中间重建，以提高空间和时间保真度。利用ADMM固有的“分割和优化”策略，这种设计实现了高内存效率，这对于学习重建动态场景的时空数据立方体（表示为\(\widetilde{\mathbf{F}}\in {\mathbb{R}}^{{N}_{y}\times {N}_{x}\times {N}_{t}}\)至关重要。在这方面，COSDUM的图像重建被表述为
$$\begin{array}{c}{\text{minimize}}_{\mathbf{f},\mathbf{z}}{\Vert \mathbf{g}-{\varvec{\Phi}}\mathbf{f}\Vert }_{2}^{2}+\psi \left(\mathbf{z}\right), ~~\text{subject to} ~~~\mathbf{z}=\mathbf{f}.\end{array}$$
(2)
这里，\(\psi \left(\cdot \right):{\mathbb{R}}^{n\times 1}\to \overline{\mathbb{R} }\)是一个正则化器。\(\mathbf{z}\in {\mathbb{R}}^{n\times 1}\)是一个辅助变量。
为了学习CNN的权重，损失函数\(\mathcal{H}\left(\cdot \right):{\mathbb{R}}^{{N}_{y}\times {N}_{x}\times {N}_{t}}\to {\mathbb{R}}^{+}\)被定义为
$$\begin{array}{c}\mathcal{H}\left(\mathbf{F},\widetilde{\mathbf{F}}\right)={l}_{1}\left(\mathbf{F},\widetilde{\mathbf{F}}\right)+{l}_{\text{SSIM}}\left(\mathbf{F},\widetilde{\mathbf{F}}\right).\end{array}$$
(3)
这里，\({l}_{1}(\cdot )\)是\({l}_{1}\)-范数。\({l}_{\text{SSIM}}\left(\cdot \right)=1-\text{SSIM}\left(\mathbf{F},\widetilde{\mathbf{F}}\right)\)表示结构相似性指数（SSIM）损失函数[40]，其中\(\text{SSIM}\left(\cdot \right)\)表示SSIM度量。检索到的动态场景数据立方体的序列深度为\({N}_{t}=144\)帧，每帧包含多达\({N}_{y}\times {N}_{x}=1024\times 1024\)像素。图像重建算法的详细解释在补充说明S4和方法中有提供。
COSDUM系统提供的视野（FOV）为14.85微米×14.85微米，这是基于相机像素大小5.8微米和总放大倍率400倍计算得出的。COSDUM的成像速度设置为6 Mfps，由伽利略扫描仪的扫描速率、选定的焦距和相机的像素大小共同决定（详见方法部分，补充说明S5和图S2）。

COSDUM系统性能的量化
为了实验验证COSDUM的空间和时间分辨率，我们使用自制的标称直径为50纳米的孤立纳米颗粒[41]进行了成像，这些颗粒由脉冲激光器（Spectra-Physics, VPFL-G-HE-30）以1 MHz的重复率和3纳秒的脉冲持续时间照明。由于这些纳米颗粒的亚衍射极限尺寸和纳秒级的照明时间，脉冲激光照射的纳米颗粒有效地充当了时空δ函数，使它们成为表征系统点扩散函数（PSFs）的理想探针，无论是在空间还是时间域。COSDUM在单次采集中记录了24个连续脉冲。重建的视频提供在Movie S1中，三个代表性帧显示在图1c中。图1d显示了选定纳米颗粒的横向强度轮廓，从中测量出的空间分辨率（定义为其空间强度轮廓的半高全宽（FWHM）为0.52微米，与理论估计一致。图1e绘制了整个视野内的帧平均信号强度。所得到的时间迹线显示了24个规律间隔的脉冲，每个脉冲之间的间隔为1微秒，这证实了COSDUM的稳定性和时间精度。每个脉冲的时间强度轮廓的平均半高宽（FWHM）为0.33微秒，量化了系统的时间分辨率。

我们使用COSDUM监测了超声作用下微气泡表现出的两种不同的空化状态：稳定的空化和非重复性的爆裂事件。前者以周期性振荡为特征，而后者则涉及微气泡的突然、不可逆的破坏，导致其崩溃。关于超声波激发与COSDUM图像采集及样品制备之间同步性的详细信息，请参见方法部分、补充说明S6以及图S3-S4。

作为第一个演示，我们使用频率为1 MHz的超声波换能器对一个静止半径为0.9微米的微气泡进行了超声处理，该换能器以0.3 MPa的压力发送了10个周期的脉冲。重建的电影和代表性帧显示在电影S2和图2a中，突出了膨胀和压缩之间的不对称性，以及周期间的变化。图2b量化了径向振荡，显示微气泡的最大半径约为1.8微米，最小半径约为0.7微米，表现出膨胀优先于压缩的趋势。值得注意的是，微气泡在10个周期的声脉冲后继续振荡，这与在弱阻尼介质中的激发后行为一致[42, 43]。关于微气泡半径估计过程的详细解释，请参见补充说明S7和图S5。

为了进一步表征微气泡的动力学特性，我们计算了壁速度\(v_{\text{w}}=dR/dt\)，其中\(R\)表示微气泡的瞬时半径。如图2b所示，结果突出了膨胀阶段的急剧加速。这一分析提供了对微气泡外壳所承受的机械应力的洞察。在超声处理序列结束时，微气泡的半径减少了约10％，表明有净体积损失和潜在的外壳破坏或气体扩散。这一解释得到了频域分析的支持，如图2c所示，功率谱在基频（即\(f_0=f\)）和二次谐波频率（即\(2f_0\)）处显示出强烈的能量贡献。图2d比较了微气泡在膨胀峰值和静止状态下的半径角分布。结果揭示了膨胀过程中的明显各向异性，这可能是由于不均匀的声学加载造成的。

为了定量评估COSDUM的监测能力，我们对17个静止半径介于0.5至2.1微米之间的超声处理微气泡进行了统计分析。图2e显示了膨胀比率\(r_e=R_{\text{max}}/R_0\)，随着\(R_0\)的增加而减小，表明较小的微气泡相对于其静止尺寸经历了更大的膨胀。这一趋势反映了亚微米级微气泡在超声激发下的增强可变形性和较低的惯性阻力。图2f显示了\(R_0\)与压缩比率\(r_c=R_0/R_{\text{min}}\)之间略有增加的趋势，表明较大的微气泡更不容易崩溃，可能是由于惯性稳定性或外壳刚度的增加。振荡的不对称性，通过\(r_a=(R_{\text{max}}-R_0)/(R_0-R_{\text{min})\)来量化（图2g），随着\(R_0\)的增加而显著减小，表明较小的微气泡表现出更明显的膨胀主导的振荡不对称性。这种不对称性是非线性声学行为的标志，并与周围介质中增强的流体运动和机械应力生成有关。最后，图2h显示了最大壁速度\(v_{mw}=\text{max}|v_{\text{w}}\)作为\(R_0\)的函数。虽然没有观察到强烈的依赖性，但存在轻微的上升趋势。这一结果表明，振荡速度不仅仅由微气泡的大小决定，还可能受到局部声学条件、阻尼效应以及与周围流体的机械相互作用的影响。

为了研究极端非线性行为的起始，我们将声压幅度增加到1 MPa，以驱动微气泡超出其稳定的振荡状态。重建的演变过程显示在电影S3和图3a中。径向振荡的量化（图3b）显示，在高激励下，微气泡在第五个振荡周期内经历了快速膨胀，随后发生崩溃。对其壁速度\(v_{\text{w}}\)的分析显示，在前5微秒内存在强烈的径向振荡，随后速度突然降为零。经历惯性崩溃的微气泡显示出远高于图2h中趋势线的峰值壁速度，进一步支持了过度的壁运动可能是外壳失效或气体逸出的预测器的观点。这一比较强调了壁速度作为区分稳定和崩溃微气泡的诊断参数的潜力。图3c显示了爆裂事件的功率谱，在基频（即\(f_0=f\)处有一个主导峰，以及之后的宽且不规则的分布。缺乏谐波结构和增加的次谐波内容与惯性空化和周期性振荡的丧失一致。

为了展示COSDUM在生物学相关环境中的可行性，我们研究了在全血悬浮液中的稳定振荡微气泡与附近血小板之间的相互作用（Charles River Laboratories, PB000F-2-KIT）。微气泡正在积极探索用于溶栓治疗，已经在临床前和临床研究中取得有希望的进展[44]。这里，微气泡用1 MHz的超声波脉冲进行了10个周期的超声处理，压力为1 MPa。重建结果显示在电影S4中，超高速序列中的选定帧（图4a）展示了微气泡半径的演变以及血小板随时间的相应运动。为了进一步突出这种相互作用，图4b展示了血小板周围区域的放大视图，在三个代表性的振荡周期内捕捉了其在微气泡最大膨胀和压缩时的位置。对微气泡半径随时间的定量分析（图4c）显示了持续的振荡行为，没有崩溃的迹象，证实了在整个观察窗口内稳定的空化状态。同时，沿\(x\)轴和\(y\)轴追踪的血小板轨迹（图4d和e）显示出周期性位移，在第三个周期后（即\(t_{\text{th}}=10.33\) μs）与微气泡的振荡同步。最大位移达到了大约0.6微米，占血小板估计直径2微米的相当大的一部分[45]。这种行为与振荡诱导的微流[46, 47]一致，后者产生了能够产生足够局部剪切力的稳定涡流，以驱动附近细胞成分的运动。实际上，众所周知，血小板的积累和激活高度依赖于剪切应力敏感的途径[48, 49]。在这里观察到的微秒时间尺度上，我们可以估计局部微气泡诱导的时间依赖性剪切应力\(\tau(t)\)为
$$\begin{array}{c}\tau(t)=\frac{\mu \omega [R(t)-R_0]}{\delta},\end{array}$$
（4）
其中\(\delta =\sqrt{{}^{2\mu }\!\left/ \!{}_{{\rho }_{\text{fd}}\omega }\right.\)是粘性边界层[14, 50]。\(\mu\)、\(\omega\)和\({\rho }_{\text{fd}}\)分别是周围流体的动态粘度（0.001 Pa·s）、振荡的角频率（\(2\pi f\)）和流体密度（1000 kg/m3）。通过将血小板运动建模为阻尼谐振子，并假设微气泡-血小板接触面积约为1 μm2（图4b），我们估计血小板的质量约为2.9 × 10?1? kg，与目前接受的间接值一致[51]（详见补充说明S8和图S6a）。这一观察为MHz超声处理下血小板剪切激活阈值提供了首次估算，对于超声介导的溶栓应用具有重要意义。这里，我们计算剪切脉冲\(I\)为
$$\begin{array}{c}I= \int \tau(t)dt,\end{array}$$
（5）
得到的剪切脉冲阈值为\(I_{\text{th}}=3.62 \times 10^{-2} Pa·s (0.362 dyn·s/cm2)，超过这个阈值后，血小板运动受到局部产生的微气泡剪切流的影响（详见补充说明S9和图S6b）。

我们接下来研究了在超声激发下位于红细胞（RBC）附近的微气泡。虽然之前的研究集中在微气泡与血管的相互作用，或者微气泡与非血液细胞的相互作用上，但单个微气泡与单个红细胞的直接和动态物理相互作用尚未得到充分记录。这里，微气泡用1 MHz的脉冲在1 MPa的峰值负压下进行了10个周期的超声处理。整个演变过程显示在电影S5中。超高速序列中的选定帧（图5a）显示了不对称的振荡，表明与红细胞的机械耦合改变了径向动力学。微气泡半径的角量化（图5b）显示了跨周期的持续各向异性，表明方向性膨胀可能受到相邻红细胞的限制。与孤立的微气泡相比，这种受限行为可能增强了局部剪切和流体运动。随时间变化的投影面积（图5c）显示出周期性振荡，与稳定的空化和非线性动力学一致。

我们开发了COSDUM，通过结合压缩感知、条纹成像、暗场显微镜和深度学习技术，推进了计算超高速光学显微镜的发展，以实现实时捕捉非线性微气泡动力学和微观尺度生物物理相互作用。系统特性表明，其成像速度为6 Mfps，空间分辨率为0.52微米，时间分辨率为0.33微秒，序列深度为144帧。使用1 MHz的超声波换能器时，COSDUM监测了静止半径介于0.5至2.1微米之间的封装全氟丙烷微气泡。记录的电影使得提取关键物理参数成为可能，包括径向振荡、壁速度和频谱。这些结果表明，微气泡的振荡动力学强烈依赖于初始半径。特别是，较小的微气泡表现出更高的膨胀比和更大的径向轮廓不对称性，这与增加的顺应性和较低的惯性阻力一致，使它们更容易受到声压变化的影响[52]。这些趋势强调了微气泡大小和机械特性在塑造其非线性声学行为中的关键作用。

COSDUM提供了一种新的微气泡评估方法。与Brandaris 128等庞大且机械复杂的平台不同，COSDUM是一个紧凑的系统（尺寸为45厘米×30厘米×11厘米），具有可调的序列深度，并可以无缝集成到标准显微镜配置中。与需要复杂辅助冷却且对大多数实验室来说价格昂贵的商用高速相机相比，COSDUM提供了一个完全集成的双相机架构，具有Mfps范围的成像能力和超过100万像素的图像格式，所有这些都在显著较低的成本下实现。与最近使用多路发光二极管照明[53]或声光频率扫描[54]的超高速成像进展相比，COSDUM在序列深度方面具有明显优势。其紧凑性结合了暗场成像技术，为弱散射微结构提供了增强的空间对比度。COSDUM的这些技术特性使得能够可视化不同大小微气泡的关键现象，包括稳定的空化、非线性径向振荡、激发后的自由振荡和惯性崩溃。COSDUM与已经或可能用于研究微气泡动力学的代表性方法的比较在补充说明S10和表S1中提供。COSDUM具有在高时空保真度下探测稳定和破坏性微气泡行为的能力，为微尺度流体-结构相互作用提供了新的机制见解。COSDUM捕捉到了依赖于相位的血小板位移。这一观察结果首次使得在MHz超声频率下估计血小板剪切激活阈值成为可能。估计的剪切脉冲阈值远低于之前报道的血小板激活和血栓形成阈值（例如，通过von Willebrand因子释放），这些阈值在10–1000 Pa·s的范围内[55]，尽管是在完全不同的时间尺度下获得的。这种独特的相互作用突显了COSDUM所实现的基本测量，并提供了关于微气泡介导的超声条件下血小板活性调节的生物物理洞察。COSDUM还捕捉到了微气泡在膨胀过程中包裹红细胞（RBC）的现象。这一新观察——即微气泡能够部分适应附近的红细胞，增加接触面积——可能对治疗递送（例如，针对血液疾病中的红细胞）和通过增加空间整合力来调节局部免疫反应（例如，Piezo1）具有意义，这反过来又可以影响红细胞的生理功能[56]。除了这一展示之外，COSDUM还代表了一个多功能且经济的超高速成像平台，在实时生物物理研究、微气泡介导的超声治疗和微气泡辅助药物递送方面有广泛的应用。其解析微气泡-细胞相互作用时空复杂性的能力将为研究超声诱导的血栓形成[57]、血小板激活[58]、溶栓[59]和微血管生物力学[60]提供机会。此外，COSDUM捕捉非重复性爆裂事件的能力将直接有助于研究与治疗性空化[61]和药物递送策略[62]相关的惯性空化起始和局部机械应力。

COSDUM的架构为性能提升提供了明确的机会。其成像速度与振镜扫描器的最大角扫描速度成正比。通过用共振振镜扫描器（例如，Thorlabs, GRS8-AG）[63]替换当前的振镜扫描器，成像速度可以提高到25 MHz甚至更高，与Brandaris型系统相当。这种改进将能够可视化更快的瞬态事件，如冲击波发射[64]和微气泡动力学中的高频声学现象[65]。COSDUM的空间分辨率主要由显微镜物镜的数值孔径（NA）决定。使用具有更大NA的显微镜物镜（例如，Olympus, UPLSAPO 60XW，NA=1.2）[66]可以进一步提高空间分辨率，可能实现微气泡振荡过程中亚细胞膜变形的可视化[67]。在这方面，COSDUM的最大视场（FOV）由显微镜物镜的光学场数和整个系统的放大倍数共同决定，这两者共同定义了样本平面中可访问的最大成像区域，最终受到探测器大小的限制。更大的传感器（例如，Teledyne, Adimec S-25A80-Gx）[68]将能够充分利用光学系统定义的最大FOV，同时影响可实现的帧数，这受到曝光时间、帧大小和传感器像素数量之间的相互作用的影响。这种配置将能够观察到更大空间尺度和更长时间窗口内的微气泡动力学，例如集体振荡行为[69]。同时，升级到更灵敏的相机可以进一步提高检测灵敏度。这些发展将使COSDUM成为探索极端生物力学过程、推进治疗超声技术以及揭示微观尺度新生物物理机制的下一代平台。

**材料与方法**

基于深度学习方法的图像重建

基线数据库是从“SumMe”[70]、“Need for Speed”[71]和“Sports Videos in the Wild”[72]数据库创建的。为了训练卷积神经网络（CNN）的权重，我们随机选择了1000个数据立方体，其尺寸为\({N}_{x}\times {N}_{y}=1024\times 1024\)像素和\({N}_{t}=144\)帧。除了基于视频的数据外，我们还通过使用Rayleigh-Plesset方程[73]模拟微气泡动力学来生成了一个物理驱动的训练数据集。该模型捕捉了球形微气泡对声压的非线性径向振荡，提供了物理上准确的时间剖面，提高了CNN重建真实动力学的能力。所有模拟都在PyTorch中实现，并在配备GeForce RTX 3090 GPU（24 GB RAM）的Intel Core i9 12900 K 3.2 GHz上进行训练，使用的是ADAM优化器。

**关键系统参数总结**

振镜扫描器位于由透镜3和透镜4组成的4f成像系统的傅里叶平面上（图1a），它将时间信息偏转到不同的空间位置。在数据采集过程中旋转时，它改变了对应于不同到达时间的空间频率分量的反射角度。然后透镜4执行傅里叶变换，将这些角度偏差转换为记录时间剪切视图的CMOS相机上的横向位移。这种空间位移将时间信息编码为空间偏移，从而实现时间剪切。成像速度由时间剪切视图的数据采集率决定。在这项工作中，重建的电影达到了[74, 75]的帧率。

$$\begin{array}{c}r= \frac{\gamma {V}_{\text{g}}{f}_{4}}{{t}_{\text{s}}d}.\end{array}$$ (6) 这里，\(\gamma =0.093 \text{rad}/\text{V}\)是一个常数，它将振镜扫描器的偏转角与输入电压波形关联起来，其中\({V}_{\text{g}}=15 \text{V}\)，考虑了波形的形状和动态。\({f}_{4}=100\) mm是透镜4的焦距，\({t}_{\text{s}}\)表示施加到振镜扫描器上的正弦电压波形的周期，\(d=5.8\) μm是CMOS传感器的像素大小。COSDUM的成像速度为\(r=\) 6 Mfps，这一数值通过图1c–e和补充说明S5中的脉冲序列传输实验得到了验证。COSDUM的序列深度可以通过以下公式计算：$$\begin{array}{c}{N}_{t}=r\cdot {t}_{\text{e}}.\end{array}$$ (7) 这里，\({t}_{\text{e}}\)是记录时间剪切视图的CMOS相机的曝光时间。在本文中介绍的所有实验中，曝光时间设置为\({t}_{\text{e}}=24\) μs，从而得到\({N}_{t}=\) 144帧。

**关于COSDUM的设备和同步细节**

一个任意函数发生器（Tektronix, AFG 31000）被手动触发以产生正弦信号和晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号。正弦信号通过一个55-dB功率放大器（Electronics & Innovation, A150 RF）放大后，传递给换能器（Olympus, A303S-SU 1 MHz/0.5"）进行声学激发。TTL信号通过T型连接器分离：一个分支触发功率放大器，另一个分支发送到一个延迟发生器（Stanford Research Systems, DG 645），该发生器输出三个同步的TTL脉冲。前两个脉冲分别触发两个CMOS相机的24-μs曝光。第三个脉冲触发第二个函数发生器（Rigol, DG 1022Z），配置为外部突发模式，生成一个250-Hz的正弦波形来控制振镜扫描器的旋转。

**样品制备细节**

微气泡实验在一个基于载玻片的样品室中进行，该样品室设计用于提供光学透明性和稳定的声学耦合。首先，将封装的全氟丙烷微气泡（Lantheus Medical Imaging, Definity?）加入含有蒸馏水的1.5-mL微量离心管中，并轻轻混合以确保均匀分散。然后，将少量稀释后的溶液滴在标准显微镜玻璃载玻片上。在液滴上轻轻放置一个薄盖玻片（VWR, No. 1, 24 × 60 mm），以将微气泡限制在一个浅层液体中，并在超声激发期间最小化整体流体的运动。一个定制的水箱放置在载玻片盖组件上，并填充脱气水以提供高效的声学耦合。超声换能器放置在一个充满水的柔性外壳中，该外壳与水箱中的水接触，并相对于成像平面以45°的角度定向，以实现斜向超声照射，同时保持光学访问。微气泡使用中心频率为1 MHz的10周期正弦脉冲进行超声照射，该脉冲由任意函数发生器生成并通过55-dB射频功率放大器放大后传递给换能器。关于超声同步的更多细节在补充说明S6中提供。样品平面上的峰值负声压在一个单独的水箱中使用针式水听器（Onda Corp., HGL-0200）进行校准。对于探测稳定微气泡振荡的实验，声压设置为大约0.3 MPa；对于非线性激发和惯性空化研究，声压增加到1 MPa。