四聚体的STAT5蛋白调控免疫生态位细胞的形成，从而保护干细胞在黏膜炎症环境下的再生修复功能

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Tetrameric STAT5 regulates the formation of immune niche cells to protect stem cell regenerative repair against mucosal inflammation

　　摘要
炎症期间肠道干细胞（ISCs）的调控机制在很大程度上仍未被探索清楚，这导致针对炎症性肠病（IBD）的有效治疗方法缺乏。ISC介导的肠道上皮再生修复可以受到上皮内T淋巴细胞的调节，而这些T淋巴细胞的成熟受到STAT5二聚体或四聚体激活的控制。然而，T淋巴细胞如何保护ISCs的机制尚不清楚。在这里，我们假设四聚体STAT5调节隐窝内的T细胞，使其成为ISC再生的微环境细胞。利用IBD生物样本、STAT5过度活跃且缺乏四聚体的小鼠以及类器官，我们发现IBD-溃疡性结肠炎患者中的隐窝TCRγδ+STAT5+ T细胞数量更多，而ISC的多能性较低。与野生型小鼠相比，敲低小鼠中的四聚体STAT5显著增强了ISC介导的肠道上皮增生、TCR基因特征、TCRγδ+ T细胞中的STAT5酪氨酸磷酸化（pYSTAT5）水平以及IL-17A水平，同时促进了Lgr5hi和Lgr5low ISC的增殖，并在辐照或结肠炎后增加了新的隐窝再生。相比之下，敲低类器官中的四聚体STAT5会降低ISC的多能性和类器官的生长。通过染色质免疫沉淀和单细胞RNA测序分析，我们发现敲低STAT5四聚体会减少隐窝T细胞中Metallothionein 1（Mt1）位点上的STAT5结合，并增加Mt1的表达，从而促进T细胞向隐窝迁移并增强ISC再生。综上所述，四聚体STAT5抑制了隐窝T细胞微环境的形成；干扰STAT5四聚体的形成可以促进隐窝TCRγδ细胞的扩增，为促进IBD-溃疡性结肠炎期间的ISC再生修复提供了一个靶点。

引言
炎症性肠病（IBD）是一组可能危及生命的疾病，如果不及时治疗的话。然而，由于我们对控制黏膜损伤的潜在靶点了解有限，促进胃肠道愈合的疗法仍然不足。此外，由于缺乏关于IBD愈合机制的研究，目前的治疗主要依赖于抑制炎症的方法，这导致长期使用系统性类固醇药物的患者不可避免地会出现严重的副作用。因此，识别能够控制胃肠道愈合的可靠靶点至关重要。肠道干细胞（ISCs），特别是那些表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）的ISCs，能够产生维持肠道上皮细胞（IEC）谱系并介导肠道愈合。ISC再生能力的受损被认为会干扰IBD中的IEC愈合，即使在没有明显黏膜病变的情况下也可能发生。微环境细胞与ISCs相关或围绕隐窝基底，包括邻近的间充质细胞、Paneth样细胞和免疫细胞，可以通过旁分泌（扩散）或接触依赖（直接）的配体-受体相互作用来调节ISC对肠道感染和炎症的再生反应。值得注意的是，多项研究表明，免疫微环境细胞的丧失可能会引发ISC再生受损，使个体易患IBD。然而，免疫微环境细胞在ISC再生中的作用在很大程度上仍未被探索。

LGR5+ ISCs表达高水平的主要组织相容性复合体（MHC）I和II，这对再生修复至关重要。在这一过程中，ISCs直接与T辅助（TH）细胞上的TCR相互作用。它们在过渡-扩增（TA）区迅速转化为前体细胞，进而产生不同的细胞谱系。ISC的分化和功能还受到来自黏膜TH1、TH2和TH17细胞的细胞因子的调节。例如，IL-10可以促进ISC的自我更新，而IL-17A则会抑制ISC的自我更新，诱导ISC分化为分泌型谱系。重要的是，IL-17A可以通过结合Lgr5 ISC上的IL-17RA直接保护ISC再生。有趣的是，同种异体T细胞可以在移植后被招募到隐窝中，导致ISC的丢失；T细胞衍生的IFN-γ可以直接靶向ISC，导致其耗竭。此外，表达整合素αEβ7的T细胞可以通过整合素αEβ7与ISC中的E-钙粘蛋白相互作用来调节ISC的命运。然而，T细胞渗透到隐窝基底的具体机制及其后果尚不清楚；IL-17A剂量对Lgr5 ISC行为的影响尚未得到充分研究，也不清楚是否可以针对这些细胞来保护ISC。

转录因子STAT5A/B作为各种黏膜细胞因子、生长因子和激素-JAK通路的下游信号节点，诱导STAT5酪氨酸磷酸化（pYSTAT5），从而形成二聚体并激活STAT5。STAT5A对于ISC的自我更新和IEC屏障功能是必需的，而STAT5B的激活可以维持肠道T细胞的功能。通过基因工程改造的小鼠模型，Stat5基因（Stat5a和Stat5b）两侧带有loxP DNA序列，可以在与表达Cre重组酶的小鼠杂交时条件性地删除特定细胞或组织中的二聚体STAT5A和STAT5B。使用Stat5 floxed小鼠，发现STAT5二聚体的丢失会抑制肠道T细胞功能和ISC再生，从而加剧黏膜炎症。通过突变STAT5A上的S711位点（S711F），生成了持续激活的cS5 floxed小鼠。在Lgr5 ISC中激活cS5可以增强它们对辐射损伤的抵抗力。

关键的是，STAT5是一种模块化转录因子，其N端结构域使其能够形成四聚体。STAT5四聚体可以结合与STAT5二聚体不同的基序，以诱导或抑制基因表达，如c-Myc、Bcl-2和Cyclin D2。特别是，细胞因子激活的STAT5二聚体结合高亲和力的GAS序列，而N端结构域介导的STAT5四聚体结合低亲和力的串联GAS样基序，间距分布为2-17 bp。在编码多种细胞因子的基因中发现了共识四聚体基序，包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-17A、IL-22、IL-23和IFN-γ。STAT5A和STAT5B的N端域中的I28、F81和L82对于STAT5四聚体的形成是必需的，但对于二聚体的形成则不是必需的。单独或组合突变这些残基不会影响STAT5二聚体的结合，但会消除STAT5四聚体的形成。基于这一原理，生成了Stat5a–Stat5b N域双敲入（DKI）小鼠，其中正常的STAT5二聚体功能正常，但更稳定的STAT5四聚体的形成被阻断。值得注意的是，与STAT5二聚体缺乏的小鼠不同，STAT5四聚体缺乏的小鼠CD8+ T细胞和黏膜T调节（Treg）细胞（CD4+Foxp3+）的数量较少。Treg细胞还可以通过上调IL-10来直接抑制肠道TCRγδ T细胞或IL-17的产生，表明STAT5四聚体可能通过减少IL-17的产生来抑制TCRγδ T细胞的功能。此外，四聚体STAT5与H3K27甲基化酶EZH2相互作用，形成H3K27三甲基化的抑制性染色质，并可能直接调节T细胞受体γ共同（TCRγ）基因的染色质可及性和重排。这些发现表明，STAT5四聚体可能通过抑制肠道TCRγδ T细胞来控制其功能。

通过使用二聚体或四聚体STAT5缺乏的小鼠、激活的STAT5转基因小鼠、类器官、肠道和结肠ISC损伤模型以及对IBD患者的基因组分析，我们的文章首次证明隐窝T细胞是TCRγδ T细胞，它们通过分泌IL-17A在ISC再生中起保护作用。隐窝TCRγδ T细胞可以通过STAT5二聚体的激活来调节，而STAT5四聚体的生成则会产生抑制性染色质。在IBD-溃疡性结肠炎（UC）患者中，隐窝TCRγδ T细胞数量增加，可能受到STAT5激活的调节，这表明它们在黏膜炎症期间的隐窝修复中起作用。

材料与方法
所有化学品和抗体均从Sigma-Aldrich购买，除非另有说明。详细信息见补充信息。

来自IBD患者的活检和组织标本
来自中国山东省青岛市青岛大学附属医院的成年患者（包括21例CD、24例UC和10例健康对照）的结肠活检标本和血液样本。患者样本的详细信息见补充表1。石蜡包埋的组织标本来自美国克利夫兰MetroHealth Medical Center（MHMC）和辛辛那提大学医学中心（Cincinnati Medical Center）的病理科。

在处理用于苏木精和伊红（HE）染色、组织学分析、RNA提取和患者入组之前，分别获得了MHMC/CWRU（美国俄亥俄州克利夫兰）、青岛大学附属医院（中国山东省青岛市）的伦理委员会（IRB21-00237）以及辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC，美国俄亥俄州辛辛那提）的IRB批准的使用IBD患者样本的IRB协议（X.H., IRB2009-1680）的批准。所有研究均遵循使用人类样本的相关指南/规定进行。

动物资源与维护
动物研究方案得到了MHMC和CWRU（美国俄亥俄州克利夫兰）以及ILAS（中国北京市）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（IACUC 2020-0081和LHF21001）。所有小鼠均在MHMC/CWRU和ILAS的动物护理设施中在无特定病原体的条件下饲养。所有实验均遵循相关指南和规定进行。可诱导的Stat5耗竭（Stat5?/?）和持续激活的Stat5小鼠（cS5）以及Stat5a–Stat5b DKI N域突变小鼠（DKI，以下简称STAT5四聚体缺乏小鼠）的生成方法如前所述。Rosa26-creERT2（RsCreER）小鼠从Jackson Laboratory购买（品系编号008463）。RsCreER;stat5f/f或cS5f/f和Lgr5CreER;DKI小鼠的交叉和基因分型的详细程序见补充图1a。小鼠交叉和基因分型的详细程序以及引物序列见补充图2a和补充表2。

辐射诱导损伤模型
Rs26CerER、cS5和DKI小鼠接受了13 Gy的辐射。简而言之，DKI和野生型（WT）对照小鼠在ILAS或CWRU综合癌症中心核心接受了13 Gy的全身γ辐射。检查了肠道组织的肉眼和组织学异常。详细程序见补充信息。

结肠炎动物模型
简而言之，DKI和WT对照组小鼠在水中口服2.5%硫酸右旋糖酐（DSS）7天后恢复5天，用于诱导炎症引起的结肠ISC修复；或者在水中恢复5天后进行三周期的DSS处理，用于诱导凋亡引起的结肠ISC再生。详细方法见补充图5b。

免疫荧光（IH）、免疫荧光（IF）和定量PCR（qPCR）
使用Anti-Ki67、溶菌酶、凋亡抑制剂5（API5）、EdU、CD3、TCRγδ和pYSTAT5抗体检测隐窝ISC的增殖、Paneth细胞增生、T细胞和STAT5的激活。细胞因子（TNFα、IFNγ、IL-4、6、7、10、12、15、17、22、23和27）、ISC标记物（Lgr5、Ascl、Olfm4和Lyz1）和金属硫蛋白（Mt1和Mt2）的表达水平通过定量PCR（qPCR）进行测量，引物见补充表4。详细方法见补充信息。

FACS分析
从IBD-UC患者中收集外周血单核细胞（PBMCs）。将小鼠的小肠（SI）或结肠黏膜和隐窝分离成单个细胞，并将细胞分选到IEC和隐窝淋巴细胞亚群中。在Lgr5CreER和Lgr5CreER;DKI小鼠腹腔注射EdU（50 mg/kg）后，使用FACS分析（Lgr5荧光激活细胞分选）。在IEC内层（LP）或隐窝T细胞上使用抗小鼠CD3、CD4、CD8和TCRγδ抗体进行染色。人类PBMC使用抗人类CD3、CD4、CD8、CD45、TCRαβ或TCRγδ抗体进行染色（见补充图1a和2b）。抗体列表见补充表3。详细方法见补充信息。

类器官培养、IR处理、EdU掺入和培养基转移
从SI和结肠中分离出完整的隐窝。将这些类器官在体外培养14天，然后暴露于2 Gy的IR。EdU掺入后，固定类器官或用Trizol提取总RNA。对活的类器官或OCT包埋的类器官进行视频记录或成像。通过计数最终存活的类器官和初始生长的类器官（≥200个）来确定Lgr5 ISC的自我更新或增殖能力以及类器官的多重性和球形大小。在有无IR或IL-17A处理的情况下，通过计算再生类器官的比例来确定Lgr5类器官的生成能力。详细培养程序见补充信息。

RNA-seq分析
杀死三只健康对照和七只IBD（UC）小鼠、三只DKI小鼠和三只对照小鼠（基线条件），以及六只DKI小鼠和五只IR后的对照小鼠。从三只DKI小鼠和三只对照小鼠中分离出SI并液氮冷冻。从三只DKI小鼠和三只对照小鼠中分离出SI隐窝以区分类器官。从冷冻的SI组织或肠类器官中提取总RNA用于RNA测序（RNA-seq）40。详细方法在补充信息和补充表5中有描述。生物项目编号分别为：人类结肠组织的PRJNA1200789；小鼠组织的PRJNA1447506、PRJNA845965和PRJNA705806；以及类器官的PRJNA721570。

**ChIP测序**
DKI小鼠和其同窝对照小鼠的SI隐窝被分离后，使用simple-ChIP试剂盒按照制造商的协议（Cell Signaling Technology和New England Biolabs）进行染色质免疫沉淀（ChIP）。ChIP抗体列在补充表3中。详细方法在补充信息中有描述。生物项目编号为PRJNA1197577和PRJNA748855。

**scRNA-seq**
小鼠被处死后，SI被翻转，黏膜细胞被剥离并用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）11,42。细胞注释工具列在补充表5中。详细方法在补充信息中有描述。生物项目编号为PRJNA1180729。

**转录组分析**
用于转录组分析的生物项目编号包括：RNA-seq的PRJNA1200789、PRJNA1447506、PRJNA845965、PRJNA705806和PRJNA721570；ChIP测序的PRJNA1197577和PRJNA748855；以及scRNA-seq的PRJNA1180729。

**统计分析**
所有在类器官培养中呈现的数据至少代表三次重复实验的结果。实验中使用的脊椎动物总数超过五只，除非另有说明，否则为混合性别。所有数据均以平均值和标准误差（s.e.m.）的形式呈现，用于独立的双尾Student’s t检验或单因素方差分析（ANOVA）。所有数据编译均使用统计软件GraphPad Prism（7.0）完成。在t检验和方差分析中，P值小于或等于0.05被视为显著。

**结果**
**IBD–UC增加了结肠隐窝中的TCRγδ+STAT5+ T细胞**
通过FACS分析，我们检查了n=24例UC患者、n=21例克罗恩病患者和n=10例健康对照者的PBMCs（补充表1），发现UC患者的PBMCs中CD3+TCRγδ+ T细胞的频率显著增加，而克罗恩病患者则没有这种增加（补充图1a,b，数据未显示）。有趣的是，这些UC患者的CD3+CD4?CD8?TCRγδ+ T细胞显示出pYSTAT5的显著激活，表现为pYSTAT5+CD3+TCRγδ+ T细胞的频率显著增加（补充图1c,d）。与这些数据一致的是，健康对照者的结肠标本的HE和免疫组化（IH）检测显示，健康的隐窝中几乎没有淋巴细胞、CD3+或TCRγδ+ T细胞，而在UC患者的过度增生、炎症或隐窝炎隐窝中，这些细胞的数量显著增加（补充图1e和图1a–c），这一发现支持了隐窝TCRγδ+细胞在ISC再生中的积极作用。此外，免疫荧光（IF）检测显示，UC患者中部分浸润的隐窝CD3+ T细胞是TCRγδ+细胞，并且与STAT5染色共定位（补充图1e和图1d–f）。这些数据表明STAT5可能在招募TCRγδ+ T细胞进入ISC区域或隐窝基底方面起作用。重要的是，我们没有发现克罗恩病患者与对照组之间隐窝CD3+或TCRγδ+ T细胞的频率有显著差异（补充图1e,f），这表明隐窝TCRγδ+细胞群体可能是患者对UC诱导的隐窝炎症的保护性反应。

**图1：IBD–UC显示结肠隐窝中的TCRγδ T细胞增加，同时干细胞的多能性基因特征减少。**结果以平均值±标准误（mean ± s.e.m.）表示；n ≥ 50个隐窝，**P < 0.01，***P < 0.001，与STAT5Δ+++相比。在小鼠中耗尽四聚体STAT5会激活pYSTAT5并上调隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞中的IL-17A。通过结合免疫组化（IH）和共聚焦免疫荧光（confocal IF），我们发现LGR5-DKI小鼠的SI和结肠中的隐窝TCRγδ+ T细胞数量增加（图4a，b）。这些隐窝TCRγδ+ T细胞位于隐窝基部或Lgr5干细胞（ISCs）之间（图4b）。一致地，使用分离的隐窝细胞进行的FACS分析显示，LGR5-DKI SI或结肠中的隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞数量显著高于野生型（WT）对照组（图4c和补充图4b）。这些数据表明，耗尽四聚体STAT5可以增加隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞的数量。与WT相比，LGR5-DKI小鼠的SI或结肠中pYSTAT5+和/或IL-17A+CD3+TCRγδ隐窝细胞的频率增加（图4d，e）。值得注意的是，LGR5-DKI小鼠SI隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞内的IL-17A平均荧光强度增加（图4d）。随着四聚体STAT5的耗尽，CD3+TCRγδ隐窝细胞中pYSTAT5和IL-17A的上调（图4d，e），隐窝中的Lgr5+和潘内特细胞（Paneth cells）数量也增加（图2a和3b）。然后我们询问这些隐窝T细胞是否从淋巴管（LP）迁移而来。使用温和的MACS分离器分离肠道LP细胞，我们进行了FACS分析，检测CD3、CD4、CD8、TCRγδ、pYSTAT5和IL-17A，以识别LP中的CD3+CD4?CD8?TCRγδ+IL-17A+、CD3+CD4?CD8?TCRγδ+pYSTAT5+和CD3+CD4?CD8?TCRγδ+IL-17A+pYSTAT5+细胞。如图4f–i所示，LP IL-17A+TCRγδ+细胞和IL-17A+pYSTAT5+ TCRγδ+细胞的频率显著高于对照组小鼠，这表明隐窝TCRγδ T细胞从LP迁移而来。总之，这些数据表明，耗尽四聚体STAT5会激活STAT5，导致CD3+TCRγδ+隐窝细胞从LP迁移，这可能通过分泌IL-17A促进Lgr5 ISC的再生。这些数据还表明，二聚体STAT5的激活在隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞中起直接作用，而抑制性的四聚体STAT5则受到抑制。

图4：在小鼠中耗尽四聚体STAT5显著增加了隐窝IL-17A+TCRγδ+ T细胞的数量。

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a. 来自5只Lgr5-DKI和5只Lgr5对照（Con）小鼠的SI和结肠（Co）切片用TCRγδ IH染色。TCRγδ+隐窝T细胞的数量分为‘0’（无TCRγδ+ T细胞）、‘1’（一个TCRγδ+ T细胞）、‘2’（两个TCRγδ+ T细胞）和‘3’（三个TCRγδ+ T细胞）。结果以平均值±标准误表示。
b. SI或Co切片用IF染色显示Lgr5+ ISCs（绿色）和隐窝TCRγδ+ T细胞（红色）。星号表示隐窝内的TCRγδ+ T细胞。图像是用共聚焦显微镜捕获的。从5只Lgr5-DKI和5只Lgr5 Con小鼠中分离出SI和Co隐窝，并将其分散成单细胞。分散的IECs用抗-GFP、抗-CD3、抗-CD4和抗-TCRαβ以及抗-TCRγδ、抗-pYSTAT5和IL-17A FACS抗体染色。
c. 显示SI或Co隐窝中CD3+CD4?CD8-TCRγδ+细胞的散点图和频率。结果以平均值±标准误表示。**P < 0.01，与Lgr5-Con相比。
d. IL-17A的表达通过SI或Co隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞中的IL-17A+CD3+TCRγδ+细胞频率或IL-17A的平均荧光强度（MFI）来确定。显示了同型对照（iso）、Lgr5-Con和DKI的代表性FACS散点图。结果以平均值±标准误表示。**P < 0.01，与Lgr5 Con相比。
e. 通过SI或Co隐窝CD3+TCRγδ+ T细胞中pYSTAT5+IL-17A+的频率来确定隐窝IL-17A+TCRγδ+ T细胞中的pYSTAT5激活情况。显示了pYSTAT5和IL-17A的代表性散点图，结果以平均值±标准误表示。*P < 0.05或***P < 0.001，与Lgr5-Con相比。
f–i. 使用MACS分离器从4到5只Lgr5-Con或Lgr5-DKI小鼠中温和地分离LP细胞。用FACS分析标记了CD3、CD4、CD8、TCRγδ、pYSTAT5和IL-17A的LP细胞，以识别CD3+CD4?CD8-TCRγδ+IL-17A+、CD3+CD4?CD8?TCRγδ+pYSTAT5+（f）和CD3+CD4?CD8?TCRγδ+IL-17A+pYSTAT5+（h）细胞群体。展示了LP淋巴细胞中CD3+CD4-CD8-IL-17A+TCRγδ+细胞的频率（g）或TCRγδ+ LP T细胞中的IL-17A+pYSTAT5+细胞（i）的代表性散点图。结果以平均值±标准误表示。***P < 0.001，与Lgr5-Con相比。

在小鼠中耗尽四聚体STAT5可以保护ISCs免受IR或结肠炎损伤，并促进新的隐窝再生。为了进一步阐明STAT5四聚体化在形成隐窝TCRγδ T细胞微环境和ISC再生中的作用，我们用13-Gy电离辐射（IR）处理DKI和WT对照小鼠。HE染色和Ki67的IH显示，与对照组相比，DKI小鼠的再生隐窝显著增加，这可能表明DKI动物中的ISC再生增加（图5a）。值得注意的是，我们还检测到DKI隐窝中CD3+ T细胞和杯状细胞的数量显著增加（图5b和补充图5a），这表明隐窝T细胞在体内调节ISC再生中起积极作用。RNA-seq和GSEA分析进一步显示，IR处理的DKI小鼠表现出JAK–STAT的激活以及Th1、Th2和Th17细胞分化的增加，干细胞多能性途径，细胞因子-细胞因子受体相互作用，以及抗原处理和呈递的增加（图5c）。显著的是，DKI小鼠中包含TCRγδ+ T细胞的隐窝数量显著高于WT（图5d）。qPCR显示，IL-4、IL-6、IL-17和IL-27的表达增加，而IL-23、Lgr5和Metallothioneins（Mt1）的表达减少（图5e，f）。这些数据表明DKI小鼠中TCRγδ+ T细胞与抗原呈递细胞或干细胞之间的相互作用增强。一致地，使用两种DSS诱导的结肠炎模型（补充图5b(i)，特别是通过16天水恢复后的3个5天DSS周期，专门用于凋亡诱导的结肠ISC再生（补充图5c），我们发现耗尽STAT5四聚体显著增加了溃疡附近新生隐窝的再生，与WT对照组相比（图5g），这与结肠隐窝CD3+ T细胞的增加相吻合（图5h）。在这些再生的结肠隐窝中，IH显示DKI小鼠的结肠隐窝TCRγδ+ T细胞增加（图5i），这与IBD–UC结肠隐窝的情况一致，在那里出现了更多的隐窝淋巴细胞和TCRγδ+ T细胞（图1c，d和补充图1e）。这些数据表明，隐窝TCRγδ+ T细胞作为微环境帮助结肠ISC再生。

图5：在小鼠中耗尽四聚体STAT5可以保护ISCs免受IR或结肠炎损伤，并促进新的隐窝再生和隐窝CD3+或TCRγδ+ T细胞微环境的形成。

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a. 共有6只DKI和5只对照（Con）小鼠接受了13 Gy的IR处理。a. 在IR后3.5天，小鼠被杀死。SI切片用HE染色并用抗-Ki67抗体免疫染色；Ki67+隐窝计数为再生隐窝。
b. SI切片用抗-CD3抗体免疫染色并用AB复染；量化CD3+隐窝T细胞。结果以平均值±标准误表示；每组n = 5只小鼠，**P < 0.01，***P < 0.001，与Con相比。
c. 从6只DKI和5只Con小鼠的SI中提取RNA，并进行RNA-seq分析。热图显示了142个基因的层次聚类，ANOVA P < 0.05且表达倍数变化>2，DKI与Con小鼠相比（每组n = 5）。GSEA显示TH1、TH2和TH17的激活，以及TCR、IL-17、JAK–STAT和多能性途径的激活。
d. 从5只IR处理的DKI和5只Con小鼠的SI切片中用抗-TCRγδ IH免疫染色。再生隐窝中的TCRγδ+ T细胞数量分为‘0’（无TCRγδ+ T细胞）、‘1’（一个TCRγδ+ T细胞）、‘2’（两个TCRγδ+ T细胞）和‘≥3’（三个以上TCRγδ+ T细胞）。结果以平均值±标准误表示。
e. f，g. 从有或无IR处理的DKI和Con小鼠中分离出黏膜组织。提取总RNA，并通过qPCR测量TH1、TH2和TH17细胞因子（e）、Lgr5 ISC、潘内特细胞标记物和Mt1（f）的mRNA水平。结果以平均值±标准误表示；每组n = 5只小鼠，**P < 0.01，***P < 0.001，与Con相比。
h. 相同数量的DKI和WT Con小鼠分别接受了3个2.5% DSS处理，中间有10天的水恢复期（i）或7天DSS后有5天的水恢复期（ii），每组n = 5。
i，j. 小鼠被杀死。分离结肠组织，切片并用HE、Ki67 IH（g）和CD3 IH（h）染色。计数ISC干细胞区内的CD3-或Ki67阳性细胞数量。结果以平均值±标准误表示；n = 50个隐窝，**P < 0.01，与WT Con相比。刻度尺，200 μm。
k. 来自5只DKI和5只WT Con小鼠的连续切片接受了3个DSS处理，用TCRγδ IH染色。TCRγδ+隐窝T细胞的数量分为‘0’（无TCRγδ+ T细胞）、‘1’（一个TCRγδ+ T细胞）、‘2’（两个TCRγδ+ T细胞）和‘3’（三个以上TCRγδ+ T细胞）。结果显示了TCRγδ+ T细胞染色的代表性横截面。

与体内数据相反，来自DKI小鼠的DKI肠类器官（enteroids）表现出比WT肠类器官更低的生长。与WT肠类器官相比，DKI肠类器官的ISC增殖减少，IEC增生增加，表现为DKI肠类器官的出芽率降低和球体数量增加（图6a）。2-Gy IR对DKI肠类器官的增殖抑制作用比WT肠类器官更明显（图6b），表明耗尽STAT5四聚体会在体外内在地减少ISC增殖和再生。有趣的是，共聚焦IF分析显示，来自LGR5-DKI小鼠的肠类器官在隐窝基部有较少的EdU+ ISCs，在绒毛和TA区有更多的EdU+ IECs（图6c，d和补充图6a），表明STAT5四聚体的耗尽增加了前体细胞的增生。与这些数据一致，RNA-seq显示DKI肠类器官中的干细胞多能性降低，抗原处理和抗原呈递途径增强（图6e，f）。值得注意的是，直接从IR处理的DKI隐窝中分离出的培养基中的CD3+ T细胞增强了WT肠类器官的生长，表现为出芽率增加和球体数量减少（图6g，h和补充图6b）。这些数据表明，STAT5四聚体耗尽对Lgr5 ISC再生的体内效应是由于像隐窝TCRγδ+细胞这样的微环境细胞的作用。总的来说，这些数据表明STAT5四聚体的耗尽通过促进隐窝T细胞微环境的形成来驱动ISC再生，从而保护Lgr5+ ISCs免受损伤。STAT5四聚体化在IECs和T细胞中起相反的作用，DKI可能通过隐窝T细胞中的STAT5激活来介导ISC的体内再生。

图6：与对照组相比，四聚体STAT5缺陷的肠类器官在IR暴露下表现出更低的生长。

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a. 从DKI和对照（Con）小鼠的SI隐窝中分化出肠类器官。a. 使用一部分这些肠类器官来量化增殖和多倍性。结果以平均值±标准误表示；每组追踪并计数了>10个肠类器官，***P < 0.001，与Con相比。
b. 剩余的肠类器官在第五天暴露于2-Gy IR 10分钟，并允许再分化4天。从每组n = 10个肠类器官生成肠类器官出芽曲线，***P < 0.001，与Con+IR相比。
c. Lgr5-DKI和Lgr5CreER小鼠的肠类器官分化14天，并在第十天添加EdU。d. 分析EdU+ IECs或Lgr5+ ISCs；每组计数>10个肠类器官，*P < 0.05，**P < 0.01，与Con相比。
e. 分化后，肠类器官再分化7天，并提取RNA进行RNA-seq分析。热图和火山图显示了差异表达基因，倍数变化>2.0且P < 0.05；每组n = 3只小鼠。
f. GSEA显示TCR激活、干细胞多能性和抗原处理及抗原呈递途径的上调。
g. DKI和Con小鼠接受了13 Gy的IR处理。在IR后3.5天，小鼠被杀死。从DKI和Con小鼠的SI隐窝中分化出初级肠类器官，持续8天。DKI和WT Con的原始完整隐窝来源的肠类器官中的培养基被转移到WT Con的肠类器官中，共同培养6天，并确定了隐窝的萌芽数量和肠类器官的增殖情况。使用方差分析来分析用DKI和WT Con的转移培养基处理的两组之间的差异。结果以平均值±标准误差表示，*P<0.05，**P<0.01与Con相比。所有在类器官培养中呈现的数据至少代表三次重复实验。i–k，肠类器官来源于从Lgr5CreER小鼠中分离出的完整Lgr5隐窝。肠类器官用IL-17A（1、10或50 ng/ml）刺激6天。从第0天到第5天展示了肠类器官或IL-17处理样本的代表性GFP或GFP+DIC图像（i）。测量了用1 ng/ml或50 ng/ml处理的肠类器官中的Lgr5菌落形成或菌落生长（j），以及用1、10或50 ng/ml处理的肠类器官的萌芽曲线（k）。结果以平均值±标准误差表示，*P<0.05，与Lgr5-Con相比。l，在第5天收集肠类器官并提取总RNA。使用qPCR量化Lgr5、Atoh1、Lyz1、Olfm4和Ascl2的表达水平。结果以平均值±标准误差表示，与Lgr5-Con相比没有显著差异（NS），*P<0.05，**P<0.01或***P<0.0001，n=4–6。m，第5天用1 ng/ml或50 ng/ml处理的肠类器官与EdU孵育，然后收集并用甲醛（PFA）固定。10-μm厚的切片用抗GFP和EdU IF染色（m）。量化每个肠类器官隐窝中的Lgr5+、EdU+或Lgr5+EdU+细胞的数量；显示了散点图（n）。结果以平均值±标准误差表示，与Lgr5-Con相比没有显著差异（NS），*P<0.05或**P<0.01，n=4–6。IL-17A以双相、剂量依赖的方式促进了隐窝IEC的再生。我们的结果显示，耗尽四聚体STAT5会增加TCRγδ T细胞中IL-17A的表达，无论是在隐窝还是在LP中（图4d,f）。IL-17A在ISC中具有双重、依赖上下文的作用，通过转录因子ATOH114诱导Lgr5+ ISC分化为分泌细胞（杯状细胞、潘内特细胞、绒毛细胞），从而成为组织修复的关键促进剂。抑制IL-17A的分泌会加重IBD的严重程度。然而，在慢性炎症期间，过度的IL-17信号传导可能会 paradoxically 促进ISC的异常增殖或凋亡，突显了其与肠道稳态和疾病之间的复杂相互作用。尽管如此，目前仍不清楚IL-17A在何种剂量或时间点可以直接作用于Lgr5+ ISC或其他细胞类型的分化过程。为了解决这些问题，我们测试了不同剂量（1、10和50 ng/ml）的IL-17A对完整隐窝来源的类器官的影响，检查了Lgr5菌落形成效率、萌芽指数、ATOH1/LGR5程序和EdU掺入情况。使用从Lgr5CreER小鼠中分离出的完整Lgr5隐窝来源的肠类器官，我们用IL-17A（1、10或50 ng/ml）刺激这些肠类器官。如图6所示，1 ng/ml的IL-17A增加了Lgr5肠类器官的隐窝萌芽和Lgr5 ISC的增殖，这通过Lgr5-GFP菌落的形成和Lgr5+EdU+ ISC的数量得到证实（图6j,k,m,n）。相比之下，50 ng/ml的IL-17A促进了球状体的形成和类器官IEC的增殖，如图6i,k所示，以及补充图6c中的增殖情况，和图6m,n中的EdU染色结果。一致地，qPCR和IF结果显示，50 ng/ml的IL-17A可以显著增加Atoh1、Lyz1和Olfm4的表达，以及Lyz1+类器官IEC和Lgr5?EdU+球状体IEC的数量，同时减少了Lgr5和Ascl2的表达（图6l,n和补充图6d,e），表明较高剂量的IL-17A可以阻止Lgr5 ISC的自我更新并促进其向分泌谱系的分化。然而，使用用IL-17A处理的完整隐窝来源的肠类器官的数据也表明，IL-17A可能以不同的方式作用于Lgr5+或Olfm4+ ISC，或者增加Lgr5向Olfm4 ISC的转换，后者可以修复凋亡的IEC，这一点通过50 ng/ml的IL-17A抑制Lgr5同时增加Olfm4表达得到证实。通过整合scRNA-seq、GSEA和轨迹分析，我们进一步确定了STAT5四聚体的耗尽如何增强隐窝TCRγδ+ T细胞向ISC区域的迁移及其向 niche 细胞的分化，从而促进ISC的再生。STAT5四聚体的耗尽在单细胞水平上增加了隐窝T细胞与ISC的相互作用，推动它们形成具有修复能力的细胞群体。尽管据报道ISC通过MHC–TCR或E-钙粘蛋白-整合素αEβ7相互作用与T细胞进行交流，但在黏膜炎症期间异常表达的细胞因子背景下，ISC和T细胞之间的相互作用机制尚不清楚。为了解决这个问题，我们对分离出的SI黏膜细胞进行了scRNA-seq分析，并识别出32个SI细胞群体（图7a,b和补充图7a）。其中，群体23具有TCR基因特征，被定义为T细胞群体。群体11具有Lgr5 ISC基因特征，细胞周期活跃，被定义为ISC群体。群体1具有Lgr5 ISC和TCR细胞基因特征，Wnt和T细胞信号通路激活，被定义为ISC+T细胞群体（图7c–e和补充图7b,c）。群体1中的细胞具有强大的再生能力，TGF-β信号通路和先天免疫反应增强（补充图7d,e）。轨迹分析显示，群体23中的T细胞被驱动向群体1中的T细胞分化，表明群体1中的T细胞具有更强的功能或活性（图7f）。群体11中的干细胞被驱动向群体1中的干细胞分化，表明群体1中的细胞在细胞分裂、增殖和再生方面比群体11中的干细胞更活跃（图7g）。重要的是，与WT对照相比，GSEA分析显示，STAT5四聚体的耗尽导致T细胞群体中的TCR通路激活增强，JAK–STAT激活减少（群体23；图7h和补充图7f），Lgr5 ISC群体中的DNA复制增加（群体11；图7i），以及干细胞分裂、Notch和TLR信号通路增强，而异种移植排斥和细胞粘附信号通路在ISC和T细胞混合群体中减少（群体1；图7j,k和补充图7g–i）。这些数据表明，STAT5四聚体的耗尽可以增强群体1的再生能力。有趣的是，除了Lgr5之外，IL-17RA在群体1中也增加（图7l）。与WT对照的群体1相比，TCRγδ细胞的调控基因（如Sox13、Rorc和Cd3e）增加，而调节ISC的基因（如Lgr5、Olfm4和IL-17RA）在DKI的群体1中上调，表明群体1中的ISC功能可能通过IL-17RA得到增强（图7m和补充图7j）。轨迹分析显示，STAT5四聚体的耗尽促进了群体23中的T细胞或群体11中的Lgr5 ISC向T细胞和Lgr5 ISC群体的转换（图7n）。综上所述，我们证明了STAT5四聚体的耗尽增强了TCRγδ T细胞对Lgr5+ ISC的作用，可能是通过激活T细胞中的Notch信号通路和ISC中的Wnt信号通路。这种效应可能与潘内特细胞合作，在黏膜炎症期间促进Lgr5 ISC的再生和修复。图7：STAT5四聚体的耗尽在单细胞水平上增加了隐窝T细胞与ISC的相互作用。这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。完整大小的图片来自三只DKI和三只WT对照（Con）小鼠的SI黏膜细胞被分离成单个细胞，每个样本分析了13,000个单个细胞，通过scRNA-seq进行分析。a、b，共注释并聚类为32种肠道细胞类型，适用于DKI和Con小鼠。a 肠道细胞被注释为32种细胞群体。b Con或DKI小鼠中分别有32种群体。箭头显示Con和DKI小鼠中的群体1、11或23。c、GSEA分析显示，与其它群体相比，群体23中的TCR信号通路显著激活，同时CD3、PI3K、NFκB和MAPK基因显著上调。d、e，与其它群体相比，群体1中的细胞周期信号显著上调（d），Wnt信号通路增强，TCF7L2、WNT3和AXIN2基因强烈激活（e）。显示了标准化富集分数（NES）和调整后的P值。轨迹分析按细胞状态进行，显示了细胞分化和成熟的路径。f、群体23中的T细胞通过顺序细胞状态1–2–4或1–3分化为群体1中的T细胞。箭头显示了T细胞分化的方向。g、群体11中的干细胞通过细胞状态1–2被驱动向群体1中的干细胞分化。箭头指示了干细胞分化的方向。h–k、与WT Con相比，GSEA分析显示DKI在T细胞群体（群体23）中表现出显著的TCR信号激活（h），干细胞群体（群体11）中的DNA复制增加（i），干细胞分裂增强（j）和干细胞及T细胞混合群体（群体1）中的Notch激活增强（k）；显示了NES和调整后的P值。l、与其它群体相比，群体11和1中的Lgr5和IL-17RA基因高度富集。m、与WT Con相比，DKI在群体1中显示出Sox13、Rorc、Lgr5和IL-17RA基因的增加。显示了代表性的小提琴图和散点图。n、伪时间轨迹分析显示，DKI中的群体23或11中的细胞状态向群体1的进展比WT Con更快更强，表明DKI增强了群体11或23向群体1的转换。o、耗尽STAT5四聚体促进了具有强大修复能力的Lgr5 ISC和T细胞群体的形成。p、使用Loupe分析32个群体，Lgr5和IL17RA在群体1中高度富集，表明其中含有大量ISC。Trdc和Cd3e在群体1中高度富集，表明其中含有大量ISC和TCRγδ T细胞。q、群体1进一步分为五个群体：0–4。r、气泡图显示了从群体1分离出的不同群体中Lgr5、Cd3e、Olfm4、Cd3d、Cd3e、MKi67和Trdc的表达。s–v、与WT Con相比，GSEA分析显示DKI在群体0中显著激活了TLR（s），DKI中细胞粘附通路显著上调（t），与Con相比细胞周期通路显著上调（u），以及群体2中的TCR通路显著上调（v）。为了验证我们的假设，我们进一步分析了群体1，并使用特定标记物检查了Lgr5细胞和T细胞中的基因表达：Lgr5和IL-17RA用于隐窝Lgr5细胞，Cd3e和Trdc用于TCRδ T细胞。我们的结果确认群体1是一个混合群体，包括Lgr5细胞和TCRδ T细胞（图7p）。我们将群体1分为五个亚群体（群体0、1、2、3和4；图7q）。我们确定群体0代表Lgr5 ISC和TCRγδ T细胞，如图7r所示，由Lgr5、Cd3d和Trdc标记。DKI群体0中的TLR信号通路与对照组相比显著上调，表明DKI中的修复活性增加（图7s）。群体1被定义为Lgr5 ISC，并以Lgr5为特征。DKI群体1中的细胞粘附增加，而细胞周期减少，表明群体1中的Lgr5和T细胞粘附倾向增强（图7t,u）。群体2以Trdc和TCR信号通路增强为特征，表明T细胞功能激活（图7v）。接下来我们确定了在STAT5四聚体耗尽后，隐窝TCRγδ细胞如何分化和从黏膜迁移。四聚体STAT5缺陷的小鼠显示出STAT5与Mt1基因的结合减少，从而缓解了TCRγδ细胞的分化和向隐窝的迁移。金属硫蛋白1（MT1）蛋白可以抑制T调节型1（TR1）和TH17细胞的分化，同时调节CD4+ T细胞向Treg细胞的分化。有趣的是，MT1可以被释放到细胞外基质中以刺激炎症。尽管对M1的调控和功能了解不多，但Mt1主要在T细胞中表达。ChIP测序和qPCR分析显示，在标准条件下，STAT5能够高度结合到Mt1位点。相比之下，STAT5四聚体的耗竭显著降低了STAT5在Mt1位点的结合（图8b,c），这表明STAT5四聚体的耗竭导致STAT5对Mt1活性的抑制作用减弱。有趣的是，由STAT5四聚体耗竭招募的H3K4Me3在Mt1启动子上的表达略有上调（补充图8），这表明STAT5四聚体引起的Mt1活性抑制可能是由于Mt1启动子与增强子或沉默子之间的长距离相互作用形成了抑制性染色质。从对照组和DKI样本中提取的隐窝RNA进行qPCR分析显示，DKI中的Mt1表达显著高于对照组（图8d）。这些数据表明，在STAT5四聚体耗竭的情况下，STAT5与Mt1基因的结合减少，导致Mt1水平升高，从而促进T细胞迁移到隐窝ISC区域。

有趣的是，MT1可以被释放到细胞外基质中以刺激炎症。尽管对M1的调控和功能了解不多，但Mt1主要在T细胞中表达。ChIP测序和qPCR分析显示，在标准条件下，STAT5能够高度结合到Mt1位点。相比之下，STAT5四聚体的耗竭显著降低了STAT5在Mt1位点的结合（图8b,c），这表明STAT5四聚体的耗竭导致STAT5对Mt1活性的抑制作用减弱。有趣的是，由STAT5四聚体耗竭招募的H3K4Me3在Mt1启动子上的表达略有上调（补充图8），这表明STAT5四聚体引起的Mt1活性抑制可能是由于Mt1启动子与增强子或沉默子之间的长距离相互作用形成了抑制性染色质。从对照组和DKI样本中提取的隐窝RNA进行qPCR分析显示，DKI中的Mt1表达显著高于对照组（图8d）。这些数据表明，在STAT5四聚体耗竭的情况下，STAT5与Mt1基因的结合减少，导致Mt1水平升高，从而促进T细胞迁移到隐窝ISC区域。

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**问题**
目前对于炎症期间ISC的调控机制了解甚少，这导致了缺乏针对IBD的有效治疗药物。在IBD（尤其是UC）期间，上皮内T淋巴细胞调节IEC的修复并促进其向隐窝迁移。然而，T淋巴细胞是否能够保护ISC仍不清楚。STAT5可以形成二聚体和四聚体，这些结构对T细胞成熟和ISC再生至关重要，但四聚体STAT5在免疫介导的胃肠道再生修复过程中的具体功能尚不明确。

**结果**
我们的研究发现，与健康患者相比，IBD-UC患者的隐窝中STAT5+TCRγδ+ T细胞数量增加。隐窝内的TCRγδ T细胞能够形成有利于ISC再生的免疫微环境。STAT5的二聚体形成会抑制四聚体的形成，从而促进TCRγδ T细胞微环境的形成。减少四聚体STAT5的数量可以降低STAT5与金属硫蛋白1（Mt1）基因位点的结合，解除对Mt1的抑制作用，促使隐窝中的TCRδ+ T细胞分泌IL-17A，进而增强ISC的再生。

**意义**
我们的数据表明隐窝内的TCRγδ T细胞是一种新的免疫微环境细胞类型。四聚体STAT5会抑制隐窝T细胞微环境的形成，而阻断STAT5的四聚体形成则能促进隐窝TCRγδ细胞的扩增，为IBD-UC期间ISC的再生修复提供了一个潜在的治疗靶点。