铁过载通过IRP1–SCAP轴重新编程脂质代谢，在类成纤维细胞滑膜细胞中加剧类风湿性关节炎的骨破坏

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Iron overload reprogramming lipid metabolism through the IRP1–SCAP axis in fibroblast-like synoviocytes aggravates bone destruction in rheumatoid arthritis

　　摘要
类风湿性关节炎（RA）是全球致残的主要原因之一。尽管在RA患者中观察到关节病变中铁的积累，但其对残疾结果的具体贡献仍不清楚。在这里，我们采用了一种全面的多组学方法来阐明铁过载在RA中的影响及其潜在机制。首先，对RA队列的临床放射学研究显示，滑液中亚铁水平的升高与关节损伤程度呈正相关。铁螯合剂DFO的给药显著减轻了K/BxN血清转移诱导的关节炎小鼠模型中的骨破坏。在细胞功能方面，我们利用人源化滑膜炎模型识别出过量铁诱导的成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）的侵袭性迁移和侵入。从机制上讲，转录组学和代谢组学的多组学整合表明，FLSs在铁暴露下的反应中脂质合成途径富集。脂质转录因子SREBP1在RA-FLSs中表达特别高，其基因敲除或药物抑制在体外和体内均显著减轻了铁过载的病理效应。在分子水平上，铁调节蛋白IRP1通过从mRNA 5′非翻译区解离来增强SREBP1适配蛋白SCAP的翻译。这一过程促进了SREBP1的切割和激活，驱动了参与脂肪酸和胆固醇生物合成的基因的上调。我们的发现阐明了IRP1–SCAP轴作为FLSs中脂质代谢重编程的关键调节因子，突显了其作为通过调节“铁-脂质”相互作用治疗RA的潜在靶点。

引言
滑膜增生和绒毛形成是类风湿性关节炎（RA）的标志性病理特征。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是滑膜组织中的主要间充质细胞，表现出类似肿瘤的特性，包括抵抗凋亡、不受控制的增殖、慢性炎症以及增强的迁移和侵袭能力。这些侵袭性行为驱动了滑膜增生和随后的骨侵蚀，产生了高能量需求，这些需求由糖酵解、线粒体氧化磷酸化、脂质生成和氨基酸合成等活跃的代谢过程支持。因此，阐明并针对FLSs中的代谢失调可能为打破RA中的炎症和破坏性级联反应开辟一条有希望的治疗途径。

滑膜细胞在RA的不良微环境中受到多种刺激而进入病理激活状态。其中，异常的铁水平引起了相当大的关注。铁作为细胞功能所必需的微量元素，在神经系统、心血管系统、血液系统和免疫系统的发育中起着关键作用。然而，铁稳态的破坏与多种病理状况有关，包括缺血-再灌注损伤、退行性疾病和代谢紊乱，这主要是由于过量铁引起的过氧化物损伤和促炎效应。我们之前的研究揭示了在关节中铁过载后M1样和M2样巨噬细胞亚群中不同的铁死亡结果，加剧了RA中的局部免疫紊乱。然而，过量关节铁对FLSs的具体影响，特别是其在RA中的滑膜增殖和骨破坏中的作用，仍有待确定。了解铁浸染的FLSs是否参与这些病理过程以及铁如何影响RA-FLSs的代谢特性需要进一步的研究。

在本研究中，我们利用K/BxN血清转移诱导的关节炎（STIA）和人源化滑膜炎小鼠模型探讨了铁过载对RA发病机制中FLSs的影响。我们的发现表明，升高的亚铁通过激活SREBP1介导的新脂质生成促进了RA-FLSs的增生和侵袭。从机制上讲，我们首次发现铁调节蛋白IRP1与固醇调节元件结合蛋白（SREBP）切割激活蛋白（SCAP）mRNA的5′非翻译区（5′ UTR）结合，SCAP是SREBP1切割、转运和激活的关键适配蛋白。在铁充足条件下，IRP1从SCAP mRNA上解离，增强其翻译，从而激活SREBP1。这一过程在转录水平上上调了参与脂肪酸和胆固醇生物合成的下游基因，为RA-FLSs的侵袭能力提供了能量。这些发现突显了IRP1–SCAP相互作用作为连接细胞外铁过载与FLSs细胞内代谢重编程的关键信号通路，这种“铁-脂质”相互作用代表了RA的一种有希望的治疗策略。图像分析是使用NIH ImageJ软件进行的。细胞活力、迁移和侵袭实验：细胞活力通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）（Dojindo，CK04）根据制造商的说明进行测定。为了评估FLS的迁移，使用了具有8微米孔径膜的Transwell系统（BD Falcon）。简而言之，1×10^4个FLS悬浮在无血清的DMEM中接种到上层室中，而含有10% FBS的DMEM则放置在下层室中作为化学趋化剂。24小时培养后，穿透滤膜的细胞用4%的甲醛固定，并用0.1%的结晶紫染色。对于细胞侵袭实验，将Matrigel基质（Corning，356234）用无血清的DMEM稀释后预涂在Transwell膜上，然后通过膜的FLS用结晶紫染色，随后进行拍照和定量。

流式细胞术分析：使用Fixable Viability Dye eFluor 780（eBioscience，65-0865-14）根据制造商的指南评估FLS中的细胞死亡情况。细胞周期进展使用Cell Cycle Analysis Kit（ESScience，ES-CC001）根据制造商的方案进行分析。数据采集使用流式细胞仪进行，结果的分析使用FlowJo软件完成。

蛋白质阵列：使用Proteome Profiler Mouse Array Kit（R&D system，ARY015）评估STIA小鼠关节中的生物标志物。爪组织的蛋白质用RIPA裂解缓冲液（Sigma，R0278）提取，然后用蛋白质阵列进行分析。每个目标蛋白质的表达水平使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行量化，并根据阵列上的相应参考点进行标准化。

炎症细胞因子的测量：通过离心（15,000g，15分钟）收集STIA小鼠的血清。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（DAKEWE，1217202、1210122和1210602）根据制造商的说明量化血清样本中的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

脂质物质检测：使用商业的游离脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）和总胆固醇定量试剂盒根据制造商的方案（Njjcbio，A042-2-1、A110-1-1、A111-1-1）测量FLS和SF中的脂质浓度。使用荧光染料Filipin III（Cayman，70440）在用4%甲醛固定后检测FLS中的胆固醇。细胞中性脂质含量使用Bodipy 493/503染色（GlpBio，GC42959）进行可视化。

批量RNA-seq和scRNA-seq分析：对三名独立RA患者的FLS进行了全转录组测序。简而言之，从用500 μM FeSO4或磷酸盐缓冲液（PBS）处理2×10^5个FLS中分离总RNA，然后使用Illumina测序仪由Novogene进行RNA测序（RNA-seq）。原始读数使用Hisat2软件与人类参考基因组（GRCh38；hg38）对齐。差异表达分析使用R中的DESeq2包（版本4.3.2）进行。P值<0.05且|log2(倍数变化)|>0.25的基因被认为是差异表达基因（DEGs）。使用ggplot2包绘制显示DEGs的火山图。使用clusterProfiler包分析上调DEGs的基因组本体和信号通路，并使用Dotplot功能进行可视化。对于特定基因，使用webtool clustervis（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/）绘制热图。使用webtool Enrichr（https://maayanlab.cloud/Enrichr/）通过查询TRRUST数据库预测Fe2+上调基因的转录因子。

RA滑膜细胞的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集使用R包Seurat（版本4.1.1）根据教程进行进一步分析。使用Dotplot功能可视化SREBP1和SREBP2在滑膜细胞中的表达，并使用clusterProfiler包基于MSigDB数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）进行基因集富集分析。

液相色谱-质谱分析：用预冷的80%甲醇和0.1%甲酸剧烈摇动提取RA-FLS的代谢物。每个样本的等体积代谢物提取物被合并作为质量控制样本。使用Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific）与Orbitrap Q Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行代谢物的相对定量。在正离子和负离子模式下进行非目标代谢物分析，然后通过保留时间和质荷比（m/z）与参考数据库进行比较进行代谢物鉴定和量化。最终代谢组数据集是在使用空白样本矩阵进行背景离子去除和数据标准化后获得的。

基因敲低和过表达：将小干扰RNA（siRNAs）转染到FLS中：1.5×10^5个FLS接种在六孔板中并培养至70%汇合。24小时培养期后，使用jetPRIME试剂（Polyplus-transfection，101000046）根据制造商的方案转染siRNAs。针对铁调节蛋白1（IRP1）和铁调节蛋白2（IRP2）mRNA的三种不同siRNAs的序列在补充表6中呈现。

构建了SREBP1-shRNA慢病毒，并与慢病毒转移载体LV-3（pGLVH1/GFP+Puro）一起包装，由GenePharma制备。设计了三种shRNA，其中两种有效敲低了SREBP1的表达，其序列在补充表6中详细说明。

RIP实验：使用Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit（Millipore，17-700）进行RNA免疫沉淀（RIP）实验。简而言之，将1×10^7个RA-FLS在含有蛋白酶和RNase抑制剂的缓冲液中裂解以防止降解。细胞裂解物与结合了IRP1抗体的protein A/G磁珠在4°C下过夜孵育，以捕获RNA-蛋白质复合物。免疫沉淀后，洗涤磁珠以去除未结合的蛋白质和RNA，然后提取相关的RNA，通过逆转录qPCR进行反转录和定量。用于逆转录qPCR的引物序列在补充表5中详细说明。

RNA pulldown实验：使用商业RNA Pulldown Kit（BersinBio，Bes5102）根据制造商的方案进行RNA pulldown实验。将生物素化的RNA探针与磁珠孵育以实现有效结合。然后将此复合物与细胞蛋白裂解物在25°C下温和旋转2小时。洗涤五次后，洗脱结合的蛋白质并通过Western blot进行分析。本研究中使用的生物素化探针特异性针对SCAP mRNA的5′ UTR，序列为5′-GGG CAC CCG GCG GCC AGG AGA GAG AGG GGC GCC ACG CAC CGG ACT GCG GGC CGA GAG CGC GCA CGC GCT CCG CCC CTG CTG CCG CCC CCG CCG CCG CCG CAG CTT GGG AGG TGC TGC CAC CAC AGG TAC CTG CAC ATG TTG TTC TTT GTC AGT GCT GTC AAG TGT GTG CCA GGG TGA TCC ATG GTC ACT TTC CGG GAT GGC AGC AAG GTG ACT TCG GCT GAG G-3′，阴性对照（NC）LacZ探针的序列为5′-TGG CCG TCG TTT TAC AAC GTC GTG ACT GGG AAA ACC CTG GCG TTA CCC AAC TTA ATC GCC TTG CAG CAC ATC CCC CTT TCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG CAG CTT GGG AGG TGC TGC CAC ATG GTC ACT TTC CGG GAT GGC AGC AAG GTG ACT TCG GCT GAG G-3′。这些探针由BersinBio合成，用于富集与SCAP 5′ UTR特异性相互作用的蛋白质。

FISH–IF：在玻璃载玻片上培养的RA-FLS上使用BersinBio的RNA FISH试剂盒根据制造商的指南进行FISH荧光原位杂交（FISH）。细胞用4%的甲醛在室温下固定30分钟，然后用0.5%的Triton X-100渗透，然后通过一系列梯度乙醇洗涤脱水。在4°C的预杂交缓冲液中预杂交30分钟后，将载玻片与含有6-羧基荧光素（FAM）标记的探针（序列5′-GAC GTC TGG TTC TCA GGT AGC TTA GGG GCA TCA GGT GGG AAG ATG GAG AAG GCA GGG TCC GGG TGG CTG GGG GGC AGC ATG CCA CTA GGC ACG GGC ATG GGA GCC AGG GCT CCC TCA CTT GCT GGG TGT TCC GTC ACC TGG GCA GCG AGG TAG TTG CGC AGC CCT GCT GGG TCT GTG TAT ACC AGG ATG CTC GCT CTG ATG CCG CAT AG-3′）杂交5分钟，然后在37°C下过夜孵育。杂交后的洗涤依次在4×盐水柠檬酸（SSC）、2× SSC和1× SSC在42°C下进行。使用兔抗IRP1一级抗体（Proteintech，12406-1-AP）和Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG二级抗体（Invitrogen，A31572，稀释1:2000）进行免疫荧光（IF）。用DAPI复染以可视化细胞核后，使用共聚焦激光扫描显微镜成像。

分子对接预测：使用AlphaFold3进行分子对接预测。首先，蛋白质和RNA序列通过Input Feature Embedder编码为结构特征，捕获氨基酸和核苷酸的基本特征。然后构建成对表示以定义蛋白质和核酸之间的相互作用，随后通过条件网络进一步细化。识别蛋白质内的RNA结合基序和mRNA的互补区域，分析可能的相互作用位点。进行分子对接模拟以评估RNA结合位点、氢键和空间互补性，结果使用PyMOL可视化。

EMSA：为了测试IRP1与SCAP 5′ UTR的结合活性，使用RNA EMSA试剂盒（Bes5107，Bersinbio）根据制造商的说明进行电泳迁移率改变实验（EMSA）。对于EMSA，探针（序列5′-CUUUGUCAGUGCUGUCAAGUGUGUGCC-3′）在95°C下加热3分钟，然后缓慢冷却至室温，退火形成茎环结构，然后在25°C下与10 μg的HIS-IRP1孵育30分钟。使用冷竞争探针（特定竞争探针序列5′-CUUUGUCAGUGCUGUCAAGUGUGUGCC-3′；突变竞争探针序列5′-CUUUGUCACGUGUCAAGUGUGCC-3′）以50倍浓度确认结合特异性。样品使用6%的天然聚丙烯酰胺凝胶分离，然后转移到尼龙膜上并通过UV交联。转移的探针用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素检测。

伦理：人类标本研究得到了中山大学第三附属医院医学伦理委员会的批准（RG2023-016）。所有参与者都根据赫尔辛基宣言的原则签署了知情同意书。所有动物实验均按照广东省实验动物监测研究所（IACUC2019022）批准的相关指南和规定进行。

统计：数据以平均值±标准差（s.d.）表示，并使用GraphPad Prism软件（版本9.0）进行分析。对于两组之间的统计比较，使用Student’s t检验。当比较三个或更多组时，使用单因素或双因素方差分析（ANOVA），不进行任何匹配或配对。为了考虑多重比较，应用Turkey’s检验来调整结果。使用Pearson相关系数确定数据集对之间的相关性。图中的误差条表示标准差。P值<0.05被认为在所有分析中具有统计学意义。

结果：关节炎铁过载促进RA患者的滑膜增生和骨破坏：越来越多的证据表明RA患者关节中存在铁沉积过多。为了阐明特定的离子状态及其在RA进展中的病理作用，我们使用比色测定法量化了RA滑液（SF）中的铁水平。使用GA和OA患者的SF样本作为疾病对照，因为通常不对健康个体进行关节穿刺。结果显示RA SF中的游离铁水平高于GA和OA组（图1a），并且亚铁铁显著占主导地位（图1b）。滑膜RNA-seq数据集（GSE89408）显示，与铁离子稳态和铁离子通路反应相关的基因，包括B2M、HIF1A、SLC39A8和HEPHL1，在RA患者的滑膜中显著上调，与HC患者的滑膜相比（图1c和补充图1）。一致地，我们观察到RA滑膜中铁调节蛋白的表达异常，其特征是铁吸收分子转铁蛋白受体（TFRC）下调，铁排泄介质铁转运蛋白（FPN）上调，以及铁螯合蛋白铁蛋白轻链（FTL）和铁蛋白重链1（FTH1）的水平升高，与创伤患者的对照滑膜相比（补充图2）。这些发现表明关节中铁过载对类风湿性关节炎（RA）滑膜组织的直接影响。图1：局部的铁积累会加剧RA中的关节破坏。该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像：a RA患者（N=15）、GA患者（N=8）和OA患者（N=8）滑膜液（SF）中的铁含量评估。*P<0.05，**P<0.01，ns，无显著性，通过单因素方差分析（均值±标准差）。b RA SF中不同铁离子状态的平均频率（N=15），以GA患者（N=8）和OA患者（N=8）作为对照组。c 在GSE89408数据集中进行的基因集富集分析显示，RA和HC滑膜组织之间的不同基因与铁离子稳态（NES=1.575，P=0.014）和铁离子通路反应（NES=1.672，P=0.013）相关。NES，标准化富集分数。d 典型RA患者的膝关节MRI图像。I，T1-FS+C图像中用黄色箭头标出的滑膜；II，T1图像中用绿色箭头标出的骨破坏；III，PD-FS图像中用红色箭头标出的骨髓水肿。通过Spearman相关性分析评估改变的亚铁水平与放射学指标（骨侵蚀深度和滑膜体积）之间的关联（N=11），*P<0.05。通过Student's t检验比较RA SF中的亚铁水平与不同程度的滑膜炎（中度滑膜炎，N=5名RA患者；重度滑膜炎，N=6名RA患者）。e 含有DFO的STIA模型的时间线设计。f 不同时间点的疾病发病率。g 在建模后每天确定关节炎严重程度并进行统计分析，持续9天。每组N=10，***P<0.001，与溶剂（Vehi）组相比，通过Student's t检验（均值±标准差）。h 每天注射DFO的STIA小鼠在第9天被处死。收集整个爪子的组织切片进行H&E、Trap和TB分析（病理变化用黑色箭头标出）。每组N=10。***P<0.001，与Vehi组相比，通过Student's t检验（均值±标准差）。i 使用蛋白质阵列测量STIA爪组织中的生物因子表达。每个目标的图像密度都标准化为每个样本的参考值，并与Vehi组的倍数变化相对应。左：代表性点印迹。右：定量热图。每组N=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；通过Student's t检验（均值±标准差）。T1，T1加权图像。考虑到滑膜在介导关节破坏中的关键作用，我们使用Spearman相关性分析评估了RA患者局部铁含量与放射学特征之间的关系。在T1-FS+C图像中，亚铁水平升高与滑膜体积以及T1加权序列中的骨侵蚀深度之间存在正线性相关（图1d）。此外，重度滑膜炎患者的SF中铁积累量高于中度滑膜炎患者（图1d）。然而，PD-FS序列中的骨髓水肿与铁浓度的变化无关（数据未显示）。这些结果表明，局部铁可能促进RA患者的关节结构破坏。为了研究铁过载在关节炎中的致病作用，我们在K/BxN STIA模型中使用了铁螯合剂去铁胺（DFO）。通过在C57BL/6小鼠腹腔内注射K/BxN血清（100 μl）每隔一天进行一次来诱导关节炎。从第一次血清注射后的第二天开始，每天给予DFO（20 mg/kg，腹腔内），持续9天（图1e）。这种预防性的DFO治疗显著降低了疾病发病率和临床关节炎评分（图1f,g）。踝关节的组织学分析证实了滑膜炎、滑膜增生和绒毛形成的显著改善，以及软骨损伤和骨侵蚀的明显减少（图1h）。值得注意的是，这种保护作用并未伴随着血清中循环炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平的显著降低（补充图3）。鉴于局部关节保护与系统细胞因子不变之间的这种差异，我们接下来使用蛋白质阵列分析了爪组织内的致病介质的局部表达。正如预期的那样，我们发现预防性的DFO治疗显著下调了关键趋化因子（CCL2、CXCL1和CXCL12）、血管生成因子（ANG和Ang-3）和基质降解酶（MMP3、MMP8、MMP9和ADAMTS1）的水平（图1i）。然后我们评估了DFO是否也能在疾病发生后提供治疗效果。另一组小鼠在第二次血清注射后的第3天接受了第一次DFO注射，此时治疗组和对照组之间的关节炎严重程度没有基线差异。与预防性发现一致，这种治疗性的DFO应用显著减缓了随后的关节炎进展（补充图4）。这些小鼠的关节免疫组化分析显示巨噬细胞和中性粒细胞的浸润显著减少，同时炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的局部表达也减少（补充图5），证实了其在细胞水平上的治疗效果。总的来说，这些发现表明SF中的铁过载在RA的病理炎症和骨破坏中起着关键作用。无论是作为预防还是治疗干预，使用DFO进行铁螯合都能缓解关节炎进展。这种效果可能是通过调节局部病理过程来实现的，包括滑膜增生、白细胞募集和组织侵袭，而不是通过抑制系统细胞因子水平。在铁过载环境中，RA-FLSs的侵袭性能力增强。FLSs是RA患者炎症和骨破坏过程中的关键细胞介质，表现出“肿瘤样”生物学特性，具有过度增殖、迁移和侵袭性。考虑到关节炎微环境的关键作用，我们用10%的RA SF模拟了FLSs，并通过向培养基中添加铁螯合剂DFO来评估铁的影响（图2a）。通过CCK-8检测，我们发现SF刺激后FLSs的活力显著增强（图2b）。同时，RA SF通过Transwell评估正向调节了FLSs的迁移和侵袭能力（图2c,d），这与已报道的研究结果一致。用DFO消除过量的铁消除了上述促进效应，表明铁是诱导RA中FLSs侵袭性特征的重要因素（图2b–d）。图2：亚铁促进RA-FLSs的侵袭性生物学特性。该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像：a 体外实验过程的示意图。从RA患者中提取的FLSs用10%的SF激活，然后用DFO（100 μM，Selleck，S5742）处理24小时。b 通过CCK-8检测套件评估细胞活力。CTRL组和DFO组N=3，SF组和SF+DFO组N=6，***P<0.001，ns，无显著性，通过单因素方差分析（均值±标准差）。c-d 通过Transwell检测评估RA-FLSs的迁移（c）和侵袭（d）能力，使用单因素方差分析（均值±标准差）。对照组（CTRL）和DFO组N=3，SF组和SF+DFO组N=6。ns，无显著性，**P<0.01，***P<0.001。e 使用500 μM FeSO4模拟高亚铁环境来剂量依赖性地刺激RA-FLSs，并通过CCK-8检测分析细胞活力。每组N=4，*P<0.05，**P<0.01，与CTRL组相比，通过单因素方差分析（均值±标准差）。f–i 通过流式细胞术检测细胞周期分布（每组N=4）（f）；通过Transwell检测评估FLSs的迁移（g）和侵袭（h）能力（每组N=6）；在高铁环境中培养的FLSs接受了PCR阵列分析，以分析与炎症、趋化因子和基质蛋白酶相关的细胞因子表达（i）。在f–i中，使用接近RA SF平均亚铁水平的500 μM FeSO4来刺激FLSs的增殖、迁移、侵袭和细胞因子表达。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与PBS组相比，通过Student's t检验（均值±标准差）。数据以相对于PBS处理组（每组N=3）的倍数变化显示。j 通过在SCID小鼠中移植软骨和RA-FLSs来设计人源化滑膜炎模型的实验。在第一次操作中，SCID小鼠的左侧腹侧皮肤下植入软骨-明胶复合材料。2周后，将5×10^5个RA-FLSs注入软骨-明胶复合材料中，并将植入物插入右侧腹侧的皮下空间（主要是软骨）。植入的RA-FLSs浸没在高铁环境中或CTRL载体中。第60天，收集对照侧和主要侧的软骨。k 人源化滑膜炎模型中RA-FLSs引起的软骨破坏病变用黑色箭头标出（每组N=5，每个样本的两个不同区域用于统计）。数据为均值±标准差，并使用Student's t检验进行分析。*P<0.05，**P<0.01，与溶剂组相比。由于SF中大部分升高的铁处于亚铁状态，因此在接下来的实验中直接使用FeSO4来刺激FLSs。与我们之前观察到的RA患者外周血单核细胞中的铁死亡和单核细胞存活率降低不同（补充图6），500 μM FeSO4反映了RA SF中亚铁的中等浓度，并未导致FLSs的显著细胞死亡，但赋予了FLSs抗脂质过氧化能力（补充图7a–c）。此外，FeSO4显著增强了FLSs的细胞活力（图2e），诱导了更多的细胞处于S+G2/M阶段，表明高增殖（图2f），并增加了Transwell检测中的迁移和侵袭细胞数量（图2g–h）。此外，在铁激活FLSs的过程中，基质蛋白酶MMP3、MMP9、MMP10和MMP13以及趋化因子CCL3和CXCL5显著升高（图2i）。此外，在FLSs对铁的反应中发现了炎症细胞因子IL-6和TNF-α的增加。考虑到使用铁螯合剂DFO处理的STIA模型中爪组织中的炎症细胞因子未受影响，不同的滑膜细胞可能对铁刺激表现出异质的炎症反应。为了评估亚铁在体内的致病效应，我们通过在SCID小鼠模型中植入新鲜软骨和RA-FLSs来建立人源化滑膜炎模型，如图2j所示。用500 μM FeSO4处理的RA-FLSs表现出对软骨的增强侵袭，并导致主要软骨的显著侵蚀。未直接接触FLSs的对照侧移植的软骨也显示出明显的破坏（图2k），表明RA-FLSs的过度迁移和侵袭在协调铁诱导的关节破坏中起关键作用。在关节中过载铁会启动RA滑膜中的脂质合成。为了进一步阐明铁如何影响RA-FLSs驱动骨侵蚀，我们通过mRNA测序分析了FLSs在500 μM FeSO4处理下的基因表达变化。如图3a所示，293个基因上调，315个基因下调。在上调的基因中，多个胆固醇和类固醇代谢相关通路/过程在反应组和基因本体（GO）分析中显著富集（图3b）。几种脂质生成酶，包括HSD17B7、DHCR7、APOA1、FDPS、SCD1、FSN、ACLY、LSS、CYP51A1、HMGCR、HMGCS1和INSIG1，在FeSO4处理下的RA-FLSs中显著上调（图3c）。与此一致，在铁过载条件下，RA-FLSs中的FFA、TG和胆固醇的细胞内水平一致升高（补充图8）。接下来，我们使用非靶向代谢组学方法研究了铁过载引起的FLSs代谢改变。偏最小二乘判别分析揭示了FLSs代谢组的显著重编程（图3d）。在101个差异表达的代谢物中，脂质和类脂分子主要发生改变，包括脂肪酰基（38.10%）、甘油磷脂（38.09%）、类固醇和类固醇衍生物（16.67%）和鞘脂（7.14%）（图3e）。图3：关节中过载铁启动RA滑膜中的脂质合成。该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像：a FLSs用500 μM FeSO4培养24小时（N=3），然后进行全转录组测序分析；a火山图显示DEGs。b 反应组和GO富集显示上调的DEGs识别脂质代谢通路。c 热图显示FeSO4上调了几个与脂质合成相关的基因。d 对FeSO4和PBS处理的RA-FLSs代谢组进行偏最小二乘判别分析（N=5）。每个符号代表一个样本的数据。e 顶部：环形图显示非靶向代谢组学分析的差异代谢物的分布（共101个）。底部：堆叠图显示差异脂质的组成。f 使用10%的SF激活FLSs，然后添加DFO以阻断周围的铁过载。代表性的细胞中性脂质含量图像，分别用Bodipy 493/503（2 μM，绿色）染色和用荧光染料filipin III（50 μg/ml，蓝色）检测胆固醇。g 使用特定的脂肪酸合成酶抑制剂C75或甘油磷脂合成抑制剂FSG67研究脂肪酸和甘油磷脂对RA-FLS迁移和侵袭的影响（N = 3）。**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组（CTRL）相比，通过Student’s t检验（平均值±标准差）。h 一个Circo热图，展示了FeSO4处理与PBS处理后的FLSs之间特异性差异脂质的相对强度。i 左图：RA和HC滑膜中脂质合成酶FASN和HMGCR的代表性免疫组化染色。右图：两组之间FASN和HMGCR表达的定量评估（N = 10 RA；N = 10 NC；每个样本收集两个不同区域进行统计）。**P < 0.01***P < 0.001；通过Student’s t检验（平均值±标准差）。j 使用Spearman相关性分析研究SF中亚铁水平与FFA、CHOL和TG的相关性（N = 15）。为了进一步确定观察到的脂质积累是否是由铁直接引起的，我们使用DFO螯合RA SF中的过量铁，并发现BODIPY 493/503和filipin III染色分别显示中性脂质和胆固醇的升高得到了有效逆转（图3f）。然后，我们通过针对两种主要脂质类别进行靶向抑制实验，直接测试了铁介导的脂质积累的功能相关性。脂肪酸合成（使用C75）或甘油磷脂合成（使用FSG67）的抑制显著减弱了铁负载FLSs的增强迁移和Matrigel侵袭能力（图3g）。这些结果共同表明，铁是脂质积累的功能驱动因素，进而促进了FLSs的病理行为。基于这些发现，我们在图3h中进一步表征了特定的脂质种类，如LysoPE 14:0、Tetranor-PGFM、前列腺素J2和LPE 16:1等关键生物活性脂质的明显上调。值得注意的是，这些特定上调脂质的鉴定为未来旨在缓解FLS驱动的病理的代谢干预策略提供了潜在靶点。除了脂质代谢物的升高外，RA患者的滑膜中脂质合成标志物（包括FASN和HMGCR）的表达也明显高于HC患者（图3i）。此外，由FFA、TG和胆固醇浓度代表的脂肪变性的严重程度与RA SF中的亚铁水平呈强正相关（图3j）。这些数据证实了RA患者增生性滑膜和SF中脂质积累与铁过载之间的机制联系，表明过量铁似乎驱动了FLSs中的脂质代谢活动。

亚铁启动SREBP1信号通路，以增强RA-FLSs中的从头脂质合成。细胞内脂质积累的机制与异常的脂质摄取、合成以及涉及氧化和水解的代谢过程有关。RNA-seq分析结合qPCR检测证实，亚铁上调了FLSs中关键脂质生成基因的mRNA水平，包括FDPS、SCD1、FASN、ACLY、LSS、CYP51A1和HMGCR。尽管胆固醇摄取基因LDLR增加（图4a和补充图9），但脂肪酸转运基因CD36的表达没有变化（图4a和补充图10）。TG水解酶ATGL的mRNA增加，而调节脂肪酸β-氧化的基因CPT1A和ACOX1的mRNA在铁处理后保持不变（图4a）。Western blot分析进一步显示，在铁刺激下，从头脂质生成酶FASN、ACLY、HMGCR和CYP51A1的表达随时间增加（图4b）。这些结果表明，铁在FLSs中激活了主要的脂质合成代谢途径。

图4：亚铁启动SREBP1信号通路，以增强RA-FLSs中的从头脂质合成。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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a 在500 μM FeSO4培养24小时后，通过qPCR检测FLSs中脂酶基因的表达。数据经过β-actin mRNA水平标准化后与PBS组进行比较。N = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns，无显著性，通过Student’s t检验（平均值±标准差）。
b 通过Western blot评估FeSO4处理后指定时间内FLSs中脂质合成酶的表达。数据显示为三个生物学独立实验的代表值。
c 通过Enrichr查询TRRUST数据库预测FeSO4上调基因的转录因子（TFs）。SREBF1排名最高。
d 单细胞转录组分析揭示了各种滑膜细胞中SREBF1和SREBF2的表达分布。
e 通过qPCR检测SREBF1和SREBF2 mRNA的定量。ns，与PBS组相比无显著性；通过Student’s t检验（N = 3）。
f 通过Western blot评估FeSO4处理后指定时间（500 μM）内FLSs中SREBP1和SREBP2的表达。数据以平均值±标准差表示，并通过单因素ANOVA和Tukey事后检验进行显著性比较（与0 h组相比），N = 3。
g 通过IF评估FeSO4刺激（500 μM）后指定时间内SREBP1（绿色）和SREBP2（红色）的表达，蓝色（DAPI）表示细胞核。N = 3。
h FLSs在培养基中用SF（10%）刺激24小时。应用特定的铁螯合剂DFO（100 μM）来阻断SF中的铁。通过Western blot评估激活FLSs中SREBP1和SREBP2的表达。数据在每个样本中经过β-actin蛋白水平标准化后进行比较。N = 5，*P < 0.05，ns，无显著性，通过配对t检验（平均值±标准差）。

随后，为了阐明铁调节的上游调控因子，我们筛选了与FLSs中上调基因相关的所有转录因子，并确定SREBF1、HOXA1、MAZ、RBMX和STAT5B为顶级候选者（图4c）。SREBF1排名最高，编码固醇调节元件结合蛋白SREBP1，这是一种主要负责脂肪酸和胆固醇生物合成的主转录因子。单细胞分析显示FLSs中SREBF1的表达特别高，而另一种SREBF异构体SREBF2在RA滑膜组织的血浆细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞和NK细胞中的表达广泛但较低（图4d）。尽管qPCR检测显示FeSO4处理的FLSs中SREBF1和SREBF2的mRNA水平没有变化（图4e），但Western blot分析表明铁刺激促进了SREBP1的切割和激活，SREBP1前体（pSREBP1）逐渐减少，而成熟形式（mSREBP1）增加（图4f）。与未受刺激的FLSs相比，FeSO4处理的细胞显示SREBP1从细胞质到细胞核的显著且时间依赖性的转移，在那里它作为转录因子发挥作用（图4g和补充图11）。所有这些变化在SREBP2中均未观察到（图4f,g）。此外，SF刺激进一步增强了SREBP1的切割和激活，这种效应被铁螯合剂DFO显著逆转（图4h）。一致地，SF引起的脂质合成上调效应通过铁螯合被消除（补充图12）。总的来说，这些发现表明铁是RA-FLSs中SREBP1介导的脂质生成的重要诱导因素。

铁促进的RA-FLSs侵袭性依赖于SREBP1信号通路。接下来，我们探讨了SREBP1激活是在铁处理下RA-FLSs的侵袭性表型中作为一个被动 bystander还是起因果作用。为了解决这个问题，我们使用了脂肪抑素1，一种SREBP信号通路拮抗剂。如图5a,b所示，FeSO4诱导的RA-FLSs的增强活力、迁移能力和侵蚀能力被脂肪抑素1显著抑制。此外，使用STIA模型的体内干预研究表明，脂肪抑素1的给药导致关节炎评分降低、疾病发生率减少以及病理变化的显著改善，包括滑膜增生、软骨侵蚀和骨破坏（图5c–e）。

图5：铁促进的RA-FLSs的侵袭性依赖于SREBP1信号通路。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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a,b RA-FLSs分别与FeSO4（500 μM）单独或与SREBP通路抑制剂脂肪抑素1（10 μM）共同培养24小时后，检测细胞活力（a）和迁移及侵袭能力（b）：细胞活力通过CCK-8测定（a），FLSs的迁移和侵袭能力通过Transwell测定（b）。N = 4。**P < 0.01，***P < 0.001，ns，无显著性。数据以平均值±标准差表示，并使用单因素ANOVA进行分析。
c STIA模型中脂肪抑素1治疗的示意图。
d 在脂肪抑素1给药期间，每天确定疾病发生率和关节炎评分的动态变化，并在9天后进行统计分析。每组N = 6。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与溶剂（Vehi）组相比，通过Student’s t检验（平均值±标准差）。
e 模型中后爪的代表性图像和病理染色切片。黑色箭头指示H&E中的滑膜细胞增殖、Trap中的破骨细胞和TB中的破坏性软骨。右图：统计结果。每组N = 6。数据以平均值±标准差表示，***P < 0.001，与Vehi组相比，通过Student’s t检验。
f RA-FLSs感染携带SREBP1-shRNA的慢病毒载体或仅携带GFP的对照慢病毒（NC）。感染后5天通过Western blot分析SREBP1的表达。实验在三个独立个体中重复进行。
g Transwell趋化性测定显示FeSO4处理后SREBP1敲低（SREBP1KD）的FLSs的迁移和侵袭变化。N = 4。数据以平均值±标准差表示，并使用单因素ANOVA进行分析。**P < 0.01，***P < 0.001，ns，无显著性。
h 在人源化滑膜炎模型中评估SREBP1KD的RA-FLSs的迁移和侵袭能力（每组N = 5，每个样本收集两个不同区域进行统计）。黑色箭头指示由RA-FLSs引起的软骨破坏病变。数据以平均值±标准差表示，并使用单因素ANOVA进行分析。*P < 0.05，**P < 0.01，ns，无显著性。

然而，值得注意的是，脂肪抑素1通过阻断SREBPs从内质网（ER）到高尔基体的转移及其随后的激活，从而非特异性地抑制脂质合成。

然而，值得注意的是，脂肪抑素1通过阻断SREBPs从内质网（ER）到高尔基体的转移及其随后的激活，从而非特异性地抑制脂质合成。为了进一步阐明SREBP1在调节铁对RA-FLSs“肿瘤样”特征中的作用，我们在研究中添加了二十碳五烯酸，这是一种已知可以特异性抑制SREBP1的产生和激活而不直接影响SREBP2的多不饱和脂肪酸（补充图13）。正如我们所预期的，二十碳五烯酸的给药再现了脂肪抑素1的关键治疗效果，显著降低了STIA模型中的关节炎严重程度（补充图14）。至关重要的是，这种SREBP1特异性的药理效应得到了我们体外遗传证据的支持。我们在RA-FLSs中沉默了SREBP1表达（图5f），并观察到SREBP1敲低消除了过量铁对RA-FLSs迁移和侵袭的促进作用（图5g）。在图5h所示的人源化滑膜炎模型中，下调RA-FLSs中的SREBP1显著消除了FeSO4暴露后对初级和对照侧软骨的侵袭促进作用。这些发现强调了SREBP1在介导铁处理下RA-FLSs的过度增生和过度侵蚀表型中的关键作用。

IRP1从SCAP 5′ UTR mRNA分离激活SREBP1，并在铁过载环境中促进FLS的侵袭性。在脂质合成过程中，SCAP在促进SREBPs从ER到高尔基体的运输及其随后的切割激活中起着关键作用。胰岛素诱导基因（INSIGs），包括INSIG1和INSIG2，是SREBPs-SCAP运输和蛋白水解激活的主要负调节因子。我们的数据显示，FeSO4处理RA-FLSs导致SCAP蛋白表达迅速增加，这种效应具有时间依赖性（图6a和补充图15），而INSIG1和INSIG2的水平没有显著变化。有趣的是，qPCR结果显示SCAP mRNA的水平没有变化（图6b），这表明SCAP水平的升高可能是由于蛋白质合成增强或降解过程受损。进一步用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理FLSs有效地消除了FeSO4诱导的SCAP上调，而蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂氯喹（CQ）对SCAP表达没有显著影响（图6c）。这些发现表明，在FeSO4处理后，RA-FLSs中SCAP表达水平的升高可能是由于翻译增强而非蛋白质降解减少所致。图6：IRP1从SCAP 5′ UTR mRNA上解离激活了SREBP1，并在铁过载环境中促进了FLSs的侵袭性。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：RA-FLSs被FeSO4（500 μM）刺激了3小时。通过Western blot检测分析了SCAP、INSIG1和INSIG2的水平。N=3。b FeSO4刺激后FLSs中的SCAP mRNA表达。N=3。ns，学生t检验不显著（平均值±标准差）。c FLSs分别与蛋白质合成抑制剂CHX（50 μg/ml）、蛋白酶体抑制剂MG132（10 μM）和自体溶酶体抑制剂CQ（10 μM）一起孵育4小时，以中断伴随FeSO4处理的蛋白质合成或降解过程。N=3。d SCAP mRNA结合蛋白与铁代谢基因的交叉比较，重点关注唯一的共同基因IRP1（顶部）；显示了IRP1靶向SCAP mRNA的预测结合域（底部）。e IRP1和SCAP 5′ UTR复合物的卡通结构。f 用于预测IRP1和SCAP 5′ UTR之间相互作用部位的分子对接。g 顶部：RIP和定量rtPCR检测显示了SCAP mRNA和IRP1的特异性结合。底部：Western blot显示了IRP1抗体的免疫沉淀（IP）效率。N=3。h EMSA验证了纯化的人类重组IRP1蛋白与SCAP 5′ UTR探针之间的相互作用。Cold(S)为未标记的特异性竞争探针；Cold(M)为未标记的突变竞争探针。i 代表性的FISH–IF图像显示了FLS细胞质中SCAP 5′ UTR和IRP1的共定位，这种共定位在FeSO4处理后明显减少。绿色（FAM标记的探针）表示SCAP 5′ UTR，红色表示IRP1蛋白，蓝色（DAPI）表示细胞核。j RNA pulldown检测显示了RA-FLSs中SCAP 5′ UTR和IRP1之间的相互作用。FeSO4刺激降低了SCAP 5′ UTR对IRP1的结合（s-ex，短时间曝光；l-ex，长时间曝光）。N=3。k Western blot显示了IRP1敲低后FLSs中的SCAP表达及随后的SREBP1切割激活。对于IRP1的siRNA敲低，FLSs使用JetPRIME（Polyplus-transfection，101000046）转染了三种设计的siIRP1。N=3。l 通过qPCR检测了IRP敲低后FLSs中脂肪酶基因FASN、ACLY、CYP51A1和HMGCR的相对mRNA水平。N=3。*P<0.05，与NC转染组相比（平均值±标准差）。m,n 同时敲低SCAP恢复了SREBP1的激活（m），并抑制了IRP1缺陷RA-FLSs在Transwell试验中的迁移和侵袭能力（n）。数据以平均值±标准差表示。*P<0.05，** P<0.01，与NC转染组相比（单因素ANOVA）。MG132，carbobenzoxy-L-leucyl–L-leucyl-L-leucinal；3-MA，3-甲基腺嘌呤。mRNA中的5′ UTR或3′ UTR序列是翻译效率的关键决定因素，可以由RNA结合蛋白的占据来调节。鉴于此，我们将RBPDB数据库（RNA结合蛋白特异性数据库，http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/index.php）中识别的SCAP靶向RNA结合蛋白与GeneCards数据库（https://www.genecards.org）中列出的铁代谢基因进行了交叉分析。我们的分析显示IRP1是唯一一个可能同时占据SCAP mRNA的5′ UTR和编码序列（CDS）区域的基因（图6d）。这使我们假设IRP1的结合可能是SCAP翻译的关键调控步骤。接下来，分子对接模拟预测了SCAP 5′ UTR mRNA和IRP1蛋白的分布和结合位点（图6e,f）。RIP检测确认了生理条件下IRP1和SCAP 5′ UTR之间的内源性相互作用（图6g）。为了确定这种相互作用是否直接，我们使用SCAP 5′ UTR RNA探针和纯化的重组人类IRP1蛋白进行了EMSA。探针与HIS-IRP1孵育后观察到了明显的迁移变化（图6h，第2条泳道），这种变化被50倍摩尔过量的未标记野生型探针特异性竞争（图6h，第3条泳道），但未被突变探针竞争（图6h，第4条泳道）。此外，FISH–IF分析显示铁过载（FeSO?刺激）诱导了IRP1从SCAP 5′ UTR上的解离（图6i）。一致地，使用FeSO?处理的FLSs的裂解物进行的RNA pulldown检测显示IRP1与SCAP 5′ UTR的结合显著减少（图6j）。总之，这些结果表明IRP1直接且特异性地结合SCAP 5′ UTR，这种相互作用以铁依赖的方式受到调控。先前的研究报道IRP1和IRP2都作为铁响应元件–RNA结合蛋白发挥作用。当铁充足时，IRP1从RNA结合蛋白转变为aconitase19。因此，我们使用siRNA进行了IRP1敲低，以模拟RNA结合功能的丧失，并评估其对RA-FLSs中SCAP表达和SREBP1激活的影响。与NC组相比，IRP1敲低导致SCAP表达增加和SREBP1切割增强，而IRP2干扰后表达未改变（图6k和补充图16）。此外，在IRP1敲低的FLSs中观察到SREBP1靶基因（包括FASN、ACLY、CYP51A1和HMGCR）的转录上调（图6l）。为了验证SCAP作为IRP1的关键下游介质，我们在IRP1缺陷的FLS细胞中进行了 rescue实验。值得注意的是，SCAP敲低有效逆转了IRP1沉默引起的mSREBP1的上调（图6m）。此外，IRP1耗竭导致的增强迁移和侵袭能力通过同时敲低SCAP显著受到抑制（图6n）。这些发现表明SCAP作为关键下游效应器，通过IRP1调节SREBP1的加工，从而在铁过载条件下促进RA-FLSs的侵袭性表型。尽管IRP1和IRP2具有共享的IRE结合功能，我们调查了直接补偿的可能性，发现IRP1敲低的FLSs中IRP2蛋白水平并未升高（补充图17）。这表明在我们的实验模型和时间范围内，IRP2可能不会发生显著的即时补偿；然而，这两种分子之间更复杂的协同作用或情境依赖的相互影响为未来的研究提供了有价值的方向。

讨论
当前研究阐明了关节微环境中过量铁对类风湿性关节炎（RA）患者功能损害和残疾结果的不良影响。我们的发现表明，关节环境中铁含量的升高加剧了RA中的滑膜增生和骨破坏，这一点通过MRI得到了证实。从机制上看，铁调节蛋白IRP1作为一个关键介质，通过与上游适配蛋白SCAP的相互作用来协调转录因子SREBP1的切割激活。这种相互作用重新定向了细胞内脂质代谢，赋予RA-FLSs更强的增殖和侵蚀能力，从而促进了关节损伤和疾病进展。
铁的稳态是维持基本生理功能的前提，包括氧气运输、细胞能量代谢、电子运输以及众多酶促反应。正如世界卫生组织所指出的，铁缺乏及其导致的贫血是最普遍的公共卫生挑战之一。在许多慢性疾病的背景下，全身铁缺乏通常伴随着病理部位的异常铁积累，例如在退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）、慢性炎症性疾病（如动脉粥样硬化）、代谢紊乱（如肥胖和肝脏脂生成）以及自身免疫性疾病（如多发性硬化症）中。局部铁过载也是RA关节微环境的一个特征，这可能源于组织驻留和浸润免疫细胞的铁处理失调。巨噬细胞作为铁稳态的主要调节者，是一个主要候选者。在发炎的关节中，滑膜巨噬细胞可能通过反复吞噬微出血中的红细胞以及通过炎症诱导的铁输出抑制（例如通过hepcidin信号通路）来促进局部铁积累，可能导致不稳定的铁异常释放到滑膜微环境中。失调的铁代谢加剧了基于氧的自由基的产生，对多种细胞和组织造成损害。在RA中，我们之前已经证明铁通过诱导抗炎巨噬细胞的铁死亡（ferroptosis）加剧了关节内的局部免疫失调，而同时对促炎巨噬细胞则影响较小。在这项研究中，我们观察到亚铁增强了细胞的抗脂质过氧化能力，并赋予RA-FLSs对铁死亡的抵抗力。这种保护作用可能与同时激活的GPX4抗氧化系统有关，这已与失调的脂质代谢一起被报道。基于这一生存优势，亚铁确实赋予RA-FLSs更强的侵袭性特性，如增强的迁移和侵袭能力。鉴于FLSs在RA骨侵蚀中的关键作用，我们假设铁处理的FLSs的破坏性效应更为显著，这一点通过人源化滑膜炎模型得到了证实。现有证据表明，尽管铁缺乏性贫血是RA的常见并发症，但全身铁补充应谨慎进行，因为据报道它会加剧滑膜炎。考虑到滑膜细胞对过量铁的不同反应，针对特定细胞类型的靶向铁干预可能为RA管理提供更有效的治疗策略。
滑膜增生和侵袭性依赖于丰富的能量储备。脂质作为关键营养素，为不受控制的细胞增殖和疾病进展提供必要的能量和构建块，包括肝细胞癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤等多种病理情况。早在1962年，Bole等人就报告了RA患者滑膜液（SF）中磷脂、胆固醇和中性脂质的水平升高。细胞内的脂肪酸和脂滴也被认为与RA T细胞的组织侵袭性有关。此外，使用气相色谱-飞行时间质谱进行的代谢物分析显示RA-FLSs中的脂肪酸代谢显著升高，同时葡萄糖代谢严重紊乱。最近的研究表明，RA-FLSs更依赖于脂肪酸代谢而非葡萄糖和氨基酸。SREBPs包含两种异构体，是脂质合成的核心转录因子。SREBP1作为下游脂生成酶的强大激活剂，参与胆固醇、脂肪酸和甘油三酯（TG）的合成，而SREBP2则优先增强胆固醇合成所需基因的转录。在这项研究中，通过结合转录组学和代谢组学分析，我们重点关注了铁处理的RA-FLSs中观察到的脂质代谢增强，并确定SREBP1而非SREBP2是这种代谢活动的核心枢纽。值得注意的是，我们的数据还显示了LDLR（一种介导细胞摄取富含胆固醇的低密度脂蛋白颗粒的受体）的上调，这表明铁过载可能通过促进从头脂生成以及从微环境中获取外源性甾醇来促进RA-FLSs中的脂质积累。此外，重塑的脂质代谢为过度的细胞骨架重组、膜突起和基质降解提供了必要的能量构建块和信号线索，从而促进了RA-FLSs的侵袭性表型。这些发现与最近的研究结果一致，即SREBP1在RA-FLSs中正向调节PI3K–AKT–mTOR通路。关键的是，我们的数据确立了局部铁过载是这些代谢紊乱的主要驱动因素。这些结果共同提供了关于RA病理生理学的新见解，并强调了紊乱的关节炎微环境在疾病进展中的关键作用。
SREBPs的激活取决于它们从内质网（ER）转移到高尔基体进行切割和随后的核内转移。在此过程中，SCAP作为 escort蛋白，与SREBPs形成稳定复合物以促进其运输。相反，ER中的INSIG蛋白INSIG1和INSIG2将SREBPs保留在ER中，从而劫持了它们的运输和激活。新兴证据表明铁稳态与各种病理生理条件下的脂质代谢之间存在联系；然而，这两种过程之间的直接相互作用仍不清楚。SREBF2已被证明通过激活其启动子来促进转铁蛋白（TF）的转录，而TF的表达可能通过替代途径间接影响SREBP靶基因。在这项研究中，我们确定了IRP1–SCAP–SREBP1轴作为一个新定义的铁-脂质相互作用枢纽。我们证明SCAP mRNA的5′ UTR被铁调节蛋白IRP1占据，IRP1不仅感知环境中的铁变化，还充当RNA结合蛋白。在暴露于过量铁的情况下，IRP1从SCAP mRNA的5′ UTR上解离，从而促进其转录后翻译并促进SREBP1的后续切割激活。此外，scRNA-seq分析显示，IRP1和SCAP的表达几乎完全集中在FLS（滑膜肥大细胞）中，这突显了类风湿性关节炎（RA）中铁-脂质相互作用的一种细胞特异性机制。鉴于无差别的铁干预不可避免地会破坏重要的生理功能，针对IRP1-SCAP相互作用提供了一种更有前景的治疗策略。这种方法可能能够精确抑制FLS驱动的RA进展，同时避免广泛的铁调节所带来的系统性后果。尽管本研究揭示了RA-FLS中的一种新的铁响应通路，但仍存在一些局限性，为未来的研究指明了方向。首先，我们的临床队列仅建立了概念验证的相关性；其样本量有限，需要在更大规模、分层且具有完整元数据的队列中进行验证，以确认其普遍性。其次，实验范围仅限于急性STIA模型和人源化滑膜炎模型；在慢性自身免疫性疾病（如CIA）中使用FLS特异性的条件性敲除小鼠来验证这一通路的病理相关性是必要的。最后，其治疗潜力有待药物学开发。基于我们的机制发现，下一步的合理步骤包括筛选小分子库或设计肽类，在体外验证它们破坏IRP1-SCAP 5′ UTR复合物的有效性，并测试候选化合物在细胞和动物模型中抑制SREBP1激活和FLS侵袭的能力，这对于开发新型RA治疗方法至关重要。

总之，我们的研究表明，关节微环境中的铁积累是加剧RA关节破坏的关键因素。亚铁通过铁调节蛋白IRP1与脂质合成介质SCAP之间的相互作用积极调节脂质代谢，从而增强了FLS的侵袭性表型。针对FLS中这种内在的铁-脂质相互作用成为一种连贯且有前景的治疗策略，有助于减轻RA中的关节破坏。