SLC38A4促进库普弗细胞的吞噬作用，并抑制肿瘤在肝脏中的转移

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：SLC38A4 promotes Kupffer cell phagocytosis and suppresses tumor liver metastasis

　　摘要
转移是癌症相关死亡的主要原因。肝脏是多种恶性肿瘤具有高转移倾向的器官。驻肝巨噬细胞——库普弗细胞（Kupffer cells）是肝脏中主要的非实质细胞，它们通过吞噬扩散的肿瘤细胞来限制肝脏转移。然而，调节库普弗细胞吞噬肿瘤细胞的关键分子仍大部分未知。在这里，我们发现肿瘤细胞上表达的SLC38A4是一个在肿瘤肝脏转移过程中起关键抑制作用的分子。SLC38A4增强了库普弗细胞对各种肿瘤细胞的吞噬作用，从而减少了肝脏转移。机制上，SLC38A4下调了“不要吃我”分子CD24的表达，而CD24介导了SLC38A4在库普弗细胞吞噬和肿瘤肝脏转移中的作用。MYC直接结合到CD24的启动子上并激活CD24的转录。通过下调MYC，SLC38A4抑制了CD24的表达。肿瘤中SLC38A4表达水平低的患者具有更多的肝脏转移。这项研究表明，SLC38A4通过抑制CD24来促进库普弗细胞的吞噬作用并限制肿瘤肝脏转移。SLC38A4/MYC/CD24轴代表了库普弗细胞的一个新的吞噬检查点，并且可能是治疗肝脏转移的潜在靶点。

引言
转移导致了约90%的癌症相关死亡1。肝脏是多种恶性肿瘤常见的转移靶器官，包括肝细胞癌（HCC）、结直肠癌（CRC）、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、黑色素瘤和较少见的胃肠道间质肿瘤2,3。肝脏包含多种细胞成分，如肝细胞、肝窦内皮细胞、库普弗细胞、T细胞和自然杀伤细胞4。肝脏转移受到肿瘤细胞与肝细胞成分之间复杂相互作用的影响5,6,7,8。然而，介导这种相互作用和肿瘤肝脏转移的关键分子仍大部分未知9。作为驻肝巨噬细胞，库普弗细胞占所有肝细胞的约10%，是肝脏免疫细胞中最丰富的部分10。库普弗细胞在维持肝脏的正常生理状态和免疫监视中起着关键作用11,12,13,14,15,16,17。越来越多的研究表明，库普弗细胞通过吞噬扩散的肿瘤细胞在抵御肝脏转移中起着关键作用18,19,20。尽管某些库普弗细胞特异性分子（如ID3和Dectin-2（参考文献18,20）已被证实参与调节其吞噬活性，但控制吞噬或吞噬逃逸的肿瘤内在因素仍知之甚少19,21。与驻肝库普弗细胞不同，肿瘤内在信号（如促吞噬的“吃我”信号（例如SLAMF7、calreticulin和肿瘤相关抗原）和抗吞噬的“不要吃我”信号（例如CD47、PD-L1、CD24和β2-微球蛋白）调节骨髓来源的巨噬细胞吞噬的机制已被广泛研究22,23,24,25,26,27,28。已经开发出CD47阻断抗体来促进巨噬细胞对肿瘤细胞的清除29。同样，进一步揭示库普弗细胞吞噬肿瘤细胞逃逸的肿瘤内在机制有望为肝脏转移提供新的治疗策略30。

在我们的先前研究中，进行了体内基因组规模的CRISPR–Cas9敲除筛选，以确定参与肝脏转移的基因19。我们注意到靶向Slc38a4的gRNA在肝脏转移组织中富集。我们之前已经确定SLC38A4的下调是HCC中的一个癌胎分子事件31。SLC38A4在胎儿肝脏和HCC中下调，抑制了HCC肿瘤的生长，并且其低表达与HCC患者的不良预后相关31。另一项报告也表明，SLC38A4表达水平低预示着CRC患者的预后更差32。体内基因组规模的CRISPR–Cas9敲除数据表明，SLC38A4不仅参与HCC的生长，也可能参与肿瘤肝脏转移。在这里，通过功能获得和功能丧失实验，我们确认SLC38A4抑制了包括HCC、CRC和黑色素瘤细胞在内的各种肿瘤细胞的肝脏转移。SLC38A4通过增强库普弗细胞对肿瘤细胞的吞噬作用来发挥其抑制作用。机制探索揭示，SLC38A4下调了“不要吃我”分子CD24的表达，而CD24介导了SLC38A4在库普弗细胞吞噬和肿瘤肝脏转移中的作用。SLC38A4通过下调CD24向库普弗细胞传递“吃我”信号，从而抑制了肿瘤肝脏转移。

材料与方法
**细胞培养**
小鼠黑色素瘤细胞系B16F10（目录号SCSP-5233）、小鼠CRC细胞系MC38（目录号SCSP-5431）、小鼠HCC细胞系Hepa1-6（目录号SCSP-512）、人CRC细胞系SW620（目录号TCHu101）、人HCC细胞系SNU-398（目录号SCSP-5206）、人黑色素瘤细胞系A375（目录号TCHu155）和人胚胎肾细胞系293T（目录号SCSP-502）均来自中国上海的国家认证细胞库。B16F10、Hepa1-6、A375和293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco）中培养。MC38和SNU-398细胞在含有10% FBS的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养。SW620细胞在含有10% FBS的L-15培养基（Gibco）中培养。所有细胞在含有5% CO?的环境中于37°C下孵育。通过短串联重复序列分析验证了它们的真实性，并检测确认它们没有支原体污染。

**RNA提取和定量PCR（qPCR）**
使用Tritazol试剂（Invitrogen和Thermo Fisher Scientific）提取总RNA。随后，用HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒（目录号R323，Vazyme，南京，中国）对分离的RNA进行反转录。qPCR在QuantStudio实时PCR仪器（Applied Biosystems和Thermo Fisher Scientific）上进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（目录号Q711，Vazyme）。实验中使用的引物序列见补充表1。β-Actin用作内源性对照。相对表达水平通过2^-ΔΔCt方法确定。

**表达载体构建、短发夹RNA（shRNAs）合成、慢病毒生产和稳定细胞系构建**
为了构建表达小鼠SLC38A4的载体，通过PCR扩增小鼠Slc38a4编码序列（CDS），并使用NovoRec?一步PCR克隆试剂盒（Novoprotein，苏州，中国）将其亚克隆到pcDNA3.1/V5-His B载体的BamHI和EcoRI位点。为了生成小鼠SLC38A4表达慢病毒，将小鼠Slc38a4 CDS亚克隆到慢病毒表达载体LV17（EF-1a/Luciferase17&Puro）的NotI和NsiI位点（GenePharma），使用ClonExpress一步克隆试剂盒（Vazyme）。构建的LV17载体与pGag/Pol、pRev和pVSV-G一起使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）转染到293T细胞中。转染后72小时收集慢病毒，然后通过0.45 μm聚偏二氟乙烯过滤器过滤。人SLC38A4表达慢病毒的生产方法如前所述31。小鼠Myc和人MYC的CDS通过PCR扩增，并使用NovoRec一步PCR克隆试剂盒（Novoprotein）亚克隆到pCMV-N-Flag载体的EcoRI和XbaI位点（Beyotime，上海，中国），以构建小鼠或人MYC表达载体。Cd24a的CDS通过PCR扩增，并使用NovoRec一步PCR克隆试剂盒（Novoprotein，苏州，中国）亚克隆到pcDNA3.1/V5-His B载体的BamHI和EcoRI位点。用于PCR的引物序列见补充表1。

设计了两种独立的cDNA寡核苷酸来抑制小鼠SLC38A4的表达，并将其亚克隆到慢病毒shRNA载体LV16（U6/Luciferase17&Puro）（GenePharma，上海，中国）中，分别命名为小鼠sh-SLC38A4-1和sh-SLC38A4-2。设计了两种独立的cDNA寡核苷酸来抑制小鼠CD24的表达，并将其亚克隆到慢病毒shRNA载体LV3（H1/GFP&Puro）（GenePharma）中，命名为小鼠sh-CD24。使用无靶向的乱序cDNA寡核苷酸作为阴性对照（sh-NC）。为了生成小鼠SLC38A4或CD24敲低慢病毒，将sh-SLC38A4-1、sh-SLC38A4-2或sh-CD24与pGag/Pol、pRev和pVSV-G一起使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）转染到293T细胞中。转染后72小时收集慢病毒，然后通过0.45 μm聚偏二氟乙烯过滤器过滤。人SLC38A4敲低慢病毒的生产方法如前所述31。设计了两种独立的cDNA寡核苷酸来抑制人或小鼠MYC的表达，并将其亚克隆到SuperSilencing shRNA表达载体pGPU6/Neo（GenePharma，上海，中国）中，分别命名为sh-MYC-1和sh-MYC-2。小鼠sh-SLC38A4-1、sh-SLC38A4-2、sh-CD24、人或小鼠sh-MYC-1、sh-MYC-2和sh-NC的cDNA寡核苷酸序列见补充表1。

为了生成稳定过表达小鼠SLC38A4的细胞，在8 μg/ml polybrene（Sigma-Aldrich）存在下，将Hepa1-6、B16F10和MC38细胞感染小鼠SLC38A4表达慢病毒。为了生成稳定过表达人SLC38A4的细胞，使用8 μg/ml polybrene（Sigma-Aldrich）将SW620和SNU-398细胞感染人SLC38A4表达慢病毒。为了获得稳定敲低小鼠SLC38A4的细胞，在8 μg/ml polybrene（Sigma-Aldrich）存在下，将Hepa1-6细胞感染小鼠sh-SLC38A4-1、sh-SLC38A4-2和sh-NC慢病毒。同样，为了生成稳定敲低人SLC38A4的细胞，在8 μg/ml polybrene（Sigma-Aldrich）存在下，将SW620和A375细胞感染人sh-SLC38A4-1、sh-SLC38A4-2和sh-NC慢病毒。随后，这些感染细胞用2 μg/ml嘌呤霉素选择4周。

为了生成稳定过表达小鼠或人MYC的细胞，分别使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将小鼠或人MYC表达载体转染到Hepa1-6或SW620细胞中，然后用200 μg/ml新霉素选择4周。为了获得稳定敲低小鼠或人MYC的细胞，将sh-MYCs转染到Hepa1-6、B16F10、MC38、SW620和SNU-398细胞中，然后用200 μg/ml（对于Hepa1-6、MC38、SW620和SNU-398）或800 μg/ml（对于B16F10）新霉素选择4周。为了获得同时稳定敲低SLC38A4和CD24的细胞，在8 μg/ml polybrene（Sigma-Aldrich）存在下，将Hepa1-6细胞感染sh-CD24慢病毒，然后使用BD FACS Aria II进行荧光激活细胞分选（FACS）。为了生成同时稳定过表达SLC38A4和MYC的细胞，将MYC表达载体转染到B16F10和SW620细胞中，并使用Lipofectamine 3000（Invitrogen），然后用2 μg/ml嘌呤霉素和800 μg/ml（对于B16F10）或200 μg/ml（对于SW620）新霉素选择4周。

**Western blot**
使用含有蛋白酶抑制剂混合物（Calbiochem，Billerica，MA，美国）的RIPA缓冲液（Beyotime）从指定细胞中提取总蛋白。然后将细胞裂解液在4°C下以12,000 rpm离心5分钟。等量的蛋白通过SDS–PAGE分离并转移到硝酸纤维素滤膜上。膜在室温下用5%非脂干牛奶在PBS-T（Tween-20浓度为0.5/1000）中封闭1小时。然后，在4°C下用PBS-T与针对小鼠SLC38A4（20857-1-AP，1:500，Proteintech，芝加哥，IN，美国）、人SLC38A4（ab58785，1:1,000，Abcam，剑桥，英国）或β-actin（66009-1-Ig，1:10,000，Proteintech）的一抗孵育过夜。三次洗涤后，膜进一步用IRDye? 680RD山羊抗小鼠IgG二抗（926-68070，1:10,000，Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，美国）或IRDye 800CW山羊抗兔IgG二抗（926-32211，1:10,000，Li-Cor）孵育。使用Odyssey红外扫描仪（Li-Cor Biosciences）检测蛋白条带。β-Actin用作总蛋白的加载对照。

**动物研究**
从中国科学院上海实验动物中心（上海，中国）获得了6–8周大的无胸腺BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠。所有小鼠均维持在无病原体的环境中。为了检测体内的肝脏转移，将指定的细胞腹腔注射到小鼠体内。在指定时间处杀死小鼠，切除肝脏并进行苏木精-伊红（HE）染色。由不知道实验组分配的研究人员计数肝脏转移的数量或面积。小鼠实验按照动物福利法律、指南和政策进行，并获得了海军医科大学（上海，中国）伦理委员会的批准。

**库普弗细胞分离和体外吞噬分析**
库普弗细胞的分离方法如前所述19。简而言之，肝组织被灌注，然后分离成单细胞悬浮液。通过40×g离心3分钟将肝细胞从单细胞悬浮液中分离出来。随后，上清液在650×g下离心7分钟以获得非实质细胞（NPCs）。最后，使用磁激活细胞分离试剂（目录号130-110-443，Miltenyi Biotech）从NPCs中分离出F4/80+库普弗细胞。

总共0.25 × 10^5个库普弗细胞与1 × 10^5个标记有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的指示肿瘤细胞共培养，使用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。共培养在含有无血清Iscove改良Dulbecco培养基（Gibco）的 ultra-low-attachment 96孔U-bottom板（Corning）中进行。细胞在含有5%二氧化碳的湿润环境中于37°C下孵育2小时。共培养后，收集细胞并用F4/80抗体（目录号17-4801-82，eBioscience）进行染色。使用流式细胞术分析F4/80+细胞内的CFSE强度。吞噬效率计算为被Kupffer细胞吞噬的CFSE+肿瘤细胞的比例。在CD24中和实验中，在吞噬过程开始前30分钟及整个过程中，向SW620细胞中加入10 μg/ml的人类CD24阻断抗体（目录号311101，BioLegend）或同型对照（小鼠IgG2α，κ；目录号400201，BioLegend）。此外，共培养的Kupffer细胞还预先用小鼠Fc受体阻断溶液处理。

**体内吞噬作用分析**
体内吞噬作用检测按照先前描述的方法进行19。简要来说，用CFSE标记的肿瘤细胞被注射到指定的小鼠体内。12小时后，通过灌注将小鼠的肝脏分离成单细胞悬浮液。通过40×g离心3分钟从单细胞悬浮液中去除肝细胞。通过650×g离心7分钟从上清液中分离出NPCs。对存活的NPCs（对7-AAD呈阴性；目录号559925，BD Biosciences或对Zombie R718 Fixable Viability Dye呈阴性；目录号423115，BioLegend）进行流式细胞术染色，以检测Kupffer细胞对CFSE阳性肿瘤细胞的吞噬作用（这些Kupffer细胞被鉴定为CD45+CD11bintF4/80+）。这是使用针对CD45.2（目录号109807，BioLegend）、CD11b（目录号101215，BioLegend）和F4/80（目录号123115，BioLegend）的抗体来实现的。

**流式细胞术**
流式细胞术分析使用Attune NxT流式细胞仪和Attune NxT软件版本5.2（Thermo Fisher Scientific）进行。样品使用针对人类CD24（目录号311105，BioLegend）、小鼠CD24（目录号138503，BioLegend）、小鼠PD-L1（目录号124307，BioLegend）、人类PD-L1（目录号329705，BioLegend）、小鼠CD47（目录号127513，BioLegend）或人类CD47（目录号323123，BioLegend）的抗体进行检测。从流式细胞术获得的数据使用FlowJo版本10.8.0进行处理和分析。为了确保结果的客观性，研究人员在流式细胞术过程中对样品身份不知情。

**荧光素酶报告基因检测**
将小鼠Cd24a（-800 bp至+100 bp）和人类CD24（-1,242 bp至-241 bp）的启动子区域克隆到pGL3基本载体（目录号212936，Addgene）的XhoI和HindIII位点上，该载体设计用于表达萤火虫荧光素酶。所得构建体分别命名为pGL3-Cd24a promoter和pGL3-CD24 promoter。通过删除-321 bp至-312 bp的序列构建了小鼠Cd24a启动子突变体，通过删除-1,173 bp至-1,164 bp的序列构建了人类CD24启动子突变体。实验中使用的引物序列见补充表1。pGL3载体、SLC38A4或MYC表达载体以及表达Renilla荧光素酶的pRL-TK载体（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）共转染到293T细胞中。转染48小时后，根据制造商的方案使用Dual-Luciferase? Reporter Assay System（Promega）测量荧光素酶活性。相对萤火虫荧光素酶活性以Renilla荧光素酶活性为标准进行归一化。

**核酸酶切割和释放（CUT&RUN）检测**
使用指定的细胞进行CUT&RUN检测。该检测使用了Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit（目录号HD101，Vazyme）和针对MYC的一抗（目录号13987，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）。通过qPCR确定人类CD24和小鼠Cd24a启动子的富集情况。使用的引物序列见补充表1。

**组织样本**
从上海长征医院和东方肝胆外科医院（中国上海）的患者处收集了人类HCC、原发性CRC和CRC肝转移组织，所有患者均签署了知情同意书。本研究获得了海军医科大学伦理委员会的批准（编号NMU-20231008）。

**免疫组化检测**
免疫组化（IHC）染色按照先前描述的方法进行，使用针对SLC38A4（ab58785，1:40，Abcam）、CD24（10600-1-AP，Proteintech，1:600）的一抗处理人类临床样本，或针对CD24（ab199140，1:100，Abcam）处理小鼠肝转移组织，或针对MYC（ab32072，1:50，Abcam）处理样本33。切片使用Zeiss Axiophot显微镜（Carl Zeiss，德国奥伯科亨）拍摄。

**统计分析**
所有统计分析均使用GraphPad Prism软件（版本10.0）进行。对于图例中指定的比较，进行了Student’s t检验、单因素方差分析后跟Dunnett的多重比较检验、Mann–Whitney检验后跟Dunn的多重比较检验、双因素方差分析后跟Tukey的多重比较检验以及Spearman相关性分析。统计显著性定义为P < 0.05。

**结果**
**SLC38A4抑制多种肿瘤细胞的肝转移**
为了评估SLC38A4在肝转移中的作用，我们在小鼠HCC Hepa1-6细胞中稳定过表达SLC38A4（图1a）。通过腹腔注射肿瘤细胞建立肝转移模型。过表达SLC38A4的Hepa1-6细胞在具有免疫能力的C57BL/6小鼠（图1b）和缺乏T细胞免疫的Foxn1nu裸鼠（图1c）中形成的肝转移较少。我们进一步在Hepa1-6细胞中敲低SLC38A4（图1d）。SLC38A4缺陷的Hepa1-6细胞在C57BL/6小鼠中形成的肝转移更多（图1e）。为了评估SLC38A4的促转移作用是否特定于HCC，我们还在小鼠CRC MC38细胞中过表达SLC38A4（图1f）。过表达SLC38A4的MC38细胞在C57BL/6和裸鼠中形成的肝转移也较少（图1g,h）。同样，小鼠黑色素瘤B16F10细胞中过表达SLC38A4也抑制了C57BL/6和裸鼠中的肝转移（图1i–k）。我们进一步评估了SLC38A4在人类肿瘤细胞中的作用。过表达SLC38A4的人类HCC SNU-398细胞在裸鼠中形成的肝转移较少（补充图1a,b）。同样，过表达SLC38A4的人类CRC SW620细胞在裸鼠中形成的肝转移也较少（补充图1c,d）。相反，SLC38A4敲低的SW620细胞在裸鼠中形成的肝转移更多（补充图1e,f）。SLC38A4敲低的人类黑色素瘤A375细胞在裸鼠中也表现出更多的肝转移（补充图1g,h）。这些结果共同表明SLC38A4抑制了多种肿瘤类型的肝转移。

**图1：SLC38A4抑制肿瘤的肝转移。**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**
a 通过Western blot测量SLC38A4稳定过表达或对照的Hepa1-6细胞中的SLC38A4蛋白水平。
b 代表性地显示了在腹腔注射1×10^7个标记的Hepa1-6细胞后第14天从C57BL/6小鼠中分离出的肝组织的苏木精-伊红（HE）染色图像，以及肿瘤替代区域。比例尺，200 μm。
c 代表性地显示了在腹腔注射1×10^7个标记的Hepa1-6细胞后第14天从裸鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肿瘤替代区域。比例尺，200 μm。
d 通过Western blot测量SLC38A4稳定敲低或对照的Hepa1-6细胞中的SLC38A4蛋白水平。
e 代表性地显示了在腹腔注射1×10^7个标记的Hepa1-6细胞后第14天从C57BL/6小鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肿瘤替代区域。比例尺，200 μm。
f 通过Western blot测量SLC38A4稳定过表达或对照的MC38细胞中的SLC38A4蛋白水平。
g 代表性地显示了在腹腔注射1×10^6个标记的MC38细胞后第8天从C57BL/6小鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肿瘤替代区域。比例尺，100 μm。
h 代表性地显示了在腹腔注射1×10^6个标记的MC38细胞后第8天从裸鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肿瘤替代区域。比例尺，100 μm。
i 通过Western blot测量SLC38A4稳定过表达或对照的B16F10细胞中的SLC38A4蛋白水平。
j 代表性地显示了在腹腔注射1×10^6个标记的B16F10细胞后第13天从C57BL/6小鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肝转移数量。比例尺，200 μm。
k 代表性地显示了在腹腔注射1×10^6个标记的B16F10细胞后第9天从裸鼠中分离出的肝组织的HE染色图像，以及肝转移数量。比例尺，200 μm。结果以每组n=6（b、c和e部分）或n=8（g、h、j和k部分）小鼠的平均值±标准差显示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，通过Mann–Whitney检验（b、c、g、h、j和k部分）或Kruskal–Wallis检验后跟Dunn的多重比较检验（e部分）得出。MC小鼠结肠，NC阴性对照，SLC溶质载体。

**SLC38A4以依赖Kupffer细胞的方式抑制肝转移**
我们进一步研究了SLC38A4抑制肝转移的机制。生物发光成像显示，SLC38A4过表达细胞在腹腔注射后12小时就显著减少了肝转移（补充图2a）。此时，大多数肿瘤细胞仍停留在肝窦内，而Kupffer细胞正在积极吞噬这些肿瘤细胞。为了确定SLC38A4的抗转移效应是否依赖于Kupffer细胞，我们通过腹腔注射clodronate脂质体耗尽了C57BL/6小鼠中的Kupffer细胞。Kupffer细胞的耗尽显著增强了肿瘤的肝转移（补充图2b,c）。此外，在Kupffer细胞耗尽的小鼠中，SLC38A4的肝转移抑制效应几乎消失（补充图2b,c）。这些发现表明Kupffer细胞是SLC38A4抑制肝转移作用的关键介质。

**SLC38A4增强Kupffer细胞对多种肿瘤细胞的吞噬作用**
先前的研究已经记录了Kupffer细胞主要通过吞噬扩散的肿瘤细胞来防御肝转移18,34。因此，我们进一步研究了SLC38A4是否调节Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。将CFSE标记的肿瘤细胞与Kupffer细胞共培养2小时，并根据F4/80+ Kupffer细胞中的CFSE强度通过流式细胞术量化吞噬作用。结果显示，过表达SLC38A4的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的程度增加（图2a），而SLC38A4敲低的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的程度减少（图2b）。在MC38和B16F10细胞中过表达SLC38A4也显著增强了这些细胞被Kupffer细胞的吞噬作用（图2c,d）。我们进一步评估了SLC38A4对人类肿瘤细胞被Kupffer细胞吞噬的作用。在人类肿瘤细胞中过表达SLC38A4增强了这些细胞被Kupffer细胞的吞噬作用（补充图3a,b），而在人类肿瘤细胞中敲低SLC38A4则减少了这些细胞被Kupffer细胞的吞噬作用（补充图3c,d）。

**图2：SLC38A4促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**
a 通过流式细胞术测量过表达SLC38A4或对照的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞。
b 通过流式细胞术测量过表达SLC38A4或对照的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞。
c 通过流式细胞术测量过表达SLC38A4或对照的MC38细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞。
d 通过流式细胞术测量过表达SLC38A4或对照的B16F10细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞。
e 在腹腔注射后12小时，通过流式细胞术评估过表达SLC38A4或对照的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞的体内吞噬作用。
f 在腹腔注射后12小时，通过流式细胞术评估过表达SLC38A4或对照的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞的体内吞噬作用。
g 在腹腔注射后12小时，通过流式细胞术评估过表达SLC38A4或对照的MC38细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞的体内吞噬作用。
h 在腹腔注射后12小时，通过流式细胞术评估过表达SLC38A4或对照的B16F10细胞被Kupffer细胞吞噬的CFSE标记细胞的体内吞噬作用。
结果以n=3个独立实验（a–d部分）或n=5只小鼠（e–h部分）的平均值±标准差显示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，通过Student’s t检验（a、c和d部分）进行单因素方差分析后跟Dunnett的多重比较检验（b部分），Mann–Whitney检验（e、g和h部分）或Kruskal–Wallis检验后跟Dunn的多重比较检验（f部分）。APC异藻蓝蛋白，CFSE羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，MC小鼠结肠，NC阴性对照，SLC溶质载体。

**接下来我们研究了SLC38A4对Kupffer细胞吞噬作用的影响。**
在腹腔注射CFSE标记的肿瘤细胞12小时后，使用流式细胞术检测体内吞噬作用。结果显示，过表达SLC38A4的Hepa1-6细胞在体内被Kupffer细胞吞噬的效率高于对照Hepa1-6细胞（图2e），而SLC38A4敲低的Hepa1-6细胞在体内被Kupffer细胞吞噬的效率降低（图2f）。在MC38和B16F10细胞中过表达SLC38A4也显著增强了这些肿瘤细胞在体内的吞噬作用（图2g,h）。一致地，SLC38A4在人类肿瘤细胞中的过表达增强了体内Kupffer细胞介导的吞噬作用（补充图3e,f），而在人类肿瘤细胞中SLC38A4的敲低则抑制了体内Kupffer细胞介导的吞噬作用（补充图3g,h）。这些结果共同表明SLC38A4增强了Kupffer细胞对各种肿瘤细胞的吞噬作用。SLC38A4还下调了“不要吃我”分子CD24的表达。

接下来，我们研究了SLC38A4增强Kupffer细胞吞噬肿瘤细胞机制。首先，我们检测了SLC38A4对经典“不要吃我”分子CD47、CD24和PD-L1表达的潜在影响。流式细胞术显示，SLC38A4过表达的Hepa1-6细胞中CD24蛋白水平降低（图3a），而SLC38A4敲低的Hepa1-6细胞中CD24蛋白水平升高（图3b）。SLC38A4在MC38和B16F10细胞中的过表达也显著降低了CD24蛋白水平（图3c,d）。SLC38A4的过表达或敲低都没有改变CD47蛋白水平（补充图4a–c）。同样，PD-L1蛋白水平也没有受到SLC38A4过表达或敲低的影响（补充图4d–f）。我们进一步通过qPCR检测了Cd47、CD24a和Cd274（编码PD-L1）的mRNA表达水平。结果显示，SLC38A4过表达的Hepa1-6细胞中Cd24a mRNA水平降低（图3e），而SLC38A4敲低的Hepa1-6细胞中Cd24a mRNA水平升高（图3f）。SLC38A4在MC38和B16F10细胞中的过表达也显著降低了Cd24a mRNA水平（图3g,h）。SLC38A4的过表达或敲低都没有改变Cd47或Cd274 mRNA水平（补充图4g–j）。我们进一步评估了SLC38A4对人类细胞中CD24表达的影响。流式细胞术显示，SLC38A4在人类肿瘤细胞中的过表达降低了CD24蛋白水平（补充图5a,b），而SLC38A4在人类肿瘤细胞中的敲低提高了CD24蛋白水平（补充图5c,d）。qPCR检测显示，SLC38A4在人类肿瘤细胞中的过表达降低了CD24 mRNA水平（补充图5e,f），而SLC38A4在人类细胞中的敲低提高了CD24 mRNA水平（补充图5g,h）。总体而言，这些数据表明SLC38A4在转录水平上下调了CD24的表达。

图3：SLC38A4下调CD24表达。

SLC38A4通过下调CD24来增强Kupffer细胞的吞噬作用并抑制肝脏转移。为了研究CD24是否在功能上介导了SLC38A4对Kupffer细胞吞噬作用和肝脏转移的影响，我们在SLC38A4缺陷型和对照型Hepa1-6细胞中沉默了CD24的表达（图4a）。体外吞噬实验显示，CD24的沉默消除了SLC38A4敲低导致的Hepa1-6细胞被Kupffer细胞吞噬的抑制作用（图4b）。体内肝脏转移实验显示，CD24的沉默显著消除了SLC38A4敲低导致的肝脏转移增加（图4c）。此外，我们在SLC38A4过表达型和对照型B16F10细胞中异位过表达了CD24（图4d）。体外吞噬实验显示，CD24的过表达消除了SLC38A4过表达导致的B16F10细胞被Kupffer细胞吞噬的增强作用（图4e）。体内肝脏转移实验显示，CD24的过表达显著消除了SLC38A4过表达导致的肝脏转移抑制作用（图4f）。为了进一步验证CD24作为关键介质的作用，我们用CD24中和抗体处理SLC38A4过表达型和对照型SW620细胞，这增强了Kupffer细胞对SW620细胞的吞噬作用（补充图6a），并消除了SLC38A4过表达型和对照型细胞之间的吞噬差异（补充图6a）。同样，CD24的阻断消除了SLC38A4敲低细胞中观察到的吞噬减少（补充图6b）。这些遗传和药理学干预证实了CD24是SLC38A4促进Kupffer细胞吞噬作用和抑制肝脏转移的下游介质。

图4：SLC38A4通过下调CD24来增强Kupffer细胞的吞噬作用并抑制肝脏转移。

SLC38A4通过下调MYC来转录抑制CD24的表达。接下来，我们研究了SLC38A4降低CD24表达的机制。上述结果表明，SLC38A4同时降低了CD24的mRNA和蛋白水平，这表明SLC38A4在转录水平上抑制了CD24的表达。我们之前的研究表明，SLC38A4降低了转录因子MYC31的表达。有趣的是，在线计算机工具JASPAR预测了小鼠Cd24a和人类CD24启动子中存在两个保守的MYC结合位点（补充图7a,b）。MYC的过表达显著增加了Hepa1-6细胞中Cd24a/CD24的RNA和蛋白水平（图5a,b）。相反，MYC的敲低降低了Hepa1-6细胞中Cd24a/CD24的RNA和蛋白水平（图5c,d）。MYC的敲低也降低了MC38和B16F10细胞中Cd24a/CD24的RNA和蛋白水平（图5e–h）。同样，MYC的敲低也显著降低了人类SNU-398细胞中Cd24/CD24的RNA和蛋白水平（补充图7c,d）。MYC的过表达显著增加了人类SW620细胞中Cd24/CD24的RNA和蛋白水平（补充图7e,f）。同样，MYC的敲低降低了SW620和A375细胞中Cd24/CD24的RNA和蛋白水平（补充图7g–j）。这些数据表明MYC上调了CD24的表达。

图5：SLC38A4和MYC抑制Cd24a的转录。

为了将SLC38A4-MYC信号通路与CD24的转录调控联系起来，我们使用荧光报告基因实验进行了启动子分析。我们将小鼠Cd24a或人类CD24启动子克隆到荧光报告基因中（图5i和补充图7k）。双荧光报告基因实验显示，MYC的过表达增加了小鼠Cd24a启动子的活性，而SLC38A4的过表达抑制了小鼠Cd24a启动子的活性（图5j,k）。同样，MYC的过表达增加了人类CD24启动子的活性，而SLC38A4的过表达降低了人类CD24启动子的活性（补充图7l,m）。SLC38A4在Hepa1-6细胞中的过表达降低了Cd24a启动子的活性（图5l），而SLC38A4在Hepa1-6细胞中的敲低提高了Cd24a启动子的活性（图5m）。同样，SLC38A4在MC38和B16F10细胞中的过表达也降低了Cd24a启动子的活性（图5n,o）。SLC38A4在人类肿瘤细胞中的过表达降低了人类CD24启动子的活性（补充图7n,o），而SLC38A4的敲低提高了人类CD24启动子的活性（补充图7p,q）。使用MYC特异性抗体进行的CUT&RUN实验显示，SLC38A4在Hepa1-6细胞中的过表达降低了MYC与Cd24a启动子中?312位点的结合，但未影响?504位点（图5p）。SLC38A4在Hepa1-6细胞中的敲低增加了MYC与Cd24a启动子中?312位点的结合，但未影响?504位点（图5q）。同样，SLC38A4在B16F10和MC38细胞中的过表达也降低了MYC与Cd24a启动子中?312位点的结合，但未影响?504位点（图5r,s）。在人类细胞中，CUT&RUN实验显示SLC38A4的过表达降低了MYC与Cd24启动子中?1173位点的结合，但未影响?864位点（补充图7r,s）。SLC38A4的敲低增加了MYC与Cd24启动子中?1173位点的结合，但未影响?864位点（补充图7t,u）。我们进一步突变了小鼠Cd24a启动子中的?312位点（补充图8a）。双荧光报告基因实验显示，SLC38A4的过表达或敲低均未调节突变后的Cd24a启动子的活性（补充图8b–e）。这些数据表明，Cd24a启动子中的?312位点对SLC38A4/MYC在Cd24a转录中的作用至关重要。此外，我们还突变了人类CD24启动子中的?1173位点（补充图8f）。双荧光素酶报告基因检测显示，该-1173位点的突变消除了SLC38A4在调节CD24启动子活性中的作用（补充图8g–j）。这些数据表明，CD24启动子的-1173位点对于SLC38A4/MYC在CD24转录中的作用至关重要。接下来，我们评估了MYC是否是SLC38A4调节CD24和吞噬作用的关键中介因子。qPCR和流式细胞术检测结果显示，在SLC38A4敲低后的Hepa1-6细胞中，MYC的缺失消除了SLC38A4敲低对小鼠Cd24a/CD24的RNA和蛋白质水平的影响（图6a,b）。MYC的过表达逆转了SLC38A4对小鼠Cd24a/CD24的RNA和蛋白质水平的抑制作用（图6c,d）。在人类肿瘤细胞中，MYC的过表达也逆转了SLC38A4对人类CD24/CD24的RNA和蛋白质水平的抑制作用（图6e,f）。此外，MYC的过表达还逆转了SLC38A4促进吞噬作用的效果（图6g）。同样，在SLC38A4敲低后的人类肿瘤细胞中，MYC的缺失也消除了SLC38A4敲低对人类CD24/CD24的RNA和蛋白质水平的影响（图6h,i）。这些结果表明，MYC是SLC38A4调节CD24表达所必需的分子开关。

图6：SLC38A4通过MYC抑制CD24表达。

为了进一步验证SLC38A4/MYC/CD24的调控轴，我们使用免疫组化（IHC）检测了由不同小鼠和人类肿瘤细胞形成的肝转移组织中的SLC38A4、MYC和CD24的表达情况（见图1和补充图1）。由SLC38A4过表达的Hepa1-6细胞形成的肝转移组织表现出SLC38A4表达增加，而MYC和CD24表达减少，这种模式在C57BL/6小鼠和裸鼠中均一致观察到（补充图9a–f）。相反，由SLC38A4敲低的Hepa1-6细胞形成的肝转移组织表现出SLC38A4表达减少，而MYC和CD24表达增加（补充图9g–i）。由SLC38A4过表达的MC38细胞形成的肝转移组织在C57BL/6小鼠和裸鼠中也表现出SLC38A4表达增加，同时MYC和CD24表达减少（补充图9j–l）。由SLC38A4过表达的B16F10细胞形成的肝转移组织同样表现出SLC38A4表达增加，同时MYC和CD24表达减少（补充图10d–i）。由SLC38A4敲低的SW620细胞形成的肝转移组织也表现出SLC38A4表达减少，同时MYC和CD24表达增加（补充图10j–l）。总体而言，这些数据表明SLC38A4通过MYC抑制CD24/Cd24的转录。

SLC38A4与人类肝转移呈负相关

为了分析SLC38A4/MYC/CD24调控轴的临床相关性，我们使用IHC检测了70个肝癌（HCC）组织中的SLC38A4、MYC和CD24表达情况。其中30个组织有肝微转移（MM），40个组织没有。IHC结果显示，有肝微转移的HCC组织中的SLC38A4表达显著低于没有肝微转移的组织（图7a）。相反，有肝微转移的HCC组织中的MYC和CD24表达高于没有肝微转移的组织（图7b,c）。此外，SLC38A4表达与MYC和CD24表达呈负相关，而MYC表达与CD24表达在70个HCC组织中呈正相关（图7d–f）。癌症基因组图谱计划（Cancer Genome Atlas Program）数据分析证实，SLC38A4的RNA水平与MYC和CD24的RNA水平呈负相关，而MYC和CD24的RNA水平在HCC组织中呈正相关（补充图11a–c）。同样，GEO数据库35的分析也显示，SLC38A4的RNA水平与MYC和CD24的RNA水平呈负相关，而MYC和CD24的RNA水平在转移性HCC组织中呈正相关（补充图11d–f）。

讨论

巨噬细胞在转移中的作用受到各种组织微环境之间和内部差异的掩盖。库普弗细胞（Kupffer cells）是肝脏中的常驻细胞，在对抗多种微生物和肿瘤细胞的先天免疫防御中起着关键作用。在本研究中，我们发现SLC38A4可以诱导库普弗细胞吞噬各种肿瘤细胞，包括CRC、HCC和黑色素瘤细胞，从而抑制肿瘤的肝转移（图7m）。我们之前的研究表明，SLC38A4通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路来减少MYC的表达。在本研究中，我们发现MYC是CD24的转录激活因子。MYC结合到CD24/Cd24a的启动子区域并激活其转录。通过减少MYC的表达，SLC38A4抑制了CD24/Cd24a的转录，导致肿瘤细胞中CD24/Cd24a的mRNA和蛋白质水平下降。先前的研究已经确定肿瘤细胞上表达的CD24是巨噬细胞的“不要吃我”信号。在这里，我们进一步证明肿瘤细胞上表达的CD24也对库普弗细胞具有“不要吃我”的信号作用。通过抑制CD24的表达，SLC38A4促进了库普弗细胞在体内和体外的吞噬作用。SLC38A4没有调节肿瘤细胞上表达的其他吞噬信号，如CD47和PD-L1。敲除CD24/Cd24a或阻断CD24会消除SLC38A4在库普弗细胞吞噬中的作用，这表明CD24是SLC38A4在库普弗细胞吞噬作用中的关键中介因子。

体内肝转移实验显示，SLC38A4的过表达显著抑制了各种肿瘤细胞的肝转移，而SLC38A4的敲低则促进了肿瘤细胞的肝转移。我们之前的研究发现SLC38A4可以抑制HCC细胞的增殖。为了排除细胞增殖对肝转移的潜在影响，我们使用生物发光成像技术在脾内注射后12小时就检测了肝转移，此时细胞增殖对细胞数量没有显著影响。生物发光成像结果显示，SLC38A4在脾内注射后12小时就显著抑制了肝转移。这些数据表明，除了细胞增殖外，还有其他因素参与了SLC38A4在肝转移中的作用。考虑到SLC38A4在具有免疫能力的C57BL/6小鼠和缺乏T细胞的裸鼠中都能抑制肝转移，因此SLC38A4在肝转移中的作用不依赖于T细胞。库普弗细胞位于肝窦旁，在肿瘤细胞到达肝脏后不久就吞噬这些细胞。因此，我们评估了SLC38A4在肝转移中的抑制作用是否依赖于库普弗细胞。我们的结果显示，去除库普弗细胞显著促进了肝转移。此外，去除库普弗细胞大大消除了SLC38A4在肝转移中的作用。这些数据表明，SLC38A4诱导的库普弗细胞吞噬作用介导了SLC38A4在肿瘤肝转移中的抑制作用。

针对重新激活先天免疫细胞（尤其是巨噬细胞）的靶向免疫调节显示出显著的潜力，可以补充适应性免疫疗法。然而，在实体瘤的情况下，目前缺乏有效且安全的促进巨噬细胞吞噬作用的治疗药物。本研究表明，SLC38A4/MYC/CD24轴可能是通过增强库普弗细胞吞噬作用来治疗肝转移的潜在靶点。

总之，我们的研究表明，SLC38A4通过增强库普弗细胞对肿瘤细胞的吞噬作用来抑制肿瘤的肝转移。CD24被证实是库普弗细胞的促吞噬信号，而不仅仅是巨噬细胞的。MYC通过结合到CD24启动子直接激活CD24的转录。SLC38A4通过下调MYC的表达来抑制CD24的表达。SLC38A4通过降低肿瘤细胞中的CD24表达来促进库普弗细胞的吞噬作用并抑制肝转移。SLC38A4/MYC/CD24调控轴代表了治疗肝转移的潜在靶点。