EHMT2 通过表观遗传机制抑制 GADD45G，从而加剧血管重塑过程

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：EHMT2 aggravates vascular remodeling via epigenetic inhibition of GADD45G

　　摘要
常染色组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2）已被认为与心血管疾病有关，但其在血管重塑中的作用仍不完全清楚。在本研究中，我们利用颈动脉损伤模型和体外血管平滑肌细胞（VSMC）实验，探讨了EHMT2对血管损伤后VSMC增殖、迁移及新生内膜形成的影响。转录组（RNA测序）和表观基因组（CUT&Tag）分析显示，EHMT2在受损动脉和生长刺激的VSMC中表达升高，而EHMT2的缺失则减弱了损伤诱导的新生内膜形成。机制上，EHMT2的甲基转移酶活性促进了VSMC的增殖和迁移，通路分析表明细胞周期和生长相关通路是其主要下游靶点。我们进一步鉴定出GADD45G为受EHMT2调控的关键基因，该基因具有H3K9me2富集特征，并证实GADD45G通过抑制cyclinB1、cyclinD1、CDK2和CDK4来诱导G1期停滞。重要的是，无论是通过基因敲低还是使用EHMT2抑制剂BIX-01294进行药物抑制，均显著减少了损伤模型中的新生内膜病变。这些发现共同表明EHMT2通过抑制GADD45G并促进细胞周期进展，成为血管重塑的关键表观遗传驱动因子，提示其可能成为血管增生性疾病的潜在治疗靶点。

**转化医学视角**
本研究证实EHMT2在调节VSMC增殖和迁移以及促进损伤诱导的血管新生内膜形成中起关键作用。其机制是通过表观遗传途径，即在GADD45G位点对组蛋白H3的第9位赖氨酸（H3K9）进行二甲基化。总体而言，这些发现将EHMT2–GADD45G轴确定为预防或治疗病理性血管重塑的潜在治疗靶点。

**引言**
新生内膜形成（也称为内膜增生）是血管重塑的常见特征，包括血管成形术后狭窄、动脉粥样硬化和静脉旁路移植失败。大量证据表明，在血管重塑过程中，血管平滑肌细胞（VSMC）的表型从收缩型转变为合成型，同时表现出收缩蛋白表达下降和增殖及迁移能力增强。因此，深入了解VSMC增殖和迁移的机制对于开发新的血管病理学治疗方法至关重要。越来越多的证据强调了表观遗传修饰在VSMC增殖和新生内膜形成中的重要性。组蛋白甲基化是染色质空间结构的重要决定因素，而染色质构象和转录因子对DNA的访问性调节对VSMC的命运转变至关重要。然而，组蛋白甲基化修饰因子的性质及其在新生内膜形成过程中如何促进VSMC增殖仍不明确。常染色组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2），也称为G9a，是一种含有su(var)3-9/enhancer of zeste/trithorax（SET）结构域的蛋白质，具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性。EHMT2负责组蛋白H3的第9位赖氨酸的单甲基化和二甲基化（H3K9me1和H3K9me2），从而调控基因转录的激活或抑制。EHMT2参与细胞发育、多能性、增殖和迁移过程。异常的EHMT2表达常见于多种肿瘤，并促进癌症的发生和发展。最近的研究表明，EHMT2在心血管重塑中起关键作用，例如在人类晚期颈动脉粥样硬化斑块中EHMT2表达升高，EHMT2抑制剂可抑制动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。此外，EHMT2通过抑制自噬激活来抑制主动脉平滑肌细胞死亡。然而，EHMT2在血管新生内膜形成过程中对VSMC增殖的具体作用尚不清楚。本研究探讨了EHMT2在VSMC增殖和迁移调节以及血管内膜增生中的作用。小鼠中特异性敲除EHMT2可抑制钢丝损伤后的颈动脉新生内膜形成。体外和体内实验显示EHMT2调控VSMC的增殖和迁移。转录组和CUT&Tag分析表明，EHMT2通过直接催化GADD45G的H3K9二甲基化并消除GADD45G诱导的VSMC细胞周期停滞来发挥作用。我们的发现证明EHMT2在血管损伤后新生内膜形成过程中通过表观遗传机制调控GADD45G，从而发挥关键作用。

**材料与方法**
详细方法见补充信息。

**小鼠颈动脉钢丝损伤模型**
按照先前描述的方法对小鼠的颈动脉进行钢丝损伤16,17。具体操作如下：10–12周龄、体重25–30克的雄性小鼠通过吸入2%异氟烷麻醉。将一根0.38毫米的导丝（C-SF-15-15；Cook）通过颈动脉切口插入动脉腔内并朝向主动脉弓方向来回拉动五次。对照组小鼠不进行切口和导丝操作。小鼠每周腹腔注射一次5毫克/公斤的BIX-01294，持续28天18,19。使用二甲基亚砜处理的小鼠作为对照。腺相关病毒9（AAV）携带小鼠GADD45G小干扰RNA（siRNA，AAV-si-GADD45G）或阴性对照（AAV-siScrambled），由Genechem Biotech制备。将AAV-si-GADD45G滴度（5.0×10^12病毒颗粒/毫升）或阴性对照病毒注射到EHMT2敲除小鼠的尾静脉中20。

**大鼠颈动脉损伤模型**
按照先前描述的方法，通过球囊成形术诱导大鼠左颈动脉新生内膜形成21。操作在戊巴比妥（50毫克/公斤）麻醉下进行。为了剥离内皮，将一根2-Fr Fogarty球囊导管（Cordis）插入颈动脉，推进至主动脉弓，充气至适当阻力后逐渐撤回三次。未操作的大鼠颈动脉作为对照。按照先前描述的方法将慢病毒转染到损伤血管中22。具体操作为：将100微升sh-EHMT2慢病毒（1×10^8转导单位/毫升）和GFP慢病毒（1×10^8转导单位/毫升）（GeneChem，上海）注入损伤的颈动脉中并孵育30分钟以增强转染效果。移除慢病毒溶液后，结扎颈动脉以恢复血流。在指定时间点收集动脉样本。

**细胞培养**
按照先前描述的方法，从雄性Sprague–Dawley大鼠（150–180克）的胸主动脉中分离VSMC23。VSMC在含有10%胎牛血清、100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。使用传代3–8代、细胞密度约为80%的VSMC进行实验。

**载体构建和细胞转染**
携带EHMT2 cDNA及其变体p.Ala1130Ser、si-EHMT2、GADD45G cDNA和si-GADD45G的慢病毒颗粒由GeneChem公司提供。具体构建过程为：使用QuikChange II XL定向突变试剂盒（Agilent Tech）引入p.Ala1130Ser突变。体外转染时，将重组慢病毒在实验前72小时直接转染到VSMC中。siRNA转染时，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂按每孔20纳摩尔浓度转染六孔板中的VSMC。针对大鼠GADD45G、EHMT2和空白序列的siRNA由Sangon Biotech合成。

**RNA测序分析**
从四个独立样本中提取大鼠VSMC的总RNA进行RNA测序（RNA-seq），使用Majorbio Bio-Pharm Tech进行分析，差异基因表达分析采用DESeq2方法（调整后的P值<0.05且|倍数变化|>1.5）。随后进行基因本体（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析。

**CUT&Tag实验**
CUT&Tag实验使用Illumina公司的Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit（TD901-02，Vazyme）进行，具体操作见先前描述24。将100,000个细胞与活化过的Concanavalin A包被磁珠孵育。磁珠结合的细胞经通透处理后，依次与H3K9me2一抗（ab176882，Abcam）和二抗孵育。磁珠重新悬浮在含有pAG-Tn5的洗涤缓冲液中，然后进行标记反应。提取的DNA片段用于聚合酶链反应（PCR）扩增以制备DNA文库。CUT&Tag文库在Novogene公司的Illumina NovaSeq平台上进行测序。

**CUT&Tag数据分析**
CUT&Tag测序生成PE150序列数据。使用FASTQ文件处理原始测序数据的质量。使用Bowtie2将比对后的读段与大鼠基因组（美国国家生物技术信息中心参考基因组）对齐。使用samtools对齐后的读段进行索引和排序。使用Picard去除重复读段，使用MACS2进行峰值检测，排除大鼠基因组的黑名单区域。使用DeepTools计算感兴趣基因组的得分并生成热图。BigWig数据在Integrative Genomics Viewer（IGV）浏览器中查看。

**统计分析**
所有实验数据以平均值±标准误差表示。使用GraphPad Prism（GraphPad，版本9.4.0）进行统计分析。数据比较前先进行Shapiro–Wilk正态性检验。两组间的均值差异通过非配对双尾Student’s t检验或Mann–Whitney U检验进行分析。多组间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）或非参数Kruskal–Wallis检验。P值<0.05被认为具有统计学意义。

**结果**
**EHMT2在颈动脉新生内膜中的表达上调**
为探究EHMT2在VSMC增殖和新生内膜形成过程中的潜在作用，我们首先分析了大鼠球囊损伤颈动脉模型中的EHMT2表达。冰冻切片染色显示，EHMT2主要位于新生内膜中，在损伤后7天和14天，EHMT2在球囊损伤和钢丝损伤的颈动脉新生内膜中的表达显著上调（图1a和补充图1）。同时，我们发现EHMT2的mRNA水平在术后第7天显著升高，并持续到第28天（图1b）。类似地，EHMT2的蛋白质水平以及增殖标志物PCNA和p-H3在损伤后7天、14天和28天的球囊损伤颈动脉中显著升高（图1c）。

**图1：**损伤颈动脉中EHMT2的表达上调。

**补充说明**
a. 免疫荧光染色显示损伤后14天颈动脉中EHMT2和SM22α的表达（n=4）。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。比例尺为200微米。强度归一化为DAPI的强度。
b. 损伤后不同时间点大鼠颈动脉中EHMT2的mRNA相对水平（n=6）。mRNA水平归一化为β-actin的强度并进行量化。
c. 损伤后7天、14天和28天，通过Western blot检测球囊损伤大鼠颈动脉中EHMT2、PCNA和p-H3的相对蛋白质水平（n=4）。
d. 在不同浓度的PDGF-BB刺激下培养24小时的大鼠VSMC中，通过Western blot检测EHMT2的mRNA表达（n=4）。
e. 在20 ng/ml或40 ng/ml浓度下PDGF-BB刺激的大鼠VSMC中，通过Western blot检测EHMT2、PCNA和p-H3的相对蛋白质水平（n=4）。
f. 免疫荧光染色显示PDGF-BB刺激的大鼠VSMC中EHMT2的定位和表达（n=4）。细胞核用DAPI染色。比例尺为200微米。强度归一化为DAPI的强度。
g. 从GEO数据库中获取的PDGF-BB处理后的大鼠VSMC（n=3）和人VSMC（n=3）的EHMT2 mRNA水平进行定量分析。
h. 在20 ng/ml浓度下PDGF-BB刺激的培养VSMC（n=4）中，通过Western blot检测H3K9me2和EHMT2的蛋白质水平。数据以平均值±标准误差表示。P值通过非配对双尾t检验（a和f–h）或单因素方差分析（b–e）计算得出。

**体外验证**
为了在体外验证这些发现，我们分析了在增殖刺激下培养的大鼠VSMC中的EHMT2 mRNA表达。值得注意的是，血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）被认为是作用最强的促有丝分裂因子和趋化因子之一，在血管损伤后新生内膜形成中起核心作用25,26。在不同剂量的PDGF-BB刺激下，EHMT2 mRNA表达呈剂量依赖性上调（图1d）。PDGF-BB促进PCNA和p-H3的上调，并伴随培养大鼠VSMC中EHMT2蛋白质水平的剂量依赖性升高（图1e）。免疫荧光染色显示PDGF-BB刺激后EHMT2在细胞核中定位并进一步聚集（图1f）。我们的观察结果也在Gene Expression Omnibus数据集中得到验证：在GSE77280数据集中PDGF-BB刺激的人类VSMC和GSE241545数据集中的大鼠VSMC中，EHMT2 mRNA表达均上调（图1g）。与EHMT2的H3K9me2酶活性一致，PDGF-BB处理促进了VSMCs中EHMT2和H3K9me2的蛋白质表达（图1h）。这些结果共同表明，在合成的VSMCs和新内膜形成过程中，EHMT2表达异常上调。SMC特异性EHMT2缺陷可以减弱血管损伤后的新内膜形成。

为了研究EHMT2是否参与新内膜的形成，构建了SMC特异性EHMT2敲除小鼠，然后用钢丝损伤颈动脉（补充图2）。与对照组相比，SMC特异性EHMT2敲除小鼠在损伤后第14天的颈动脉中新内膜形成显著减少（图2a），新内膜面积（图2b）和新内膜厚度与中层厚度的比值（图2c）也有所降低；然而，中层面积没有明显变化（图2d）。

在大鼠颈动脉损伤模型中，局部递送携带EHMT2敲低序列或空载载体的慢病毒成功地实现了目标基因的敲低。与空载载体组相比，EHMT2敲低组在损伤后第14天的新内膜病变显著减少（图2e），这通过新内膜面积和中层厚度比值的降低得到证实（图2f,g）。此外，免疫荧光染色显示EHMT2敲低组的新内膜中PCNA和SM22α的表达减少（图2i,j），而Western blot分析进一步证实了SMC特异性EHMT2敲除降低了H3K9me2和PCNA的表达（图2k,l）。这些结果表明EHMT2是调节新内膜形成的重要因子。

为了验证上述体内观察结果，我们在体外研究了EHMT2对VSMC增殖的影响。siRNA有效敲低了VSMCs中的EHMT2表达（补充图3），EHMT2敲低显著抑制了H3K9me2和PCNA的表达，并伴随SM22α的表达上调（图3a）。Ki-67免疫荧光检测显示EHMT2敲低显著降低了VSMCs的增殖率（图3b）。细胞计数试剂盒（CCK-8）增殖实验也证实了EHMT2敲低阻断了PDGF-BB诱导的VSMC增殖（补充图4）。划痕实验和Transwell实验均表明EHMT2抑制了VSMCs的迁移能力（图3c,d）。此外，两种EHMT2抑制剂BIX-01294和UNC0642有效减弱了VSMCs中的EHMT2酶活性（补充图6和7a,b），并且EHMT2过表达部分逆转了这些抑制剂的抑制作用（补充图7）。这些观察结果共同表明EHMT2通过促进VSMCs的增殖和迁移来发挥作用。

为了阐明EHMT2在VSMCs中的功能，我们预测并突变了其催化结构域中的关键氨基酸，以确定其甲基转移酶活性是否是其功能的基础。根据已发表的EHMT2催化结构域与H3尾部的复合体结构，预测大鼠EHMT2中的Ala 1130（与人类Ala1077同源）可能是改变其催化活性的候选位点（图4a）。因此，将大鼠EHMT2中的Ala 1130替换为丝氨酸（p.Ala1130Ser；图4b）。携带p.Ala1130Ser变异体的慢病毒被转染到培养的大鼠VSMCs中，与EHMT2组相比，p.Ala1130Ser组的总H3K9me2水平显著降低（图4c），VSMC增殖标志物PCNA表达减少而收缩标志物SM22α表达增加（图4c）。划痕和Transwell实验均表明p.Ala1130Ser变体抑制了VSMCs的迁移能力（图4e,f）。总体而言，EHMT2对VSMCs增殖和迁移的调节作用依赖于其甲基转移酶活性。

通过RNA-seq分析，我们发现PDGF-BB处理的VSMCs中EHMT2表达上调，这影响了相关基因的表达模式（补充图9）。KEGG和GO分析显示EHMT2影响了多个与细胞增殖相关的通路（图5c,d）。这些数据进一步支持EHMT2促进VSMCs生长的观点。通过Venn图显示了在不同比较中唯一识别的差异表达基因（DEGs）的数量。热图显示了这些基因在转录组中的表达差异。通过KEGG和GO分析，确定了受EHMT2影响的增殖相关通路。IGV分析进一步证实了EHMT2在VSMCs中的调控作用。

为了明确EHMT2调节VSMCs增殖的机制，我们通过RNA-seq分析了PDGF-BB处理VSMCs时是否存在EHMT2 siRNA的情况。结果表明，PDGF-BB处理的VSMCs与同时接受PDGF-BB和EHMT2 siRNA处理的VSMCs之间存在显著的基因表达差异（图5a）。KEGG和GO分析揭示了多个受EHMT2影响的增殖相关通路。EHMT2的敲低减少了血管平滑肌细胞（VSMCs）中的H3K9me2信号，这从CUT&Tag数据的热图中可以明显看出（图5g），H3K9me2的结合位点减少了13,958个。为了进一步识别H3K9me2的潜在靶基因，我们将CUT&Tag数据中显示低甲基化的基因与RNA-seq分析中上调的基因进行了交叉分析。这种方法识别出了23个与H3K9me2结合峰相关的差异表达基因（DEGs）（图5h）。对这些23个DEGs进行与增殖相关功能的GO分析后，发现了四个候选基因：GADD45G、Bmp6、Nox4和Klf15（图5h）。随后对H3K9me2 CUT&Tag-seq峰进行基序分析，发现它们富集了与GADD45G和Klf15相关的典型基序（图5i），而IGV分析证实了H3K9me2确实结合在这些基因的启动子区域（图5j）。虽然已知Klf15能够维持VSMCs的收缩表型并抑制新生内膜的形成，但生物信息学分析表明EHMT2特异性地结合在GADD45G的启动子上（图5j）。这种结合在功能上是相关的，因为EHMT2的敲低减少了GADD45G启动子区域的H3K9me2富集（图5j）。基于这些发现，我们进行了染色质免疫沉淀后定量PCR（ChIP–qPCR）实验，结果证实EHMT2通过H3K9me2直接调控GADD45G的转录（图5k和补充图10）。综上所述，这些数据表明GADD45G是EHMT2介导的血管重塑过程中的一个下游靶基因。

GADD45G受EHMT2的负调控，在VSMCs增殖过程中诱导G1细胞周期停滞。为了验证EHMT2与GADD45G之间的关联，我们进一步研究了VSMCs中GADD45G的表达是否与EHMT2呈负相关。Western blot和逆转录qPCR结果显示，EHMT2的敲低增加了GADD45G的表达（图6a），而EHMT2的过表达则降低了GADD45G的表达（图6b）。在具有SMC特异性EHMT2缺陷的小鼠颈动脉中，GADD45G的表达升高（图6c）。免疫荧光染色显示GADD45G蛋白主要位于细胞质中（图6d）。结合CUT&Tag分析的结果，我们得出结论：GADD45G是VSMCs中由EHMT2介导的H3K9甲基化调控的靶基因。

图6：GADD45G调节VSMC细胞周期中的G1/S阶段转换。

尽管GADD45G被证明参与了多个与细胞生长相关的基因表达谱（GSEA）通路，但尚不清楚它是否也参与VSMCs的增殖过程。Western blot和免疫染色结果显示，在PDGF-BB刺激下以及气球损伤诱导的新生内膜中，GADD45G的表达被下调（图6e和补充图11）。GADD45G的敲低增加了Ki-67阳性VSMCs的数量（图6f）。VSMCs细胞周期的失调是内膜增生的一个普遍特征，被认为是抑制VSMCs增殖的潜在机制。通过流式细胞术分析，我们发现GADD45G的敲低增加了S期细胞的比例（图6g）。相比之下，过表达GADD45G的组中S期VSMCs的比例显著低于载体对照组（图6h）。此外，还检测了细胞周期标记物cyclin B1、cyclin D1、CDK2、CDK4和p21的表达。GADD45G的敲低抑制了p21的表达，并促进了cyclin B1、cyclin D1、CDK2和CDK4的表达（图6i）。GADD45G的过表达诱导了p21的表达，并降低了cyclin B1、cyclin D1、CDK2和CDK4的水平，导致VSMCs细胞周期停滞（图6j）。这些数据表明，受EHMT2调控的GADD45G能够将VSMCs细胞周期停滞在G1阶段，防止其进入S阶段。

EHMT2通过负调控GADD45G来调节VSMCs的增殖和迁移。为了确定GADD45G是否介导了EHMT2沉默所诱导的增殖抑制作用，我们在VSMCs中敲低了GADD45G。GADD45G的沉默消除了si-EHMT2对VSMCs增殖的抑制效应，这一点通过PCNA表达、EdU掺入和CCK-8分析得到了证实（图7a,b和补充图12）。同样，划痕实验和Transwell迁移实验也显示，同时敲低GADD45G和EHMT2可以恢复EHMT2敲低后VSMCs的迁移能力下降（图7c,d）。

图7：EHMT2通过负调控GADD45G来调节VSMCs的增殖和迁移。

鉴于GADD45G对细胞周期的调控作用，我们研究了EHMT2和GADD45G是否参与了VSMCs细胞周期停滞的过程。流式细胞术分析显示，EHMT2的敲低导致VSMCs进入G1细胞周期停滞，而转染GADD45G siRNA可以缓解这一效应（图7e）。细胞周期标记物的检测显示，EHMT2的敲低导致p21表达上调，而cyclin B1、cyclin D1、CDK2和CDK4的表达下调（图7f,g）。同时敲低GADD45G部分逆转了EHMT2单独沉默所引起的这些变化（图7f,g）。cyclin D1的免疫染色表明，GADD45G的敲低逆转了EHMT2敲低后cyclin D1的表达抑制（图7h）。综上所述，这些结果表明，GADD45G的表观遗传抑制是EHMT2介导的VSMCs增殖和迁移的重要下游机制。

为了测试EHMT2在血管重塑中的潜在治疗价值，我们使用BIX-01294药物抑制EHMT2，以评估其对内膜增生的影响。与遗传缺陷实验的结果一致，与对照组相比，BIX-01294处理后28天时新生内膜面积和内膜-介质比显著减少（图8a,b）。同时，BIX-01294处理后小鼠颈动脉中的H3K9me2和PCNA蛋白水平下调（补充图13）。

图8：针对EHMT2–GADD45G轴的潜在治疗效果。

此外，为了验证GADD45G在颈动脉损伤后新生内膜形成中的作用，我们将携带针对GADD45G siRNA的腺相关病毒通过静脉注射到EHMT2敲除小鼠的尾静脉中。我们发现，在损伤后14天，GADD45G的敲低显著恢复了新生内膜的形成（图8c,d），同时颈动脉中的PCNA和cyclin D1蛋白水平增加，而GADD45G和SM22α蛋白水平降低（图8e,f）。此外，GADD455的敲低减轻了EHMT2敲除后VSMCs的增殖抑制，这通过PCNA和cyclin D1的免疫荧光染色得到证实（图8g），表明GADD45G的过表达可能是治疗新生内膜形成的潜在策略。综上所述，EHMT2–GADD45轴为开发新的预防和治疗血管重塑策略提供了有希望的方向。在哺乳动物中，H3K9me2主要由EHMT2催化，而非EHMT1（GLP），并且在血管重塑过程中EHMT2的表达会上调。来自GEO数据库的数据以及我们研究中的观察结果（包括在PDGF刺激下和球囊诱导的颈动脉损伤后的血管平滑肌细胞VSMCs的数据）与先前关于人类颈动脉动脉粥样硬化病变中VSMCs中EHMT2表达上调的报告一致。H3K9me2减少与EHMT2增加之间的表面矛盾可能归因于组蛋白赖氨酸甲基化修饰因子之间微妙而复杂的平衡。此外，EHMT1（GLP）和EHMT2在结构上是同源的，并能形成一个功能性的异二聚体来催化H3K9me2。因此，当EHMT2被删除或下调时，EHMT1可能会部分补偿H3K9me2的缺失。为了更彻底地抑制H3K9me2，已经开发了针对EHMT1和EHMT2的遗传或药物策略。因此，在本研究中使用BIX-01294和UNC0642不能完全排除它们对EHMT1的潜在抑制作用。鉴于甲基化和去甲基化之间的动态平衡以及EHMT1和EHMT2之间的功能冗余，我们重点关注EHMT2以明确其在血管重塑中的具体作用。

据报道，表观遗传调控在VSMC分化和新生内膜形成过程中起着关键作用。DNA甲基化和DNA甲基转移酶在调节血管新生内膜形成和SMC可塑性方面起着核心作用。组蛋白修饰，特别是乙酰化和甲基化，已被证明是决定VSMC可塑性的重要因素。越来越多的证据表明，HDACs、组蛋白乙酰转移酶和甲基转移酶参与了损伤诱导的新生内膜增生。值得注意的是，组蛋白3的赖氨酸修饰参与了VSMC的可塑性。例如，VSMCs中H3K4me2的去除会导致分化丧失和收缩力下降，因为TET2的招募受到抑制。KDM3a（一种特异性H3K9me2去甲基化酶）的过表达会加速新生内膜的形成，而KDM3a的敲低则会减少新生内膜的形成。最近的研究还表明，主要由PRMT5介导的其他组蛋白精氨酸甲基化调节SMC标记基因的转录。这些研究揭示了组蛋白甲基化在VSMC增殖和迁移过程中的关键作用，促使我们探讨EHMT2及其组蛋白甲基转移酶活性是否也调节VSMC的增殖。

在本研究中，通过构建EHMT2SMCKO小鼠模型，我们发现EHMT2的缺失导致新生内膜形成减少。此外，EHMT2基因敲除或化学抑制后PCNA的表达下调和SM22α的表达上调表明，EHMT2的缺失抑制了SMC进入增殖状态。已有报道指出，EHMT2被转录因子BACH1招募，并促进BACH1介导的VSMC表型转换。我们的研究进一步提供了关于EHMT2如何参与VSMC增殖和新生内膜形成的明确而深入的证据。通过RNA-seq分析，我们发现除了与细胞周期和DNA合成相关的基因外，还有与细胞死亡和凋亡相关的基因，这些发现与EHMT2通过抑制自噬激活来抑制主动脉SMC死亡的观点一致。GO分析表明，EHMT2在SMCs中调节重要的生物过程，如细胞分化和发育、MAPK级联和JNK级联，这与EHMT2在癌细胞增殖中的已知作用一致。此外，EHMT2诱导的VSMC增殖所需的甲基转移酶活性可能表明基因沉默在SMC转分化和新生内膜形成过程中的重要性。

进一步的CUT&Tag筛选显示，GADD45G在其启动子区域的H3K9位点被双甲基化，可能作为EHMT2在血管重塑中作用的关键介质。据报道，GADD45G在细胞应激反应、DNA修复、自身免疫和细胞周期调节中起关键作用。具体来说，GADD45G作为一种新的肿瘤抑制因子，其缺乏会通过Janus激酶/信号转导子和转录激活因子3的激活显著促进肿瘤生长。GADD45G被广泛认为是一种肿瘤抑制因子，其缺失会通过JAK–STAT3途径促进肿瘤生长。除了JAK–STAT3途径外，GADD45G还可以通过多种信号级联途径抑制细胞增殖。例如，在髓系增生性肿瘤中，GADD45G被报道与RAC2结合以抑制RAC2–PAK1–PI3K/AKT轴。在急性髓系白血病中，GADD45G激活p38 MAPK，从而下调E2F1，导致DNA修复能力受损和增殖减少。此外，GADD45G可以与MAP3K4相互作用，调节星形胶质细胞中的p38磷酸化。然而，只有少数研究探讨了GADD45G在心血管疾病（CVD）中的作用。GADD45G可能参与心肌梗死后的心肌细胞死亡和左心室重塑。GADD45G的过表达会导致心脏形态和组织的显著改变，最终导致心脏重塑和心力衰竭。考虑到GADD45G在细胞应激反应和细胞周期调节中的作用，它可能调节VSMC的增殖和内膜增生。鉴于其在应激反应和细胞周期调节中的已知作用，推测GADD45G可能调节VSMC的增殖和内膜增生。其抗增殖作用与DNA损伤修复机制有关，并且可以以细胞类型特异的方式调节NF-κB依赖的炎症反应。总的来说，这些观察结果支持了一个更广泛的模型，即GADD45G作为DNA损伤修复、增殖信号和炎症途径的中心整合器，从而精细调节细胞增殖——可能包括血管重塑过程中的VSMCs。本研究表明，GADD45G作为VSMC增殖的抑制剂，因为GADD45G敲低后新生内膜增生加速。重要的是，我们首次提供了组蛋白甲基转移酶EHMT2对GADD45G的表观遗传调控的证据，表明EHMT2介导的GADD45G外显子上的H3K9me2富集抑制了其转录活性。总体而言，这些发现扩展了GADD45G在细胞增殖中的调控作用，将其在细胞周期控制中的已知作用与之前未被充分认识的血管环境联系起来。这些观察结果进一步确定了EHMT2–H3K9me2–GADD45G轴作为驱动VSMC增殖和损伤诱导的血管重塑的关键表观遗传机制。

除了其在组蛋白甲基化中的明确作用外，越来越多的证据表明EHMT2还通过非组蛋白机制在多种生物学背景下调节细胞过程。EHMT2具有广泛的非组蛋白靶点，并已被证明可以通过与其甲基转移酶活性无关的机制激活肿瘤抑制因子p53。同样，EHMT2可以通过在MyoD靶基因启动子上沉积H3K9me2并直接与MyoD相互作用及甲基化特定赖氨酸残基来抑制MyoD依赖的转录。EHMT2还被认为促进从头DNA甲基化。然而，目前尚不清楚EHMT2是否直接甲基化GADD45G或通过非组蛋白途径调节GADD45G的功能。尽管如此，我们推测EHMT2的非组蛋白作用可能与EHMT2–H3K9me2–GADD45G轴协同作用，共同形成一个整合的调控网络，影响血管重塑过程中的VSMC行为。

总之，EHMT2表达的异常上调在动物模型中促进新生内膜的形成。EHMT2以依赖于甲基转移酶活性的方式作为VSMC增殖和迁移的关键表观遗传调节因子。机制上，EHMT2控制GADD45G启动子区域的组蛋白甲基化状态并抑制GADD45G的转录。因此，EHMT2和GADD45G可能是开发治疗血管重塑新策略的有希望的潜在靶点。