TDP43在细胞质中的错误定位会引发线粒体功能障碍，并在椎间盘退化过程中促进细胞间衰老现象的扩散

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：TDP43 cytoplasmic mislocalization initiates mitochondrial dysfunction and intercellular senescence propagation in intervertebral disc degeneration

　　摘要
椎间盘退变（IDD）是导致腰痛的主要原因之一，其过程涉及髓核（NP）细胞的渐进性功能障碍和细胞外基质（ECM）的降解。IDD的病理机制仍然复杂，尚未得到全面阐明。本研究通过分析人类临床样本和啮齿动物模型，确定RNA结合蛋白TDP43是IDD发病机制的核心驱动因素。我们发现TDP43的表达程度与椎间盘退变程度成正比，并在退变的NP细胞线粒体中异常积累。这种线粒体定位异常会引发核孔复合体功能障碍、线粒体膜电位崩溃以及细胞不可逆的衰老。重要的是，TDP43通过线粒体衍生的囊泡分泌，这些囊泡作为细胞间介质，将促炎细胞因子和衰老表型传递给邻近的NP细胞。无论是基因还是药物抑制囊泡中的TDP43，都能有效减轻线粒体功能障碍，减少细胞衰老，并最终在体内和体外减缓IDD的进展。我们的发现表明，TDP43负载的线粒体衍生囊泡是细胞间病理的新介质，并将TDP43作为IDD干预的治疗靶点。

引言
椎间盘退变（IDD）是慢性腰痛的主要原因之一，其病理生理机制复杂多样。椎间盘由髓核（NP）、纤维环（AF）和软骨终板组成，其中髓核在维持生物力学稳态中起关键作用。压力因素如营养供应减少、缺氧、乳酸积累和持续机械负荷会导致NP细胞损伤。NP细胞的渐进性功能障碍和ECM的降解最终会导致椎间盘弹性和结构完整性的丧失。值得注意的是，退变的椎间盘中存在大量衰老和纤维化的NP细胞，这些细胞会分泌促炎细胞因子，加剧ECM的分解。其中，线粒体功能障碍与细胞炎症密切相关，是IDD发生和进展的关键病理机制之一。然而，IDD的病理过程非常复杂，受到多种内在和外在因素的影响。通过比较正常NP细胞和退变NP细胞，可以阐明IDD进展的分子途径并确定治疗靶点。近年来，越来越多的研究表明RNA结合蛋白（RBPs）在疾病发病机制中起着关键作用。RBPs与蛋白质编码基因、信使RNA和非编码RNA相互作用，发挥多种生物学功能，包括调节mRNA稳定性和调控非编码RNA的合成。新证据表明，多种RBPs参与了NP功能的调节和IDD的进展。识别调控椎间盘退变的关键RBPs有助于发现新的治疗靶点以进行分子干预。

TDP43（TAR DNA结合蛋白43）是一种广泛表达的核内RBP，主要参与转录后调控、RNA剪接和RNA运输。最新研究表明，TDP43的异常聚集和功能障碍与神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆和阿尔茨海默病）密切相关。TDP43通过调节多种炎症介质的稳定性来调控炎症反应，而其病理聚集会破坏正常的细胞代谢过程，导致细胞功能障碍和死亡。研究表明，在病理条件下，TDP43的亚细胞定位发生改变，细胞质中的积累会导致细胞器功能受损。然而，据我们所知，TDP43在IDD中的确切作用和分子机制仍需进一步阐明。本研究通过比较转录组分析，发现TDP43在退变和受压的NP细胞中差异表达。结果表明，TDP43的表达水平与椎间盘退变程度呈正相关，且在线粒体中定位异常，这与线粒体功能障碍和细胞衰老有关。线粒体衍生的囊泡（MDVs）作为清除线粒体成分的选择性机制，在细胞间通讯和细胞稳态中起重要作用，影响来源细胞和周围细胞。我们旨在探讨MDVs是否在NP细胞的炎症和衰老过程中发挥作用。机制上，NP细胞会分泌富含TDP43的MDVs，这些囊泡在受体细胞中传播衰老表型并放大炎症反应。通过基因和药物抑制囊泡中的TDP43，可以在体外和体内减轻细胞衰老并减缓IDD的进展。我们的发现揭示了TDP43的病理作用，并将其作为IDD干预的新治疗靶点。

材料与方法
**组织样本**
所有实验均遵循华中科技大学同济医学院伦理委员会的批准政策和程序进行。人类NP样本来自脊柱融合手术中的椎间盘切除术。样本收集严格遵守《赫尔辛基宣言》，所有患者均签署了术前书面知情同意书。术前MRI扫描（每个等级12例）使用Pfirrmann分级系统（I-V级）对椎间盘退变程度进行分类：I级：均匀高信号（亮白色），表明水分保持完整；II级：NP/AF边界清晰，尽管出现不均匀性；III级：NP信号强度呈灰色，NP/AF边界完全丧失；IV级：明显低信号（深灰色/黑色），椎间隙开始变窄；V级：结构破坏，椎间隙消失，NP/AF结构不清。所有样本均立即用4%甲醛浸泡或液氮冷冻保存以供后续分析。

**细胞培养**
人类NP细胞通过酶解法从手术切除的NP样本中分离。原代细胞在含有15%胎牛血清（Cell-Box，中国）的完全培养基（DMEM/F-12）中培养，条件为37°C、5% CO2。分离过程包括：首先用PBS清洗三次以去除血液污染物；其次用无菌手术剪刀切割组织；第三步在37°C下用0.25% II型胶原酶孵育4小时，然后重复PBS清洗两次并离心250 × g 5分钟以沉淀消化后的细胞。最后，细胞重新悬浮在新鲜的DMEM/F-12培养基中，每72小时更换一次培养基。实验使用第二代（P2）细胞以减少长时间体外培养引起的表型漂移。

**统计分析**
数据分析使用GraphPad Prism 8（美国拉霍亚）进行，结果以平均值±标准差（SD）表示。组间差异采用双尾非配对t检验进行比较。多组分析使用单因素或双因素方差分析及Tukey事后检验。统计显著性阈值设为0.05水平（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，nsP ≥ 0.05）。

**补充材料**
详细的方法描述、实验材料和数据分析程序见补充材料部分。抗体和试剂的信息见补充表1。基因引物的信息见补充表2。

**结果**
**验证TDP43蛋白在NP细胞中的失调和亚细胞定位**
为了识别参与IDD的关键分子，我们对NP细胞在炎症刺激（IL-1β处理）和退变条件下的转录组进行了分析（图1a）。与对照组相比，IL-1β处理组有944个上调的差异表达基因，而退变组有381个上调的差异表达基因，其中53个基因在IL-1β处理和退变的NP细胞中同时上调（图1b）。通过GO和KEGG分析（补充图1a,b）对这些基因进行功能注释，发现6个基因与“细胞炎症”和“应激反应”相关。这6个基因在IL-1β处理和退变的NP细胞中均表现出一致的上调（图1c），其中TARDBP与退行性病变有显著关联。尽管IDD是一种常见的肌肉骨骼退行性疾病，但TARDBP在此中的作用尚不明确。我们建立了多种NP细胞损伤/应激模型（包括IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、叔丁基过氧化氢和营养剥夺），并评估了TARDBP的表达情况。TARDBP在所有细胞模型中的表达均显著升高（图1d），表明其在NP细胞退变中的重要性。

**TDP43在NP细胞中的表达增加**
蛋白质分析显示，与正常对照组相比，退变NP细胞中TDP43（由TARDBP编码）的表达增加，同时伴随着ECM的分解代谢（图1e）。在IL-1β诱导的炎症模型中，TDP43的上调与MMP9的表达升高同时发生（图1f）。免疫荧光证实退变NP细胞中TDP43的表达增加，并伴有明显的细胞质分布（图1g,h）。进一步的亚细胞定位研究表明，TDP43与线粒体（用TOMM22标记）显著共定位，而与溶酶体（LAMP1阳性）无明显共定位（图1i,j）。这表明TDP43在NP细胞线粒体上的病理积累，尽管其对线粒体功能的影响尚不清楚。总体而言，NP细胞损伤模型中TDP43表达的增加表明其参与了IDD的退行性过程。

**TDP43与椎间盘退变程度的相关性**
为了明确IDD进展过程中TDP43的表达情况，根据Pfirrmann分类将人类椎间盘样本分为不同退变等级。组织学分析显示，随着退变程度的增加，细胞数量逐渐减少，ECM丧失，纤维化程度增加（图2a）。免疫荧光显示TDP43的荧光强度随MRI等级升高而增加（图2b）。回归分析证实TDP43的平均荧光强度（MFI）与退变程度呈显著正相关（R2 = 0.5602，P < 0.0001；图2c）。平行转录定量显示TARDBP mRNA水平也显著升高（图2d），其与退变程度显著相关（R2 = 0.406，P < 0.0001；图2e）。Western blot进一步验证了高级别退变椎间盘中TDP43蛋白的表达显著增加（图2f）。

**大鼠IDD模型**
通过尾椎穿刺建立大鼠IDD模型，并通过NP、AF和软骨终板（CEP）组织的组织病理学评估进行分级。高级别退变表现为NP被纤维组织替代，纤维环层片断裂，CEP退变导致椎间盘高度显著降低（图2g）。免疫荧光证实退变程度较高的NP区域TDP43表达显著升高（图2h,i）。回归分析显示TDP43的MFI与退变程度呈显著正相关（R2 = 0.7696，P < 0.0001；图2j）。这些结果表明，在人类和大鼠的椎间盘退化模型中，TDP43的表达随着退化程度的增加而增加，这与组织病理学分级呈一致的正相关。TDP43在大鼠椎间盘退化中的致病作用和治疗干预

为了研究TDP43调节在椎间盘退化（IDD）中的治疗潜力，我们在大鼠尾部椎间盘穿刺模型中施用了特定的TDP43抑制剂（EN6和rTDR01）。穿刺引起的退化椎间盘表现出特征性的MRI发现，包括水分减少（通过T2信号强度降低证明）、MRI退化等级升高以及X射线/CT评估显示的椎间盘高度指数（DHI）下降（图3a,b）。在椎间盘内输送TDP43抑制剂后，定量成像分析显示出了显著的治疗效果：MRI退化等级明显降低，而DHI值与假对照组相比显著增加。组织学评估进一步证实了IDD组的退化加剧，表现为髓核（NP）耗竭、纤维环断裂和中央髓核（CEP）退化。相反，接受抑制剂治疗的组显示出减轻的组织损伤，退化评分显著降低（图3c,d）。免疫荧光分析验证了接受TDP43抑制剂处理的椎间盘内TDP43荧光强度的降低（图3e,f），从而功能上将TDP43的抑制与IDD进展的减缓联系起来。

图3：TDP43干预影响大鼠椎间盘退化的进程。

随后，我们将TDP43质粒转染到大鼠椎间盘中，并评估了椎间盘退化的程度。TDP43过表达组表现出较高的MRI退化等级和较低的DHI测量值，与空载体对照组相比（图3g,h）。组织学检查显示髓核组织严重退化：纤维组织替代了髓核组织，髓核与纤维环之间的边界消失，以及中央髓核硬化并形成骨赘（图3i）。定量组织学评分证实TDP43过表达组的退化程度显著更高（图3j），这与免疫荧光中TDP43荧光强度的升高相一致（图3k,l）。综上所述，这些发现确立TDP43是IDD中的核心致病介质，其抑制作用可以减缓退化过程，强调了其作为椎间盘退化治疗靶点的潜力。

在髓核细胞退化过程中，TDP43的核输出和线粒体定位

基于先前关于退化髓核细胞中TDP43表达升高及其线粒体定位增强的发现，我们分离了线粒体组分并量化了线粒体中的TDP43含量。免疫印迹显示退化髓核细胞线粒体内的TDP43积累显著增加（图4a），表明线粒体发生了病理性的分离。作为核转运蛋白（RBP），TDP43可能通过与线粒体转录本的结合来发挥调节功能。针对TDP43的RNA免疫沉淀实验显示它与多种线粒体RNA结合，包括ND1、ND3和ND6转录本，并且在退化髓核细胞中这种结合得到选择性增强（图4b）。随后使用ND6探针进行的生物素标记RNA沉淀实验进一步证实了TDP43与线粒体RNA的直接结合（图4c,d），表明线粒体中TDP43的积累可能损害了线粒体核酸代谢。

图4：TDP43倾向于在退化的髓核细胞中形成线粒体定位。

尽管在生理条件下TDP43主要定位于细胞核内，但其线粒体转运的机制仍不清楚。对TDP43结合蛋白的比较蛋白质组学分析在退化髓核细胞与正常髓核细胞中鉴定出了335种独特结合的蛋白（图4e）。其中，包括NUP153、NUP160和NUP205在内的多种核孔蛋白在退化髓核细胞中的核内丰度降低（图4f）。共免疫沉淀（Co-IP）实验相反地显示，在退化髓核细胞中TDP43与这些核孔蛋白的相互作用增强（图4g）。这些发现表明TDP43可能通过隔离核孔蛋白来破坏核孔复合体的完整性，从而促进其在细胞质中的错误定位。进一步的筛选发现TDP43与参与运输相关蛋白IST1（也称为CHMP8）的相互作用。共免疫沉淀实验证实了TDP43与IST1的持续结合（图4h），免疫荧光显示在退化细胞中它们的空间共定位（图4i）。为了功能上表征IST1，我们设计了针对IST1的小干扰RNA（siRNAs）并选择了最有效的siRNA（补充图2a）。用IST1-siRNA转染显著抑制了IST1蛋白的表达（图4j）。值得注意的是，IST1的敲低并未改变细胞内的总TDP43水平，但显著降低了线粒体中的TDP43含量（图4k），并伴随TDP43与TOMM22的共定位减少（图4l）。共免疫沉淀实验随后证实了IST1、TDP43和TOMM22之间的复合体形成（图4m），免疫荧光确认了它们的空间共定位（补充图2b）。总体而言，这些发现表明IST1促进了TDP43的线粒体转运，从而建立了TDP43与IDD期间线粒体功能障碍之间的机制联系。

为了确定TDP43在IDD中的致病贡献，我们评估了髓核细胞中的线粒体功能。退化细胞显示出明显的线粒体膜电位（MMP）降低以及线粒体去极化增加。使用TDP43抑制剂或siRNA进行干预后，MMP得到恢复，线粒体去极化显著抑制（图5a）。同时观察到衰老标志物的减弱，表现为TDP43敲低组中P53和P16蛋白表达的减少（图5b）。免疫荧光定量显示退化髓核细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例增加，其MFI也增强，这两者在TDP43抑制后均显著逆转（图5c,d）。流式细胞术进一步显示细胞周期停滞得到改善，表现为TDP43干预后G1/G0期细胞比例减少，S期细胞比例增加（图5e）。

此外，健康髓核细胞中TDP43的过表达损害了MMP并增加了去极化的线粒体组分（补充图3a），同时提高了P53和P16的表达（补充图3b）。SA-β-半乳糖苷酶活性（阳性细胞比例和MFI）在TDP43过表达组中显著增强（补充图3c,d），伴随着细胞周期延长，表现为G1/G0期细胞比例增加和S期细胞比例减少（补充图3e）。此外，我们构建了一个缺乏负责核输出的NES序列的突变TARDBP质粒（图5f）。与野生型相比，表达突变TDP43的细胞表现出MMP的恢复和线粒体去极化的减弱（图5g）。它还显示下调的P53/P16表达降低了SA-β-半乳糖苷酶的阳性和MFI（图5i,j），并减少了G1/G0期细胞比例和增加了S期细胞比例（图5k）。总之，这些结果表明TDP43在细胞质中的错误定位会引发线粒体功能障碍，加速细胞衰老，并破坏髓核细胞的细胞周期。

基于我们的发现，即病理性的TDP43在线粒体内积累会破坏生物能量代谢，我们研究了线粒体质量控制机制是否调节线粒体中的TDP43。鉴于线粒体外泡（MDVs）是关键的细胞器监视途径和细胞间信号传导途径，我们从正常和退化的髓核细胞中分离出了细胞外泡（EV）组分。免疫印迹显示来自退化髓核细胞的EV中TDP43富集（图6a）。尽管纳米粒子跟踪分析确认两组之间的泡体大小分布相似（补充图4a），但纳米级流式细胞术（NanoFCM）显示退化组中TDP43+ EV的比例显著增加（图6b）。此外，IL-1β刺激增加了EV中的TDP43含量（图6c）和总EV产量，尽管大小分布相似（补充图4b）。NanoFCM显示IL-1β处理组中TDP43+ EV的比例显著增加（图6d）。为了确定泡体中TDP43的亚细胞来源，我们使用免疫磁珠去除了EV组分中的TOMM22+ MDVs（图6e）。去除了TOMM22后，效果得到了验证，TOMM22? EV的比例降低（补充图4c）。重要的是，退化髓核来源的EV中的TDP43含量也随之减少（图6f），表明线粒体中的TDP43优先包装到MDVs中。

图6：线粒体中的TDP43被装载到线粒体来源的泡体中。

我们的Co-IP结果确认了MIRO1/MIRO2与TOMM22在正常和退化髓核细胞中的物理相互作用（图6g）。这种相互作用通过免疫荧光在亚细胞水平上得到了空间上的证实（图6h）。当MIRO1/MIRO2的功能受损时，随后分离出的外泌体（EVs）显示与对照组相比，TOM22和TDP43融入囊泡部分的程度显著降低（图6i）。与此结果一致的是，NanoFCM定量分析显示MIRO1/MIRO2敲低组中TDP43+ EV亚群显著减少（图6j）。这些发现明确证明了线粒体衍生的囊泡（MDVs）是线粒体TDP43的调节性处置途径，这一过程通过MIRO1/MIRO2指导的货物封装来实现。

TDP43装载的MDVs对NP细胞退化过程中的细胞炎症和衰老的影响
利用TOMM22免疫磁分离结合定量质谱分析（图7a），我们发现退化NP细胞中的MDVs与健康对照组相比有393种蛋白质上调和387种蛋白质下调（补充图5a）。生物信息学富集分析显示，这些差异表达的蛋白质主要是与细胞外空间、细胞外基质（ECM）和多囊泡体相关的分泌蛋白（补充图5b），其中与线粒体功能密切相关的成分占比较高（补充图5c）。GO分析进一步表明这些MDVs参与了ECM的解体、蛋白质分解和炎症级联反应（图7b）——这些都是导致IDD（椎间盘退化）的核心途径，表明它们在疾病进展中起积极作用。值得注意的是，来自退化细胞的MDVs会触发促炎细胞因子的剂量依赖性分泌（IL-1β、TNF-α和IL-6），并在受体NP细胞中上调衰老标志物P53/P16（补充图6a,b）。这些效应通过β-半乳糖苷酶活性的升高和G1/G0期停滞得到证实（补充图6c,d）。这表明来自退化NP细胞的MDVs会促进细胞衰老并加剧炎症反应。

图7：TDP43装载的MDVs促进细胞炎症和衰老。

关于这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。

完整尺寸图片：
a 线粒体衍生囊泡（MDV）的分离和分析工作流程。
b 不同表达的MDV蛋白的GO富集分析（退化核 pulposus（NP）与正常NP）。
c 细胞外囊泡（EV）部分中TDP43和TOMM22的Western blot及相对蛋白水平。EVs来自转染了si-TDP43或si-scr的NP细胞（EVsi-TDP43或EVsi-scr）。
d EV部分中TDP43-FITC和TOMM22-APC的纳米级流式细胞术分析。
e 接受EVsi-TDP43或EVsi-scr处理的NP细胞中分泌的IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度。
f 各组中P53和P16的Western blot及相对蛋白水平。
g,h 各组中β-半乳糖苷酶的免疫荧光图像、阳性细胞率和平均荧光强度（MFI）。
i EV部分中TDP43和TOMM22的Western blot及相对蛋白水平。EVs来自转染了EN6或rTRD01的NP细胞（EVEN6或EVrTRD01）。
j EV部分中TDP43-FITC和TOMM22-APC的纳米级流式细胞术分析。
k 接受EVEN6或EVrTRD01处理的NP细胞中分泌的IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度。
l 各组中P53和P16的Western blot及相对蛋白水平。
m,n 各组中β-半乳糖苷酶的免疫荧光图像、阳性细胞率和MFI。数据以平均值±标准差（n=3次独立实验）显示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，通过单因素方差分析得出。

为了剖析TDP43特异性病理，我们通过siRNA转染从TDP53耗尽的NP细胞（EVsi-TDP43）生成了MDVs。EVsi-TDP43显示出显著减少的TDP43货物（图7c）和减少的TOMM22+/TDP43+ EV亚群（图7d）。关键的是，EVsi-TDP43减弱了促炎细胞因子的分泌（图7e），抑制了P53/P16的表达（图7f），降低了β-半乳糖苷酶的阳性率（图7g,h），并减轻了G1/G0期的停滞（补充图6e）。相比之下，我们用两种TDP43抑制剂处理NP细胞，得到了它们的MDV成分（分别为EVEN6和EVrTRD01）。与对照EVs相比，EVEN6和EVrTRD01都显示出显著降低的TDP43货物水平（图7i）和减少的TDP43? EV比例（图7j）。此外，这些MDVs在受体NP细胞中减弱了促炎细胞因子的分泌（图7k），同时下调了P53和P16的蛋白表达（图7l），并降低了β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例及其荧光强度（图7m,n）。流式细胞术进一步显示EVEN6和EVrTRD01组中G1/G0期的停滞得到缓解，S期进展得到恢复（补充图6f）。总体而言，这些发现表明退化的NP细胞释放富含TDP43的MDVs，这些MDVs作为细胞间致病介质，传播炎症性衰老并加剧椎间盘退化。

讨论
本研究通过比较退化和受压NP细胞与正常NP细胞的转录组分析，确定TDP43是IDD（椎间盘退化）的关键中介因子。在退化的人类和动物NP组织中，TDP43表达升高与椎间盘退化的严重程度相关。从机制上讲，TDP43的异常细胞质定位，特别是在线粒体中的积累，是NP细胞功能障碍的关键因素。TDP43的线粒体错位与核孔复合体的损伤有关，导致MMP（基质金属蛋白酶）崩溃和细胞衰老。值得注意的是，含有TDP43的MDVs被确定为一种潜在的线粒体质量控制途径，有助于将细胞质中的TDP43排出细胞外。然而，这些装载了TDP43的MDVs在受体NP细胞中促进了炎症表型并加速了衰老。重要的是，抑制TDP43可以缓解NP细胞中的线粒体功能障碍和衰老，突显了其作为IDD干预的分子靶点的治疗潜力（图8）。

图8：TDP43的细胞质定位促进线粒体功能障碍和椎间盘退化。

示意图说明了TDP43在细胞内的积累，并阐明了TDP43含量的线粒体衍生囊泡（MDVs）的生物发生机制，这些囊泡被NP细胞内化后会引起椎间盘退化。IDD代表一个多因素的退化过程，涉及复杂的生物力学和分子相互作用。作为脊柱的主要减震结构，椎间盘退化与慢性腰痛和神经压迫症状密切相关。累积的证据表明，多种应力刺激参与了IDD的发病机制。慢性机械过载通过破坏胶原纤维和蛋白多糖的合成与降解平衡，扰乱了ECM的稳态。氧化应激，表现为活性氧的过度积累，对NP细胞内的DNA、蛋白质和脂质造成大分子损伤，同时激活促炎级联反应（例如IL-1β和TNF-α），加剧了ECM的分解。其他应力因素，包括营养缺乏、酸性微环境和内质网应力，共同驱动NP细胞向凋亡和衰老表型发展，最终加速结构破坏。这些应力的协同效应形成了一个自我延续的细胞稳态破坏循环，推动了不可逆的IDD进展。本研究重点关注与TDP43相关的线粒体损伤。它揭示了TDP43在线粒体中的积累会导致线粒体功能障碍。线粒体功能障碍已被证明会诱导细胞衰老和促炎细胞因子的分泌，这与现有文献中描述的退化NP细胞在各种应力环境下的变化一致。总之，IDD的分子机制非常复杂，需要进一步深入探索以发现额外的潜在机制，从而有助于确定有效的治疗靶点。

RNA结合蛋白（RBPs）作为转录后基因表达的主要调节因子，最近被确定为IDD病理生理学中的关键参与者。通过调节RNA的稳定性、定位和翻译效率，RBPs协调细胞应激反应、增殖和凋亡。在退化的椎间盘中，RBPs的表达失调与异常的应激信号传导相关。根据Shao等人的研究，人类抗原R（HuR）通过与AU富集元件的结合来稳定NKRF mRNA，从而抑制NP细胞中的炎症和ECM降解。缺乏HuR的NP细胞倾向于表现出炎症表型。RBP FUS也被发现可以与重组生长因子GRB10前体mRNA结合，调节circRNA的合成，进而通过circRNA–miRNA轴调节NP细胞中的ECM代谢。然而，慢性应力会诱导RBPs病理性聚集形成应力颗粒，破坏核酸代谢。FUS在DNA损伤部位和细胞质中形成液状区室。这些液状区室发生异常相变并形成聚集体，这是肌萎缩侧索硬化症发展的核心机制。TDP43在细胞质中的聚集是肌萎缩侧索硬化症的常见病理特征。根据Wang等人的研究，TDP43与人类运动神经元中的线粒体共定位并在线粒体内积累。这种线粒体中的TDP43积累抑制了线粒体mRNA的翻译，从而损害线粒体功能和形态。与先前的研究一致，我们的研究也阐明了TDP43在NP细胞中的病理作用。具体来说，TDP43参与了细胞质中的异常聚集和核孔复合体的破坏。此外，TDP43在线粒体中的积累导致MMP的丢失和线粒体碎片化，最终导致线粒体功能障碍。

TDP43是一种与神经退行性疾病密切相关的RNA结合蛋白，其与IDD的关系尚不明确。TDP43从细胞核转移到细胞质并随后聚集会导致细胞毒性。此外，TDP43在细胞器中的异常积累会干扰其正常功能，导致细胞损伤。研究表明，TDP43的异常聚集可以显著改变线粒体的形态和功能。一项研究显示，TDP43可以转移到线粒体中并通过通透性转变孔诱导线粒体DNA释放，从而激活STING并引发细胞炎症。另一项研究进一步揭示，氧化应激促进TDP43和线粒体蛋白的聚集，这通过结合各种miRNAs调节基因表达，最终加剧线粒体应激。此外，TDP43对线粒体转录的RNA具有优先结合亲和力，抑制其翻译。同时，线粒体中的TDP43会破坏氧化磷酸化复合体I的组装，损害线粒体形态。线粒体通常被称为细胞的能量工厂，在能量产生中起着关键作用。线粒体功能障碍严重影响了细胞能量供应，这与细胞衰老密切相关。我们的研究表明，TDP43在退化NP细胞中优先结合线粒体RNA，包括ND6、COXI和COXIII。此外，线粒体中TDP43的积累导致MMP的丢失并引起细胞周期停滞。通过遗传或药物方法抑制TDP43，或阻止其细胞质定位，可以有效缓解NP细胞的衰老。这些发现强调了恢复线粒体功能在补充细胞能量供应和减缓细胞衰老方面的重要性。针对线粒体功能的调节可能成为IDD治疗的有希望的策略。

MDVs是从线粒体中释放的膜结合囊泡，作为线粒体质量控制机制，选择性地封装受损成分以通过严格调控的途径进行溶酶体降解或细胞外排出。与涉及整个线粒体降解的线粒体自噬不同，MDVs有助于针对性地处置特定的线粒体货物，如氧化蛋白或脂质，从而在应力条件下保持线粒体完整性。MDVs的形成受到PINK1和Parkin的负调控，这两种蛋白也参与线粒体自噬。有研究表明，Parkin通过将受损的线粒体内容物导向溶酶体来阻止MDVs的形成。重要的是，MDVs的形成似乎先于线粒体自噬，表明它是对线粒体损伤的早期保护反应。MDV生物发生的失调与多种病理状况有关，包括神经退行性疾病和心脏功能障碍，突显了其在维持细胞稳态中的重要性。然而，MDV生物发生的精确机制仍不清楚。最近的研究揭示了这一过程，表明MIRO1/2通过沿微管纤维生成膜突起来促进MDV的形成。MIRO1或MIRO2的缺失导致MDV数量显著减少。随后，GTP酶DRP1被招募参与这一过程，它在介导线粒体膜切割中起关键作用。Todkar等人还发现，optic atrophy 1和sorting nexin 9参与将受损线粒体内容物分类到MDVs中。我们的结果显示，来自退化NP细胞的MDVs中TDP43水平显著升高。这种上调与退化NP细胞中观察到的TDP43表达升高一致，表明其在线粒体质量控制调节中可能发挥作用。TDP43聚集的线粒体可能选择性地释放MDVs以减少TDP43含量。需要进一步研究来阐明MDV形成的分子机制及其与其他线粒体质量控制途径的相互作用。了解这些过程可能为与线粒体功能障碍相关的疾病提供新的治疗靶点。

MDVs在细胞间通讯和细胞稳态中起着重要作用，影响来源细胞和周围微环境。在宿主细胞内，MDVs作为选择性机制去除受损的线粒体成分，从而防止有毒物质的积累并维持线粒体功能。在宿主细胞外，MDVs可以释放到细胞外空间，在那里对邻近细胞产生旁分泌效应。这些囊泡携带线粒体成分和其他分子，这些分子可以调节细胞的生物过程，如炎症、代谢和应激反应54,55,56。例如，含有线粒体DNA的MDVs已被证明能够激活受体细胞中的先天免疫途径，这依赖于分选nexin 9（参考文献55）。因此，很明显MDVs作为关键的细胞间信号传导介质，促进了线粒体信号向邻近细胞以及远端组织和器官的传递。进一步的研究表明，含有线粒体损伤相关分子模式（包括N-甲酰肽、线粒体DNA和氧化蛋白）的MDVs在触发受体细胞中的特定促炎细胞因子反应中起着重要作用51。我们的研究表明，含有TDP43的MDVs（可能来源于线粒体TDP43聚集体）会促使受体神经前体（NP）细胞向促炎表型转变。我们发现，携带TDP43的MDVs会诱导NP细胞周期停滞，并刺激关键炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的分泌。这些发现表明，从退化的NP细胞释放的MDVs会破坏邻近NP细胞的正常功能，从而加速IDD（神经退行性疾病）的进展。因此，深入研究MDVs的机制及其与线粒体功能障碍的关系对于理解IDD的病理生理过程具有重要意义。需要进一步的研究来明确MDVs的分子组成、其释放机制及其对受体细胞的功能影响，这可能会揭示与线粒体功能障碍相关疾病的新治疗策略。

这项研究仍有几个未解决的问题需要进一步探讨。首先，TDP43如何精确地调控线粒体错位和核孔损伤的机制尚未完全阐明——特别是关于调节其病理转位的潜在共因子。其次，尽管含有TDP43的MDVs在体外能够促进炎症性衰老，但它们在体内的细胞间运输效率和生物分布尚未得到定量分析。开发用于体内应用的MDV分泌抑制剂对于提高动物模型实验结果的可靠性至关重要。第三，囊泡中TDP43转移的下游分子事件需要进一步研究，特别是其与已知的IDD介质之间的相互作用。解决这些空白将有助于增强治疗的转化效果。未来的研究将严格界定TDP43在IDD中的功能作用和致病机制。

总之，这项研究阐明了TDP43作为主调节因子，在IDD中调控线粒体功能障碍、细胞衰老和炎症级联反应的作用。上调的TDP43在线粒体中的错位会损害核孔的完整性，并触发NP细胞中的线粒体功能障碍，最终导致不可逆的细胞衰老。关键的是，TDP43会劫持线粒体的质量控制途径进入MDVs，将这些囊泡转变为跨细胞衰老和炎症传播的载体。在治疗方面，针对TDP43的靶向抑制能够恢复线粒体功能，抑制细胞衰老标志物，并延缓体内椎间盘的退化。这些发现不仅证实了含有TDP43的MDVs是椎间盘退化的致病性载体，还验证了TDP43干预作为IDD治疗策略的潜力。