微控制器（MCU）通过调节线粒体中的钙摄取及细胞谱系分配来控制骨骼的形成过程

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Mcu regulates bone formation via mitochondrial calcium uptake and lineage allocation

　　摘要
线粒体钙单向转运蛋白（Mcu）介导钙离子进入线粒体基质，在细胞能量代谢和存活中起着至关重要的作用。尽管Mcu已在多种生理环境中进行了研究，但其在骨骼稳态中的作用仍不甚明了。本研究探讨了Mcu缺乏如何影响衰老相关压力下的成骨细胞分化和骨形成。通过使用可诱导的全身Mcu敲除小鼠模型，我们发现Mcu缺失导致线粒体钙摄取受损、氧化磷酸化减少、线粒体形态异常以及成骨基因表达下降，从而引发骨形成缺陷。同时，Mcu缺失的骨髓细胞中脂肪生成标志物升高，表明间充质细胞谱系分化发生改变。机制上，Mcu缺失的细胞表现出增强的TGF-β信号传导和降低的BMP/Wnt通路活性。在体内实验中，可诱导的全身Mcu敲除小鼠表现出小梁骨体积和密度降低，但骨骼生长正常。使用山柰酚调节线粒体钙摄取可增强野生型细胞的成骨分化和线粒体呼吸作用，但对Mcu缺失细胞无效。公共可获取的人类数据集分析显示，骨组织中MCU表达随年龄增长和骨质疏松发生下调。这些发现表明Mcu通过调控线粒体钙摄取和间充质细胞谱系分配来调节骨形成。针对线粒体钙信号传导的干预可能为与年龄相关的骨骼疾病提供新的治疗策略。

引言
骨骼通过成骨细胞驱动的骨形成和破骨细胞介导的吸收之间的平衡相互作用进行持续重塑，以维持结构完整性和功能。成骨细胞由间充质干细胞分化而来，负责基质合成和矿化——这一过程高度依赖线粒体代谢。最新研究表明，细胞代谢和信号传导显著影响成骨细胞分化和整体骨骼健康。线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）提供ATP，并协调分化所需的合成过程，在成骨细胞中发挥关键作用。实际上，线粒体含量和功能的变化与骨细胞命运紧密相关，将代谢能力与谱系指定联系起来。然而，调控成骨细胞中线粒体适应的分子机制尚未完全明了。钙作为关键的第二信使，整合了细胞信号传导和代谢。在骨骼中，钙调节BMP/Wnt和TGF-β等关键分化途径。除了细胞质信号传导外，线粒体钙摄取还调节从糖酵解向氧化磷酸化的代谢转变。这种线粒体摄取主要通过线粒体钙单向转运蛋白（MCU）复合体实现，从而直接增强丙酮酸脱氢酶和草酰乙酸脱氢酶等关键代谢酶的活性，进而影响ATP合成、活性氧（ROS）产生和细胞凋亡。肌肉和心脏组织的研究表明，Mcu介导的钙摄取影响代谢燃料选择和能量稳态，提示其在成骨细胞分化中具有类似的作用。尽管已知依赖MCU的线粒体钙摄取调节多种细胞类型的线粒体动态、氧化还原状态和转录控制，但其对骨骼稳态的作用——尤其是在与年龄相关的压力下——尚未得到充分探索。我们假设Mcu缺乏通过破坏线粒体生物能量学，从而改变间充质细胞谱系分配，进而影响成骨细胞功能。

为了验证这一假设，我们使用了可诱导的全身Mcu敲除（Mcu iKO）小鼠模型，该模型能够绕过C57BL/6背景下的早期发育致死性，从而能够在40周以上的衰老小鼠中分析骨骼结果。研究结果表明，Mcu缺失的骨髓来源细胞表现出线粒体呼吸受损、成骨潜能降低和脂肪生成增加，伴随线粒体动态紊乱和骨形成减少。此外，使用山柰酚调节线粒体钙摄取的结果进一步支持了这些发现。总体而言，我们的研究将Mcu确定为线粒体代谢和间充质细胞命运的关键调节因子，为线粒体钙信号传导在骨骼生物学和骨骼衰老中的作用提供了新的见解。

材料与方法
小鼠
所有小鼠实验均按照延世大学Wonju医学院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（批准编号YWC-181022-1）。Mcu floxed小鼠（The Jackson Laboratory #029817）与Rosa26Cre-ERT2小鼠（The Jackson Laboratory #008463）杂交。他莫昔芬（T5648，Sigma）溶解在玉米油中，配制成20 mg/ml的工作浓度。为了诱导Cre重组介导的Mcu缺失，从6周龄开始，每天通过腹腔注射75 mg/kg体重的他莫昔芬，连续5天。给予他莫昔芬的Mcu floxed/flox；Rosa26Cre-ERT2Tg/Wt小鼠与Mcu floxed/flox同窝对照组进行比较。对于卵巢切除实验，对5周龄的雌性小鼠进行双侧卵巢切除，方法如前所述。假手术小鼠接受相同操作但不切除卵巢。手术后25周处死小鼠并收集股骨。本研究使用的小鼠均为雄性，卵巢切除组除外。

μCT和定量分析
在10个月龄时收集实验小鼠的股骨，并将其固定在4%磷酸盐缓冲盐水（PBS）中18小时，温度为4°C。然后用PBS冲洗固定样本。使用Quantum GX2微CT（PerkinElmer）进行微计算机断层扫描（μCT），参数设置为90 kV电压、88 μA电流、10 μm体素大小。采集的图像使用Quantum Gx软件进行分析和量化。

尿液和血清生化分析
使用40周龄小鼠的样本进行尿液和血清生化分析。尿液样本通过将小鼠单独放置在清洁收集容器中获取。对于血清制备，小鼠通过吸入麻醉，然后通过眶内采血管采集全血。血液样本在室温下凝固后，以2000g离心10分钟。使用市售检测试剂盒（SA10036300，JW: 309394-005，Sekisui）测量尿液中的钙和磷酸盐浓度。使用商业免疫测定试剂盒（EM0271和EM1319，FineTest；MBS731507，Mybiosource）测量血清中的Fgf23、甲状旁腺激素和维生素D3水平。所有检测均按照制造商说明进行，浓度根据每个试剂盒提供的标准曲线确定。

细胞培养
从Mcu floxed/flox；Rosa26Cre-ERT2Tg/Wt小鼠的股骨中分离出的MC3T3-E1前成骨细胞、C3H10T1/2细胞和骨髓细胞（BMCs）在体外培养和分化。通过针头和无菌PBS冲洗股骨来分离骨髓，然后通过细胞过滤器获得细胞悬液。所有细胞在添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco）中维持。对于成骨分化，细胞在含有10 mM β-甘油磷酸盐（Sigma）和50 μg/ml抗坏血酸（Sigma）的成骨培养基中培养。分化过程持续7-14天，每2-3天更换一次培养基。对于C3H10T1/2细胞和BMCs，使用含有0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤（Sigma）、1 μM地塞米松和1 μg/ml胰岛素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基诱导脂肪生成。分化后继续培养5-7天，每3天更换一次培养基。分化期结束时，收集细胞进行RNA和蛋白质提取。对于间接共培养，将MC3T3-E1细胞接种在底部孔板中，而Mcu野生型（WT）或iKO BMCs则放置在0.4-μm孔径的Transwell插件（Corning）中。细胞在成骨培养基中共培养7-10天。根据制造商方案，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将针对Mcu的小干扰RNA（siRNA）或非靶向对照RNA转染细胞。细胞在六孔板中接种，转染浓度约为80-90%汇合度，使用30-50 nM siRNA。转染后6小时，更换为完全生长培养基。转染后继续培养48小时再进行实验。

实时PCR
按照制造商说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用SuperScript III逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行逆转录。使用Quant-Studio 6实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）进行定量聚合酶链反应（qPCR）。Rplp0用于目标基因相对表达的标准化。通过qPCR使用基因组DNA量化线粒体DNA拷贝数，mt-Nd6和Gapdh分别作为线粒体和核的参考基因。PCR使用的引物序列见补充表1。

Western blotting
通过将样本在加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冻RIPA裂解缓冲液中匀浆来提取蛋白质（Thermo Fisher Scientific）。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质浓度。蛋白质样本在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用湿转移系统（Bio-Rad）转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用5%脱脂牛奶封闭1小时以防止非特异性结合。封闭后，膜在4°C下与特异性抗体孵育过夜。使用增强型化学发光试剂（Cytiva Amersham）检测蛋白质条带，并使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad）可视化。蛋白质水平通过将目标蛋白信号归一化到β-actin来进行量化。Western blotting中使用的抗体列表见补充表2。

线粒体钙摄取测定
细胞培养后，用无钙Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRBB）洗涤两次。使用商用分离试剂盒（Thermo Scientific）和Dounce匀浆方法按制造商说明分离线粒体。将含有100 nM Calcium Green-5N（Invitrogen）的染色溶液加入细胞中，然后在37°C下孵育10分钟。染色后，用PBS洗涤两次以去除多余染料，再加入无钙KRBB。使用FlexStation 3（Molecular Devices）和荧光显微镜（Leica）在490 nm和516 nm的激发/发射波长下测量荧光强度，从而评估线粒体钙摄取。

组织学分析
对于基于细胞的测定，MC3T3-E1细胞或骨髓来源细胞经过以下处理：使用4%戊二醛固定15分钟后，按照制造商说明使用ALP染色试剂盒（Sigma）进行碱性磷酸酶（ALP）染色，以评估早期成骨活性。使用Alizarin Red S染色（2%，pH 4.2）和von Kossa染色（5%硝酸银，在紫外光下）来观察基质矿化。对于Oil Red O染色，细胞在4%戊二醛中固定，然后用Oil Red O溶液染色以检测脂滴。对于组织分析，股骨在10%甲醛中固定，包埋在石蜡中，切片厚度为8 μm。然后进行苏木精和伊红（H&E）染色，以评估骨髓形态、脂肪细胞积累和肾脏结构。

线粒体膜电位测量
使用JC-1染料（Invitrogen）在KRBB中配制最终浓度为1 μM的溶液，并施加到细胞中。细胞在37°C下与JC-1溶液孵育30分钟。孵育后，用KRBB洗涤两次以去除多余染料。使用荧光显微镜或平板读数器在490/530 nm的激发/发射波长下测量荧光强度，分别对应JC-1单体（绿色荧光）和JC-1聚集体（红色荧光）。通过计算红色与绿色荧光强度的比值来评估线粒体膜电位。

TEM
细胞在2.5%戊二醛和0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中4°C固定24小时。样品在1%锇四氧化物中后固定，通过分级乙醇系列脱水，然后包埋在环氧树脂中。使用超薄切片机切割约70 nm的切片，并安装在铜网格上。切片用尿酰乙酸和柠檬酸铅染色，然后使用透射电子显微镜（HT7800，Hitachi）在80 kV加速电压下观察线粒体。

OCR测量
使用Seahorse XF Analyzer（Agilent）在96孔格式中测量培养细胞的氧气消耗率（OCR）。分化后，细胞在Seahorse XF Assay Medium中孵育。依次注入寡霉素、FCCP和罗丹明/抗霉素A（均来自Agilent），以确定基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和质子泄漏。

人类骨活检的RNA测序分析
为了评估人类骨组织中的MCU表达，我们分析了Gene Expression Omnibus中的公共数据集GSE72815，其中包含绝经后女性有无骨质疏松症的髂嵴骨活检的基因表达谱。

统计分析
所有数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计分析使用GraphPad Prism（版本10）进行。对于组间比较，应用了非配对双尾Student’s t检验或单因素方差分析（ANOVA）。统计显著性定义为*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

结果
衰老损害了骨髓细胞的成骨分化
为了评估衰老对骨髓细胞（BMCs）成骨潜能的影响，我们比较了来自年轻（8周龄）和衰老（60周龄）小鼠的初级成骨细胞（pObs）（图1a）。ALP、Alizarin Red S和von Kossa染色显示衰老的pObs矿化减少，表明成骨分化受损（图1b）。表达分析确认衰老的BMCs在分化条件下的成骨标志物水平显著降低（图1c, d）。与骨形成能力下降相反，老化的骨髓间充质细胞（BMCs）在脂肪生成条件下表现出脂肪生成基因的上调（补充图1），这表明衰老可能使间充质细胞的分化潜能偏向脂肪生成。总体而言，这些发现表明衰老会损害由BMCs衍生的成骨细胞的骨形成分化能力。

图1：来自老化小鼠的BMCs衍生的成骨细胞的骨形成分化能力降低。
该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
全尺寸图像：
a 实验程序的示意图。从8周龄或60周龄的小鼠的股骨中分离出BMCs，并在骨生成培养基中培养以诱导其分化为成骨前体细胞（pObs）。
b 来自年轻和老化小鼠的pObs的组织化学染色代表图像。
c 对年轻和老化小鼠的pObs中骨生成标志物表达的定量实时PCR分析。
d pObs中骨生成标志物的免疫印迹分析。数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计显著性：*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。

基于衰老会损害骨形成分化的发现（图1），我们接下来研究了线粒体变化是否对此缺陷有贡献。我们首先观察到来自老化BMCs的成骨细胞中线粒体蛋白的减少（补充图2a）。鉴于Mcu控制着钙依赖的线粒体生物能量代谢，我们假设与年龄相关的Mcu下调可能是这种损害的原因。与此想法一致的是，对公开可用的人类数据的分析显示，患有骨质疏松症的老年女性中Mcu的表达显著降低（补充图2b）。我们进一步在老化小鼠（补充图2c）和卵巢切除的小鼠（绝经后骨质疏松症的模型）中验证了这一发现（补充图2d）。这些发现共同表明，与年龄相关的骨骼应力可能会降低骨组织中的Mcu表达，从而可能影响骨形成过程中的线粒体钙处理。

为了直接测试线粒体钙摄取是否随年龄增长而受损，我们从年轻和老化小鼠的股骨中分离出线粒体并测量了其钙摄取能力（图2a）。老化线粒体的钙摄取能力显著降低（图2b）。有趣的是，标准化后的Mcu蛋白水平与线粒体质量相当（图2c），这表明翻译后调控或由于膜电位改变或与结合伙伴的相互作用导致的活性受损可能是功能差异的原因。为了评估Mcu在成骨细胞分化过程中的作用，我们检查了其在MC3T3-E1细胞分化过程中的表达。ALP染色证实了成骨细胞的逐步成熟（图2d）。Mcu的mRNA和蛋白水平随时间增加，表明其与分化进程相关（图2e、f和补充图3a）。为了确定Mcu的功能需求，我们使用siRNA沉默了其表达（图2g）。Mcu敲低显著降低了线粒体钙摄取（图2h）并损害了成骨细胞分化，表现为ALP活性和基质矿化减少（图2i、j）。在Mcu缺陷细胞中，骨生成基因的表达也显著降低（图2k和补充图3b）。这些发现共同表明，Mcu介导的线粒体钙摄取对于维持成骨细胞分化和基质矿化至关重要，从而将线粒体生物能量代谢与间充质谱系特化联系起来。

图2：由于衰老或Mcu丢失导致的线粒体钙摄取受损，抑制了骨形成分化。
该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
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a 从年轻（8周）或老化（60周）小鼠的pObs中分离出的线粒体进行线粒体钙摄取测量的示意图。
b 使用Calcium Green-5N在用5 μM钙处理的分离线粒体中测量线粒体钙摄取。显示了代表性轨迹和定量结果。
c 对从每组分离出的等量线粒体中的线粒体蛋白进行免疫印迹分析。
d 在骨形成分化过程中MC3T3-E1细胞中的ALP染色。
e 不同时间点上线粒体和骨生成基因表达的qPCR分析。
f 在MC3T3-E1分化过程中OXPHOS亚基和骨生成标志物的免疫印迹。
g 通过免疫印迹确认siRNA介导的Mcu敲低效率。
h 在siRNA处理过的细胞中分离出的线粒体的线粒体钙摄取。
i 敲低后第7天的代表性ALP染色。
j 分化14天后的Von Kossa和Alizarin Red S染色。
k 敲低后第7天的骨生成标志物的免疫印迹。数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计显著性：*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。

这些体外发现促使我们研究Mcu缺陷是否会在体内改变骨结构和间充质谱系分配。为此，我们使用他莫昔芬诱导的Cre系统生成了一个可诱导的Mcu敲除（Mcu iKO）小鼠模型（图3a）。通过线粒体钙摄取的显著减少（图3b）和丙酮酸脱氢酶磷酸化的降低（补充图4a）确认了Mcu的功能性缺失。为了确定Mcu是否对正常的骨骼发育至关重要，我们首先评估了10个月龄小鼠的体重和骨长度。Mcu iKO和对照组小鼠在体重、胫骨长度或股骨长度上没有显著差异（图3c和补充图4b），表明Mcu本身并不是骨骼生长的必要条件。然而，μCT显示Mcu iKO小鼠的皮质和松质骨部分都有明显的结构退化。定量分析显示总骨体积、骨表面积、骨体积分数以及皮质和松质骨密度降低，同时松质骨分离增加（图3d–g和补充图4c）。三维μCT重建进一步显示了股骨颈部的松质骨完整性丧失（图3f和补充图4d）。为了评估骨髓成分的潜在变化，我们对老化Mcu iKO小鼠的股骨切片进行了组织学分析。H&E染色显示Mcu iKO小鼠的骨髓脂肪细胞显著增加（图3h）。这些发现表明，Mcu缺陷不仅在骨生成谱系细胞中损害了骨量维持，还促进了体内间充质向脂肪生成的转变。鉴于老化Mcu iKO小鼠中观察到的显著骨髓脂肪和骨丢失，我们接下来评估了这些骨骼表型是否受到经典肾-内分泌矿物质稳态的影响。为此，我们检查了肾脏组织和参与矿物质代谢和骨骼稳态的关键内分泌参数。在20周或40周龄时，Mcu iKO和对照组小鼠的肾脏组织学没有可检测到的差异（补充图5a）。此外，尿钙和磷酸盐排泄量以及血清中的成纤维细胞生长因子23、甲状旁腺激素和维生素D水平在两种基因型之间没有差异（补充图5b、c）。

图3：Mcu缺失在老化小鼠中损害骨结构并促进骨髓脂肪形成。
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a 可诱导的Mcu敲除模型的示意图。他莫昔芬被给予6周龄的雄性小鼠，并在40-60周时进行分析。
b 使用Calcium Green-5N在Mcu iKO和对照组小鼠的股骨分离出的线粒体中测量线粒体钙摄取。
c 10个月龄时的体重和股骨长度测量。
d 股骨的代表性μCT图像。
e 基于μCT的形态计量分析。
f 股骨颈部的三维重建。
g 松质骨结构的定量分析。
h 股骨骨髓的H&E染色。所有实验都在40周龄的小鼠中进行。TV，总体积；BV，骨体积；BS，骨表面；TS，松质骨分离。数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计显著性：*P < 0.05，****P < 0.0001。

为了确定Mcu缺陷是否改变了体内早期间充质谱系的决策，我们在早期阶段（第3天）对C3H10T1/2细胞和原代骨髓来源的细胞进行了命运标记分析。在脂肪生成分化条件下，Mcu敲低显著增强了脂肪生成谱系标记物的表达，包括Zfp423、Pparg和Cebpd（补充图6a）。相比之下，在骨形成分化条件下，Mcu敲低抑制了早期骨形成谱系标记物，如Runx2、Sp7和Dlx5（补充图6b）。值得注意的是，在Mcu敲低后的原代BMCs中，与纤维化相关的基因（Col1a2、Acta2和Postn）有轻微诱导，但在C3H10T1/2细胞中则没有（补充图6c）。这些发现表明，Mcu缺陷优先使早期间充质向脂肪生成方向分化，而纤维化样激活可能是以依赖上下文的方式发生的，而不是统一的命运结果。

为了剖析其潜在的细胞机制，我们接下来研究了Mcu在调节成骨细胞功能和间充质命运中的内在和外在作用。我们首先评估了来自老化Mcu iKO和对照组小鼠的股骨骨组织中的骨生成标志物表达。Mcu iKO小鼠的Alp、Runx2和Sp7表达显著降低（图4a、b），表明体内骨形成能力受损。为了确定这种损害是否是由于细胞内在缺陷引起的，我们从Mcu WT和iKO小鼠中分离出BMCs并在体外诱导其骨生成分化（图4c）。Mcu缺陷的pObs显示出骨生成基因表达降低（图4d和补充图7a）以及基质矿化减少（图4e），支持Mcu在成骨细胞分化中的内在必要性。接下来，我们测试了Mcu缺陷的BMCs是否可以通过旁分泌效应影响邻近成骨细胞的分化（图4f）。与Mcu缺陷的BMCs共培养的MC3T3-E1细胞显示出ALP和Alizarin Red S染色显著降低（图4g和补充图7b），以及骨生成蛋白表达减少（图4h）。这些结果表明，Mcu在BMCs中的活性有助于创造一个促进骨生成的微环境，可能是通过分泌因子或改变的代谢信号。

图4：Mcu缺陷通过细胞自主和旁分泌机制损害骨形成。
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a 来自Mcu WT和iKO小鼠的股骨中线粒体和骨生成蛋白的免疫印迹。
b 股骨中骨生成基因的qPCR分析。
c 实验方案：从Mcu WT和iKO小鼠中分离出的BMCs被分化为成骨前体细胞（pObs）。
d pObs中骨生成标志物的免疫印迹。
e pObs的ALP和Alizarin Red S染色。
f 间接转孔培养的示意图；底部孔为MC3T3-E1细胞，插图为BMCs。
g 共培养7天后MC3T3-E1细胞的ALP染色。
h 共培养后MC3T3-E1细胞中的骨生成蛋白水平。
i、j TGF-β（i）和BMP/Wnt（j）信号蛋白的Western blot分析。所有实验都在60周龄的小鼠中进行。数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计显著性：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

值得注意的是，Mcu iKO骨髓中观察到的脂肪细胞积累增加（图3h）表明向脂肪生成谱系分配的转变。为了验证这一点，我们对Mcu WT和iKO小鼠的BMCs进行了脂肪生成分化（补充图7c）。Mcu缺陷细胞显示出脂质积累增加，如Oil Red O染色所示（补充图7d）。机制上，Western blot分析显示Mcu缺陷的股骨中Smad2/3的磷酸化增加和Smad1/5及β-连环蛋白的磷酸化减少（图4i、j），表明从骨诱导的BMP/Wnt信号转变为Tgf-β主导的信号。这些发现表明，Mcu不仅对内在的成骨细胞分化至关重要，还对维持支持骨形成的微环境和抑制脂肪生成至关重要。

鉴于成骨细胞分化是一个能量密集的过程，且Mcu介导的钙信号对线粒体代谢至关重要，我们假设Mcu缺陷通过破坏线粒体生物能量代谢来损害骨形成。为了验证这一点，我们测量了转染了对照或Mcu特异性siRNA的MC3T3-E1细胞的OCR。Mcu敲低显著降低了最大呼吸率和ATP产生（补充图8），表明分化过程中OXPHOS受损。这些结果表明，Mcu缺陷细胞中的骨形成受损可能源于线粒体ATP生成不足。

由于线粒体形态与代谢效率紧密相关，我们接下来检查了骨形成分化过程中的线粒体动态。在对照MC3T3-E1细胞中，我们观察到线粒体随时间逐渐延长和扩展，这与代谢需求增加时线粒体融合和网络重塑增强一致（补充图9a）。为了评估Mcu丢失是否破坏了这种重塑，我们分析了来自Mcu iKO小鼠的BMCs和pObs的线粒体形态。透射电子显微镜显示Mcu缺陷细胞中的线粒体碎片化和缩短（图5a）。定量形态测量确认线粒体面积和长度显著减少（图5b和补充图9b、c），表明线粒体动态受损。

图5：Mcu缺陷在成骨细胞分化过程中破坏线粒体形态和动态。
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a 来自Mcu WT和iKO小鼠的BMCs和pObs的透射电子显微镜（TEM）图像。线粒体用白色勾勒；细胞核（N）用黄色标记。黑色方框表示被放大并在右侧显示的区域。b 通过透射电子显微镜（TEM）图像量化线粒体的面积和长度。c、d pObs（c）和股骨组织（d）中线粒体动态调节因子的免疫印迹。e 对股骨样本中线粒体DNA拷贝数进行定量PCR分析。数据以平均值±标准误（s.e.m.）表示。统计显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。接下来，我们研究了线粒体结构的分子调节因子。Western blot分析显示，在Mcu缺陷的pObs中，线粒体融合蛋白Opa1的表达减少，而线粒体分裂的关键驱动因子Drp1的磷酸化增加（图5c）。在Mcu iKO小鼠的股骨组织中也观察到了类似的改变（图5d），这表明分裂倾向在体内也存在。与这些结构变化一致，我们检测到线粒体DNA含量减少（图5e）。这些数据表明，Mcu不仅对维持线粒体功能至关重要，而且对在成骨细胞分化过程中保持线粒体完整性和数量也很重要。

山柰酚通过Mcu介导的钙摄取增强骨形成和线粒体功能。鉴于Mcu在成骨细胞代谢中的核心作用，我们接下来探讨了通过药理学手段增强线粒体钙摄取是否可以恢复Mcu缺陷环境下的骨形成。我们用山柰酚处理MC3T3-E1细胞，山柰酚是一种先前已被证明能增加线粒体钙摄取的天然黄酮类化合物。山柰酚处理显著增强了线粒体钙摄取（图6a），并伴随着ALP活性和基质矿化的剂量依赖性增强（图6b）。成骨标志物的蛋白水平也上调（图6c），表明山柰酚通过激活线粒体促进成骨分化。为了测试这种效应是否通过Mcu介导，我们用Mcu抑制剂Ru265处理细胞（图6c）。Ru265处理抑制了线粒体钙摄取（图6d），减少了ALP和Alizarin Red S染色（图6e），并下调了成骨蛋白的表达（图6f），这些结果与Mcu敲低的效果相似。这些结果支持了Mcu活性对于山柰酚的成骨效应是必要的观点。

图6：山柰酚通过Mcu介导的钙摄取增强骨形成和线粒体功能。

为了进一步确认这种反应对Mcu的依赖性，我们用山柰酚处理了来自Mcu WT和iKO小鼠的pObs。虽然山柰酚显著增强了WT细胞的矿化和成骨蛋白表达，但在Mcu缺陷的成骨细胞中却未能达到这种效果（图6g, h）。这种在没有Mcu的情况下失去反应性的现象表明，山柰酚的促骨效应严格依赖于Mcu。最后，我们评估了山柰酚是否也能恢复线粒体呼吸。山柰酚处理增加了WT细胞的基础和最大氧气消耗以及ATP的产生，但在Mcu缺陷的细胞中没有效果（图6i），这加强了线粒体钙摄取在成骨细胞代谢中的核心作用。综上所述，这些发现表明山柰酚通过Mcu介导的钙摄取增强了线粒体生物能量和成骨细胞分化，因此可能成为治疗涉及线粒体功能障碍的骨丢失疾病的潜在策略。

讨论
在这项研究中，我们确定Mcu是通过调节线粒体钙摄取来调控成骨细胞分化和骨骼完整性的关键调节因子。我们发现，在成年小鼠中诱导性敲除Mcu会导致成骨细胞前体中的氧化磷酸化（OXPHOS）受损，从而导致基质形成缺陷和向脂肪生成命运的偏移。这些细胞缺陷在体内转化为显著的骨丢失，证明依赖于Mcu的钙摄取对骨骼形成至关重要。这些结果提供了证据，表明线粒体钙的处理直接调控骨骼谱系的分配。这些发现将“代谢控制细胞命运”的新兴范式扩展到骨骼生物学领域，将线粒体钙确定为骨形成中的一个新的代谢信号。从机制上讲，Mcu的缺失削弱了成骨细胞的能量代谢。Mcu缺陷的骨髓间充质细胞（BMCs）表现出ATP产生的氧气消耗显著减少，表明TCA循环中的钙激活脱氢酶不再完全参与。此外，我们观察到线粒体碎片化，融合蛋白（Opa1）的表达减少，而分裂调节因子（Drp1）的表达增加，表明处于以分裂为主的状态。这些线粒体变化可能反映了能量不足的压力反应，因为已知氧化应激或生物能量衰竭会诱导Drp1介导的分裂并抑制线粒体融合。相比之下，正常的成骨细胞分化需要强大的线粒体功能。最近的一项研究表明，具有遗传性I复合物活性或OXPHOS缺陷的骨骼前体无法进行骨形成。我们的结果与最近的一篇综述一致，该综述强调线粒体在成骨细胞中具有多种作用——包括ATP产生、ROS缓冲和线粒体信号的分泌——所有这些都有助于支持骨基质的合成。重要的是，Mcu的缺失不仅内在地破坏了成骨细胞的功能，还改变了细胞外微环境。共培养实验显示，Mcu缺陷的BMCs抑制了邻近细胞的成骨分化，表明旁分泌信号或代谢支持受损。总之，Mcu的缺失破坏了这一线粒体程序，使成骨细胞缺乏分化所需的能量和氧化还原环境。

除了代谢作用外，Mcu的缺失还改变了分化信号。我们发现，Mcu缺陷的BMCs上调了脂肪生成转录因子并激活了TGF-β信号成分，同时下调了BMP/Wnt信号靶标。这让人想起TGF-β和BMP/Wnt通路在骨骼前体中的拮抗关系，其中占主导的TGF-β信号抑制了成骨分化，促进了脂肪生成。事实上，其他研究也表明，TGF-β信号增强或BMP/Wnt减少会导致骨髓脂肪化和骨丢失。我们的数据表明，线粒体钙摄取通常在骨形成过程中抑制TGF-β活性；当Mcu缺失时，未受控制的Smad2/3活性可能会推动细胞向其他命运发展。重要的是，在特定分化条件下对命运标志物的分析显示，Mcu缺失在脂肪生成环境中增强了脂肪生成的倾向，而在成骨条件下则抑制了成骨倾向。在后一种情况下，在原代BMCs中观察到与纤维化相关的基因的轻微且依赖于背景的诱导，这表明纤维化相关的激活可能是对成骨生成受损的次级反应，而不是主要的命运决定。因此，虽然在成骨应激条件下可以观察到与纤维化相关的基因诱导，但它似乎并不代表Mcu缺失的主要或直接后果。线粒体钙与这些转录程序之间的确切联系仍有待确定。一种可能性是，线粒体钙调节细胞质钙振荡和下游的CaMK/NFAT通路，这些通路又与BMP/Wnt相互作用。另一种可能是，Mcu缺陷细胞中的NAD+/NADH比率或线粒体ROS的变化可能影响谱系基因的表观遗传调节因子。值得注意的是，最近的一项研究报告称，在成骨细胞谱系细胞中，Mcu过表达通过过度产生ROS抑制了BMP/Smad信号，导致骨形成受损。结合我们的发现，这表明Mcu的缺乏和过量都会破坏骨形成，突显了线粒体钙稳态的重要性。

我们的工作还探讨了转化医学的角度。据报道，植物黄酮类化合物山柰酚可以增强线粒体钙摄取并促进成骨信号。在WT BMCs中，我们确认山柰酚增强了线粒体钙的摄取，并提高了呼吸作用和Runx2和Sp7的表达。值得注意的是，这些效应在Mcu敲除细胞中被消除，表明Mcu是山柰酚促骨作用所必需的中介因子。我们还验证了Mcu特异性抑制剂Ru265同样阻断了骨形成，进一步支持了这一结论。尽管如此，我们提醒山柰酚具有多种细胞靶点和抗氧化特性，这些可能对其骨效应有所贡献。因此，我们将山柰酚解释为线粒体钙调节因子的概念验证，而不是选择性的Mcu激动剂。尽管我们的数据支持以Mcu为中心的机制，但未来的工作需要进一步解析这些通路。此外，山柰酚的生物利用度低和脱靶效应给临床应用带来了挑战。最近的研究表明，另一种黄酮类化合物橄榄素可以直接激活Mcu并改善老年肌肉的线粒体功能。类似的营养补充剂是否能够安全地增强骨形成仍是一个有趣的可能性。

为了支持我们发现的临床相关性，我们发现绝经后骨质疏松症女性的骨活检样本和卵巢切除小鼠中的Mcu表达水平下降，这与其他组织中衰老和炎症信号下调Mcu的报告一致。这表明与年龄相关的骨丢失可能涉及线粒体钙信号的减弱。因此，保护或增强Mcu功能的干预措施可能有助于减缓骨骼老化。然而，任何此类方法都必须考虑安全性：Mcu在心脏、大脑和肌肉中广泛表达且是必需的，因此全局调节可能会产生意想不到的效果。可能需要针对骨骼的靶向递送或使用细胞特异性激活剂。此外，我们在小鼠中的发现需要在人类骨细胞中进行验证，并进行仔细的剂量研究才能应用于临床。

这项研究有几个局限性。首先，使用全身诱导性敲除模型无法区分细胞自主效应和系统效应。虽然诱导性模型避免了发育混淆因素，体外分化和共培养实验支持Mcu在成骨细胞中的内在作用，但我们不能排除其他组织的贡献。例如，破骨细胞或造血细胞中Mcu的缺失可能会间接影响骨重塑，肌肉或内分泌器官中的系统代谢紊乱可能会影响骨形成。为了解决这些问题，我们仔细评估了已知会对骨骼稳态产生次要影响的主要肾脏和内分泌参数。值得注意的是，Mcu iKO小鼠在肾脏组织学、尿液钙或磷酸盐排泄以及循环中的FGF23、甲状旁腺激素或维生素D水平方面没有表现出可检测的异常。这些发现表明，经典的肾脏-内分泌矿物质稳态的明显紊乱不太可能是Mcu iKO小鼠骨丢失和骨髓脂肪化的原因。然而，不能排除更微妙的系统或器官间效应，未来需要使用成骨细胞或谱系特异性的Cre驱动因子来明确Mcu对骨骼生物学的细胞自主与系统贡献。其次，虽然我们观察到线粒体形态和功能的持续变化，但尚需验证这些改变是否影响染色质重塑或成骨形成的表观遗传调控，鉴于已知线粒体衍生的代谢物在调节基因表达中的作用。第三，我们的研究没有完全区分脂肪生成和纤维化，尽管我们在组织学上观察到骨髓脂肪的增加。后续的谱系追踪和脂肪细胞特异性分析将澄清Mcu缺陷的间充质前体是否优先采用脂肪生成命运或在压力下生成纤维化骨髓基质。

总之，我们的发现强调Mcu是成骨细胞生物能量、间充质谱系分化和骨骼完整性的核心调节因子。通过将线粒体钙摄取与成骨生成和脂肪生成命运决策联系起来，我们揭示了骨骼生物学中的一个新维度，整合了代谢和信号传导。未来对Mcu下游分子机制的研究以及开发针对骨骼的线粒体调节剂，可能会为骨质疏松症和与年龄相关的骨折风险开辟新的治疗途径。