QKI-6和QKI-7的异构体特异性作用调控施万细胞（Schwann cell）的发育进程，并促进周围神经的再生

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Isoform-specific roles of QKI-6 and QKI-7 direct Schwann cell lineage progression and enhance peripheral nerve regeneration

　　摘要
周围神经损伤是一个重大的治疗挑战，因为其内源性修复能力有限，功能恢复也不完全。施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统的主要胶质细胞，它们支持轴突的完整性和再生，但调控其发育和修复功能的转录后机制仍不明确。在这里，我们研究了RNA结合蛋白Quaking（QKI）的异构体特异性作用，该蛋白可剪接成核内（QKI-5）和细胞质内（QKI-6和QKI-7）两种形式，以调控人类施万细胞的谱系分化。利用从人类多能干细胞衍生出的施万细胞前体（Schwann cell precursors, SCPs）平台，我们发现QKI-6和QKI-7在SCP向SC转化过程中选择性上调，而QKI的缺失会破坏SCP的存活能力、分化和剪接准确性。转录组学和rMATS分析鉴定了800多个依赖QKI的剪接事件，包括PLP1和PMP22中的疾病相关异构体变化。异构体特异性的拯救和功能增强实验表明，QKI-6支持SCP的扩增和有丝分裂进程，而QKI-7促进SC的成熟和神经营养因子的产生。在小鼠坐骨神经切断模型中，移植过表达QKI-7的SCPs或SCs显著增强了轴突再生、髓鞘再生和运动功能恢复，优于未修饰或表达QKI-6的对照组。组织学分析证实，QKI-7修饰的移植体中供体细胞的植入、髓鞘蛋白表达和神经营养因子水平均有所改善。这些发现建立了一种顺序性的、依赖于异构体的施万细胞谱系调控机制，并将QKI-7确定为一种用于工程化具有增强再生能力的修复性胶质细胞的候选蛋白。针对RNA结合蛋白的异构体调控可能代表了一种克服周围神经疾病胶质细胞治疗内在局限性的策略。

引言
周围神经损伤会导致长期的感觉和运动缺陷，每年影响数百万患者，目前除了神经移植外，治疗选择有限。施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统（PNS）的髓鞘形成胶质细胞，对于维持轴突完整性、促进再生和损伤后的功能恢复至关重要。这些细胞来源于施万细胞前体（Schwann cell precursors, SCPs），这是一种短暂存在的神经嵴来源的细胞群，代表了PNS中最早分化的胶质细胞谱系。由于其增殖潜力和发育可塑性，SCPs不仅被认为是周围胶质细胞发育过程中的重要中间细胞，也被视为针对周围神经损伤和周围神经病变的再生疗法的可扩展细胞来源。从SCPs到成熟SCs的谱系分化受到外部信号（如neuregulin-1 (NRG1)、Notch、基本成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β (TGF-β)）的调控，这些信号通过PI3K/AKT和MAPK/ERK等细胞内通路来调节SCP的存活、增殖和分化。尽管这些通路已被广泛研究，但它们尚未完全解释在再生或病理条件下基因表达的精确时间和空间调控机制。特别是，RNA水平上的调控过程如何参与SC分化和再生过程中的基因表达动态调控尚未完全阐明。

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）在转录后调控中起核心作用，通过控制可变剪接、mRNA稳定性和翻译来实现。其中，Quaking（QKI）家族的RBP包含三种主要异构体（QKI-5、QKI-6和QKI-7），已被证实参与神经发育和胶质细胞成熟。这些异构体通过可变3'剪接产生，具有不同的亚细胞定位：QKI-5主要位于细胞核内，而QKI-6和QKI-7则富集在细胞质中。在中枢神经系统（CNS）的少突胶质细胞中，QKI通过调节关键转录本（如MBP和PLP1）的可变剪接和mRNA稳定性来调控髓鞘基因表达和胶质细胞成熟。此外，QKI还影响microRNA的生物发生，包括抑制pri-miR-7的加工，从而调节下游信号通路（如表皮生长因子受体（EGFR）/ERK）。尽管QKI在中枢神经系统髓鞘形成中的作用已被充分研究，但在周围神经系统胶质细胞中的功能仍不清楚。与少突胶质细胞不同，施万细胞包裹单个轴突，表现出不同的发育轨迹，并在神经损伤后迅速发生表型重塑。此外，周围神经系统髓鞘的分子组成和更新动态与中枢神经系统有很大差异，这表明QKI异构体可能在这些不同细胞区室中发挥依赖于背景的功能。支持这一观点的是，QKI-6和QKI-7蛋白在成年施万细胞中表达，在表现出脱髓鞘的P0缺陷小鼠中表达下调，表明QKI可能在维持周围神经系统髓鞘完整性中起作用。与这一观点一致的是，RBP介导的可变剪接失调与周围神经胶质病理有关，包括与NF2剪接缺陷相关的施万瘤生成，而异常的QKI表达也与遗传性脱髓鞘疾病（如Charcot–Marie–Tooth病和Pelizaeus–Merzbacher病）有关。然而，QKI各个异构体在人类SCP分化、SC成熟和再生反应中是否发挥特定且异构体特异性的功能尚未系统研究。此外，QKI介导的转录后调控对人类施万细胞谱系细胞中神经营养因子表达和再生能力的影响也尚未充分探索。

在本研究中，我们使用了一个阶段定义的人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）分化平台来研究QKI-5、QKI-6和QKI-7在人类施万细胞谱系发育中的异构体特异性作用。通过结合异构体特异性干扰、分子生物学、转录组学和功能分析，我们证明QKI-6和QKI-7参与调控SCP的存活能力、增殖、成熟和神经营养因子的产生。值得注意的是，QKI-7在体外和体内都能增强轴突再生。这些发现支持了一个模型，即QKI异构体作为转录后调节因子，微调SC的分化和再生能力，并突显了它们作为工程化修复性胶质细胞的分子靶点的潜在用途。

材料与方法
**细胞培养**
人类胚胎干细胞（hESCs；H9系；WiCell Research Institute, Madison, WI, USA）、H9衍生的SCPs（H9-SCPs）和H9-SCP衍生的SCs（H9-SCP-SCs）在无饲养层条件下维持，如先前所述。hESCs在减少生长因子的Matrigel涂层培养皿（Corning, NY, USA）中培养于mTeSR1培养基（STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）中，每天更换培养基。SCPs通过将hESCs重新接种到Matrigel涂层培养皿上并在含有1% N2补充剂、2% B27补充剂（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、0.005% 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）、2 mM GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、0.11 mM β-mercaptoethanol（Sigma-Aldrich）、3 μM CHIR99021和20 μM SB431542（Tocris Bioscience, Bristol, UK）的化学定义培养基中培养，该培养基由Advanced DMEM/F12和Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific）以1:1的比例配制而成。培养6天后，培养基更换为含有100 ng/ml NRG1（PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA）的神经诱导培养基。使用Accutase（Millipore, Billerica, MA, USA）分离细胞，并再扩增18天。

神经嵴干细胞（NCSCs）使用STEMdiff? Neural Crest Differentiation Kit（STEMCELL Technologies）根据制造商说明进行制备。简要来说，hESCs用Accutase分离后以2 × 10^5细胞/平方厘米的密度接种到含有10 μM Y-27632（ROCK抑制剂）的mTeSR1培养基中培养24小时，然后继续在STEMdiff Neural Crest Differentiation Medium中培养6天。

**SCP向SC的分化**
SCP向SC的分化分阶段进行。首先在含有0.2%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific）、200 ng/ml NRG1、5 μM forskolin（Sigma-Aldrich）、1 μM全反式维甲酸（RA；Sigma-Aldrich）、100 ng/ml PDGF-BB（PeproTech）和0.11 mM β-mercaptoethanol的DMEM（Thermo Fisher Scientific）中培养2天。随后在不含RA的培养基中培养4天，再在仅含NRG1的培养基中培养4天。

**原代人类施万细胞**
原代人类施万细胞（ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA）按照供应商的方案在Schwann cell medium（ScienCell）中培养。人类新生儿包皮成纤维细胞（CRL-2097；ATCC, Manassas, VA, USA）在含有15% FBS和0.11 mM β-mercaptoethanol的最低必需培养基（Thermo Fisher Scientific）中维持。

**逆转录和PCR**
总RNA使用Trijol? Reagent（Thermo Fisher Scientific）分离，并用SuperScript? VILO cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific）进行逆转录。定量实时PCR（qPCR）使用Fast SYBR? Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）上进行。终点PCR使用HOT FIREPol? Blend Master Mix（Solis BioDyne, Tartu, Estonia）进行。引物序列见补充表1和2。

**免疫印迹**
细胞在RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中裂解，蛋白质浓度使用Pierce? BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）测定。等量的蛋白质（20 μg）通过SDS–PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上，并用5% skimmed milk在TBS-T（0.05% Tween-20）中封闭。膜在4°C下与一抗孵育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育1小时。使用SuperSignal? West Pico PLUS底物（Thermo Fisher Scientific）进行检测，并用Amersham? Imager 600（GE Healthcare）成像。抗体列表见补充表3。

**慢病毒制备**
QKI敲低使用慢病毒载体系统（QKI Human short hairpin RNA (shRNA) Lentiviral Plasmid Kit；OriGene, Rockville, MD, USA）实现。QKI-6和QKI-7的过表达构建体从VectorBuilder（Chicago, IL, USA）获得。慢病毒通过将HEK293T细胞与包装质粒共转染使用293 Expression Transfection Reagent（Excellgen, Rockville, MD, USA）产生。转染后48小时收集病毒上清液，过滤（0.45 μm），并在4°C下以100,000×g离心2小时。病毒沉淀物重新悬浮在含有0.5 M蔗糖的DMEM中并储存在-80°C。

**免疫细胞术**
细胞在4%甲醛的PBS中固定10分钟，然后用含有10% FBS和1%牛血清白蛋白的0.2% Triton X-100渗透1小时，并在4°C下与一抗孵育过夜。PBS洗涤后，加入Alexa Fluor结合的二抗（Invitrogen, 1:500）在室温下孵育20分钟。使用Axio VertA.1倒置显微镜（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）获取图像。抗体列表见补充表3。

**RNA测序和可变剪接分析**
GFP+ SCPs使用FACSAria? II（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）分离。总RNA用Trijol提取，用DNase处理后，使用TruSeq? Stranded mRNA Kit（Illumina）进行质量控制，然后构建文库。文库在NovaSeq 6000（Illumina）上进行测序（Macrogen Inc., Seoul, South Korea）。可变剪接分析使用rMATS v4.1.2进行，包括跳过外显子（SE）、可变3'剪接位点、可变5'剪接位点、互斥外显子和保留内含子等事件。显著剪接事件的定义标准为平均读数≥10、假发现率≤0.05和绝对包含水平差异（ΔPSI）>0.1。

**流式细胞术**
**细胞周期分析**
细胞在-20°C的70%乙醇中固定至少2小时，用PBS洗涤，然后用propidium iodide（PI；Sigma-Aldrich）和RNase A（Thermo Fisher Scientific）染色。使用BD Accuri? C6流式细胞仪（BD Biosciences）分析DNA含量。凋亡使用Annexin V-APC/PI Apoptosis Detection Kit（BioLegend）根据制造商说明进行检测，随后通过流式细胞术分析。

**神经突起生长测定**
SHSY-5Y神经元细胞（ATCC）在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific）中培养。细胞以500细胞/平方厘米的密度接种在Matrigel涂层12孔板上，用1 μM RA预分化1天，然后用来自SCPs或SCs的条件培养基（CM）处理。2天后，捕获相位对比图像，并使用AxioVision LE软件（Carl Zeiss, version 4.8.2.0）量化神经突起长度。

**ELISA**
CM通过0.2-μm膜（Millipore）过滤以去除细胞碎片。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Abcam, Cambridge, MA, USA）测量人脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和神经生长因子（NGF）的浓度，按照制造商说明进行。在450 nm处使用多孔分光光度计（Molecular Devices, San Jose, CA, USA）测量吸光度。

**生长因子抗体谱型分析**
过滤后的CM样本使用Human Growth Factor Antibody Array C1（RayBiotech, Norcross, GA, USA；目录号AAH-GF-1）进行分析，该阵列可检测41种生长因子（amphiregulin、基本成纤维细胞生长因子/FGF-2、EGF、EGFR、FGF-4、FGF-6、FGF-7、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、GDNF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肝素结合EGF样生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP6）、胰岛素样生长因子（IGF-I和IGF-II）、IGF-I可溶性受体、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）受体、β-NGF、神经营养因子-3（NT-3）、NT-4、血小板衍生生长因子受体（PDGF受体-α和受体-β）、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、胎盘生长因子（PLGF）、干细胞因子（SCF）、SCF受体、TGFs（TGF-α、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）、血管内皮生长因子A（VEGF-A）、VEGF受体2、VEGF受体3和VEGF-D）。阵列按照制造商说明处理，并使用Amersham Imager 600（GE Healthcare）可视化。密度分析使用ImageJ软件进行。体内坐骨神经损伤和移植所有动物实验均获得KRIBB机构动物护理和使用委员会（KRIBB-AEC-18041）的批准。八周大的雄性C57BL/6小鼠（Dae Han BioLink，韩国忠州）接受了坐骨神经切断（SNT）和移植，具体方法如先前所述22。总共1×10^5个细胞被注入5μl的Matrigel中到损伤部位。移植的细胞包括NCSCs、SCPs、过表达QKI-7的SCPs（QKI-7-SCPs）、SCP-SCs、过表达QKI-6的SCP衍生的SCs（QKI-6-SCP-SCs）以及QKI-7-SCP衍生的SCs（QKI-7-SCP-SCs）。小鼠在8周内被监测其功能恢复和组织学评估。

**Rotarod测试**
使用加速旋转棒（Daejong Instrument Industry，韩国首尔）评估运动功能。旋转速度从4 rpm增加到40 rpm，持续180秒，然后以40 rpm的速度保持120秒。每只小鼠进行三次试验，每次试验之间休息10分钟。记录平均跌倒时间。

**免疫组化**
小鼠被灌注4%的甲醛，坐骨神经经过后固定处理，然后在30%的蔗糖中冷冻保护，嵌入最佳切割温度（OCT）化合物（Sakura Finetek，美国托伦斯），使用冷冻切片机（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）切成15 μm的切片。组织切片按照标准免疫组化协议进行染色22。抗体列表见补充表3。

**统计分析**
定量数据以平均值±标准差（s.d.）表示，除非另有说明。两组比较使用非配对的双尾Student’s t检验进行分析。对于多组比较，应用单因素方差分析及Tukey事后检验。P值小于0.01被视为具有统计学意义。

**QKI-6和QKI-7的阶段特异性诱导标记施万细胞谱系进展**
为了确定人类SC谱系分化的分子调节因子，我们使用了一个逐步分化平台，引导hPSCs通过NCSCs、SCPs和终末分化的SCs（SCP-SCs）。在这些谱系定义的阶段进行转录组分析，发现RNA结合蛋白Quaking（QKI）是一个候选调节因子。尽管已知QKI异构体在中枢神经系统中协调髓鞘形成和胶质细胞成熟23,24，但它们在外周胶质细胞发育中的作用尚未探索。QKI基因通过选择性3'剪接编码三种主要异构体（QKI-5、QKI-6和QKI-7），产生具有不同C末端序列的蛋白质，这些序列决定了它们的亚细胞定位：QKI-5主要位于细胞核内，QKI-6分布在细胞核和细胞质中，而QKI-7仅限于细胞质（图1a）。为了表征每种异构体的阶段特异性表达，我们在未分化的hESCs、NCSCs、SCPs以及作为体细胞对照的人类包皮成纤维细胞中进行了qPCR分析。QKI-6和QKI-7的转录本在SCP和SCP-SC阶段显著上调，其中QKI-7在SCP向SC成熟过程中表达最明显（图1b）。相比之下，QKI-5在整个分化过程中表达基本保持不变。

**图1：** 从hPSCs向施万细胞谱系分化过程中QKI-6和QKI-7的阶段特异性诱导。

**QKI在维持SCP身份中的作用**
为了明确QKI在SCP中的功能需求，我们进行了慢病毒shRNA介导的敲低实验，针对所有三种主要异构体（QKI-5、QKI-6和QKI-7）。通过qPCR和免疫印迹验证敲低效率，确认在mRNA和蛋白质水平上都实现了有效耗尽（补充图1a、b）。对分选的GFP? SCPs的转录组分析显示，包括CDH19、ERBB3、FOXD3、GAP43、ITGA4、L1CAM、MPZ、NGFR、SOX2、SOX10和TFAP2A在内的经典身份基因的表达在QKI耗尽的细胞中基本保持（图1f）。这些结果进一步通过GAP43和SOX10的qRT-PCR得到证实（图1g），并通过免疫染色和GAP43?及SOX10?细胞群体的定量分析得到验证（图1h,i），表明QKI在转录或蛋白质水平上并非维持SCP身份所必需。尽管谱系身份得以保持，但全局转录组分析显示QKI缺陷的SCP中存在广泛的基因表达失调（补充图2a）。差异表达分析鉴定出801个显著改变的转录本，其中581个基因上调，220个基因下调（补充图2b）。基因本体（GO）富集显示与细胞周期调控、有丝分裂、凋亡、神经发生和鞘脂代谢有强烈关联（补充图2c）。KEGG通路分析进一步表明PI3K/Akt和MAPK信号通路、ECM-受体相互作用、焦点黏附和肌动蛋白细胞骨架调控通路受到协调下调（补充图2d）。值得注意的是，QKI敲低显著抑制了G1/S和G2/M阶段的调节因子，包括CCNB1、CCNB2、CCNE1、CDK14、CDK19、CCND3和CCNC（补充图2e）。相反，与生长抑制和细胞周期停滞相关的转录本如CDKN1B、CDK18、CCNG2和CCNDBP1上调（补充图2e），这表明内在检查点机制被激活。这种转录谱表明，尽管QKI对于维持SCP身份不是必需的，但它对于维持增殖和前体细胞维持所需的有丝分裂转录网络是必不可少的。

**QKI缺乏影响SCP的生存信号传导和细胞周期进展**
为了明确QKI在SCP中的功能作用，我们进行了慢病毒介导的敲低实验，针对所有三种主要异构体（图2a）。Ki67的免疫荧光染色显示，在QKI耗尽后增殖的SCP显著减少（图2b）。定量评估确认QKI缺陷培养物中Ki67?核的比例显著下降（39.7±13.3%，对照组为87.3±3.1%，P<0.01；图2c）。同时，SOX10? SCPs的时间进程分析显示细胞数量逐渐减少，表明自我更新能力受损（图2d）。

**图2：** QKI敲低破坏了SCP的有丝分裂信号传导，抑制了增殖并诱导了凋亡。

**QKI在施万细胞发育中的动态调控作用**
为了研究QKI在施万细胞发育中的动态调控作用，我们进行了综合表型和分子分析（图2a）。免疫荧光染色显示，在QKI耗尽后增殖的SCP显著减少（图2b）。定量评估确认QKI缺陷培养物中Ki67?核的比例显著下降。基于GFP/SOX10共表达，对SOX10? SCPs在0天、2天和5天的时间进程进行了定量分析（图2d）。免疫印迹分析显示磷酸化和总AKT及ERK1/2的水平（图2e）。流式细胞术分析显示Annexin V和propidium iodide（PI）在shCon-SCPs和shQKI-SCPs中的染色情况（图2f）。定量分析显示Annexin V?凋亡细胞的数量（图2g）。细胞周期分析显示SCP在G0/G1、S和G2/M阶段的分布（图2j）。免疫印迹分析显示凋亡相关蛋白（BAX和BCL2）以及细胞周期调节因子（Cyclin B1、Cyclin E和p27Kip1）在shCon-SCPs和shQKI-SCPs中的表达情况（图2k）。RNA测序分析显示PMP22基因在shCon-SCPs和shQKI-SCPs中的转录水平（图2o,p）。这些剪接变化在多个重复实验中都是一致的，其中264个外显子的包含频率增加，315个外显子的跳跃频率增加，反映了QKI依赖性调控的广泛性和稳定性。对差异性剪接基因的GO富集分析显示，这些基因与SCP生物学中的基本过程有强烈关联，包括细胞周期进展、有丝分裂控制、细胞内信号传导和转录调控（补充图3b）。有25个基因在剪接和整体转录水平上都表现出协调的变化（补充图3c），表明QKI同时调节mRNA的丰度和异构体的使用。这些双重调控的目标基因涉及神经发育（DAB1和ANK3）、细胞粘附（COL11A2和COL12A1）、脂质代谢（SMPD1和ENPP2）以及囊泡介导的运输（PFN2和EGF），表明QKI在维护胶质前体的结构和功能完整性方面起着重要作用。

为了验证rMATS识别的事件，我们对选定的目标基因进行了异构体特异性的RT-PCR分析。在SCP相关转录本中确认了异常的外显子包含或跳跃现象，包括STAG2、NEK1、HAUS2、RAB11FIP3、ANK3和DLG1（图2n），这表明QKI参与了与增殖、细胞骨架重塑和胶质细胞成熟相关的剪接网络的调控。此外，QKI的缺失破坏了与遗传性神经病变相关的髓鞘相关基因的异构体平衡。值得注意的是，PLP1的表达倾向于DM20异构体（图2n），这种模式与少突胶质细胞功能障碍和Pelizaeus–Merzbacher疾病相关。同样，PMP22表现出变异体2的表达增加和变异体1的表达减少（图2o,p），这再现了与Charcot–Marie–Tooth疾病1A型（CMT1A）相关的剪接失衡。总的来说，这些发现将QKI定位为发育中的SCs中可变剪接准确性的关键调节因子，协调了对细胞周期进展、神经发育和维持胶质细胞身份至关重要的过程。

QKI对于施万细胞的存活、终末成熟和神经营养功能是必需的。为了确定QKI是否在祖细胞阶段之后也是必需的，我们评估了其在施万细胞终末成熟过程中的作用。用靶向QKI的shRNAs（shQKI）或对照shRNAs（shCon）转染的SCPs分别被分化为SCPs（shQKI-SCP-SCs和shCon-SCP-SCs），并评估了它们的分子身份、活力和神经营养功能（图3a）。qPCR分析显示，在对照细胞和QKI缺乏细胞中，包括DLG1、EGR2、GFAP、MBP、MPZ、NGFR、PLP1和S100B在内的典型施万细胞标记物的表达没有显著差异（图3b）。免疫荧光分析证实NGFR?和S100B?细胞的比例相当（图3c,d），表明QKI对于初始的细胞谱系分化不是必需的。QKI-5、QKI-6和QKI-7的异构体特异性敲低在整个分化过程中持续存在（图3b）。

图3：QKI的缺失会损害SCP来源的施万细胞的分化和神经营养因子的产生。

尽管标记物表达完整，但QKI缺乏的SCPs显示出较低的分化效率，这通过S100B?施万细胞产量的显著下降得到了证实（图3e）。时间序列成像显示，与对照组相比，QKI缺乏的培养物中的细胞生长和扩增减弱（图3f）。流式细胞术分析显示，shQKI-SCP-SCs中的凋亡细胞（Annexin V?/PI?）比例升高（30.6?±?1.1% vs 9.5?±?0.32%）（图3g），表明其存活能力受损。为了评估功能成熟度，我们检测了神经营养因子的产生，这是具有修复能力的施万细胞的关键特性。qPCR显示，shQKI-SCP-SCs中NGF和NT3的表达降低（图3h）。细胞因子阵列分析显示，关键神经营养因子（包括GDNF、NGF和NT3）的分泌减少（图3i,j），ELISA进一步证实了QKI缺乏的培养基中BDNF、GDNF和NGF水平的显著降低（图3k）。

为了评估体外神经再生能力，我们使用SH-SY5Y细胞作为已建立的人类神经元模型，该模型能够在受控条件下可重复且定量地评估施万细胞来源的营养支持对神经元轴突生长的影响。SH-SY5Y神经元暴露于来自shQKI或缺乏QKI的SC培养基（shCon或shQKI）的培养基中。用QKI缺乏的培养基处理的神经元表现出比用对照培养基处理的神经元更低的轴突延伸（27.6?±?1.8?μm vs 61.0?±?3.6?μm；P?
QKI-6和QKI-7对SCPs的存活、增殖和神经营养编程具有异构体特异性的影响。为了明确QKI在SCPs调控过程中的异构体特异性功能，我们通过将QKI-6或QKI-7重新引入QKI缺乏的SCPs中进行了拯救实验，分别生成了shQKI-QKI-6-SCPs和shQKI-QKI-7-SCPs（图4a）。通过qPCR确认了每种异构体的异位表达（图4b）。SOX10?细胞的时间序列分析显示，QKI-6有效地恢复了SCPs的数量并维持了其增殖能力（图4c）。相比之下，QKI-7对SOX10?细胞数量的影响很小，表明其在支持早期祖细胞维持方面的能力有限。

图4：QKI-6和QKI-7的异构体特异性拯救恢复了SCPs的身份、细胞周期进展和存活。

尽管标记物表达完整，但QKI缺乏的SCPs显示出较低的分化效率，这通过S100B?施万细胞产量的显著下降得到了证实。时间序列成像显示，与对照组相比，QKI缺乏的培养物中的细胞生长和扩增减弱。流式细胞术分析显示，shQKI-SCP-SCs中的凋亡细胞（Annexin V?/PI?）比例升高（30.6?±?1.1% vs 9.5?±?0.32%）。凋亡和细胞周期分析进一步强调了这些功能差异。QKI-6显著减少了Annexin V?/PI?凋亡细胞的比例（9.35?±?0.78% vs 26.5?±?2.7%），并恢复了G2/M期的过渡，同时减轻了G0/G1期的停滞。尽管在早期阶段存在差异，但两种异构体都恢复了QKI缺乏的SCPs在分化过程中生成SCPs的能力。值得注意的是，在神经营养编程方面也出现了异构体特异性差异。虽然QKI-6和QKI-7都增强了IGFBP2的表达，但QKI-7更显著地上调了NGF和NT3的表达。ELISA测量显示，QKI-7拯救的SCPs分泌的BDNF（32.4?±?1.1?pg/ml）和NGF（190.2?±?12.6?pg/ml）水平显著高于QKI-6拯救的SCPs（BDNF：8.2?±?1.4?pg/ml；NGF：92.6?±?9.2?pg/ml）和QKI缺乏的对照组（BDNF：2.3?±?1.1?pg/ml；NGF：53.7?±?10.7?pg/ml）。为了评估这些变化的功能后果，我们用来自每个拯救组的培养基处理了SH-SY5Y神经元。与QKI-6或QKI-7拯救条件下的培养基相比，暴露于这两种培养基的神经元显示出显著增强的轴突生长。有趣的是，尽管QKI-7培养基中的神经营养因子水平较高，但两个拯救组之间的轴突长度相当。这一观察结果表明，可能存在神经营养信号传导的饱和阈值或由QKI-6依赖的途径介导的补偿机制。这些发现共同揭示了QKI异构体在施万细胞发育过程中具有不同的、阶段依赖性的作用。功能增强分析显示QKI-6和QKI-7在施万细胞谱系扩展和神经营养成熟中具有异构体特异性的作用。为了阐明各个QKI异构体在施万细胞发育中的生理贡献，我们通过在野生型SCPs中异位表达QKI-6或QKI-7进行了功能增强实验（图5a）。通过qPCR验证了成功的异构体特异性过表达（图5b）。通过RNA测序进行的全基因组转录组分析显示实验组间的高度一致性（补充图4a）。差异表达分析显示有808个基因因QKI-6或QKI-7过表达而发生显著变化（补充图4b），而典型的SCP身份基因（如ERBB3、FOXD3、GAP43、ITGA4、MPZ、SOX2、SOX10和TFAP2A）的表达保持稳定（补充图4c），这证实了SCP谱系的忠实性。图5：QKI-6和QKI-7的异位表达分别促进了SCPs的扩展、施万细胞的成熟和神经营养支持。

使用AI生成的替代文本可能如下：

这些发现共同揭示了QKI异构体在施万细胞发育过程中具有不同的、阶段依赖性的作用。功能增强分析表明，QKI-6和QKI-7在施万细胞谱系扩展和神经营养成熟中具有异构体特异性的作用。为了阐明各个QKI异构体在施万细胞发育中的生理作用，我们通过在野生型SCPs中异位表达QKI-6或QKI-7进行了功能增强实验（图5a）。通过qPCR验证了成功的异构体特异性过表达（图5b）。通过RNA测序进行的全基因组转录组分析显示实验组间的高度一致性（补充图4a）。差异表达分析显示有808个基因因QKI-6或QKI-7过表达而发生显著变化（补充图4b），而典型的SCP身份基因（如ERBB3、FOXD3、GAP43、ITGA4、MPZ、SOX2、SOX10和TFAP2A）的表达保持稳定（补充图4c），这证实了SCP谱系的忠实性。

**图5：QKI-6和QKI-7的异位表达分别促进了SCPs的扩展、施万细胞的成熟和神经营养支持。**

**替代文本的生成可能使用了AI：**

这些发现共同揭示了QKI异构体在施万细胞发育过程中具有不同的、阶段依赖性的作用。为了阐明各个QKI异构体在施万细胞发育中的生理作用，我们通过在野生型SCPs中异位表达QKI-6或QKI-7进行了功能增强实验（图5a）。通过qPCR验证了成功的异构体特异性过表达（图5b）。通过RNA测序进行的全基因组转录组分析显示实验组间的高度一致性（补充图4a）。差异表达分析显示有808个基因因QKI-6或QKI-7过表达而发生显著变化（补充图4b），而典型的SCP身份基因（如ERBB3、FOXD3、GAP43、ITGA4、MPZ、SOX2、SOX10和TFAP2A）的表达保持稳定（补充图4c），这证实了SCP谱系的忠实性。

**实验流程示意图：**
a. 在施万细胞前体（SCPs）中异位表达QKI-6或QKI-7。
b. 对过表达QKI-6和QKI-7的SCPs（QKI-6-SCPs和QKI-7-SCPs）及其分化的施万细胞（SCs）进行功能分析。
c. 使用定量PCR（qPCR）分析未修饰的SCPs（对照组）、QKI-6-SCPs和QKI-7-SCPs中的QKI-5、QKI-6和QKI-7表达。基因表达以GAPDH为基准进行标准化。数据以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
d. 基于GFP/SOX10共表达，在传代2时量化SOX10? SCPs的扩展情况。数据以平均值±标准差（n=4个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
e. 基于GFP/S100B共表达，量化对照组、QKI-6-SCPs和QKI-7-SCPs分化为S100B? SCs的效率。数据以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
f. 基于GFP表达，在移植后第8天和第12天对SCPs的扩展情况进行时间进程分析。数据以平均值±标准差（n=4个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
g. 在同一组中对QKI-5、QKI-6和QKI-7进行qPCR分析。基因表达以GAPDH为基准进行标准化。数据以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
h. 在同一组中对QKI异构体进行免疫印迹分析。使用GAPDH作为加载对照。
i. 在同一组中对SC标记基因（S100B、NGFR、MPZ、EGR2、MBP和GFAP）进行qPCR分析。基因表达以GAPDH为基准进行标准化。数据以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
j. 在同一组中对神经生长因子基因（NGF、NT3和IGFBP2）进行qPCR分析。基因表达以GAPDH为基准进行标准化。数据以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）表示。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
k. 使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）量化来自同一组的条件培养基（CM）中分泌的脑源性神经生长因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）的水平。数据以pg/ml表示，以平均值±标准差（n=3个独立生物学重复）呈现。统计显著性采用双尾Student’s t检验进行评估。*P<0.01（与对照组相比）。
l. 使用AxioVision软件对每组135-167个细胞进行测量，量化平均神经突长度。数据以平均值±标准差表示。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后多重比较。*P<0.01。

**KEGG通路富集分析：**
差异表达基因的KEGG通路富集分析表明，QKI异构体参与了细胞黏附和轴突导向等生物过程（补充图4d），表明QKI异构体影响细胞骨架重塑和对环境的响应性。QKI-6和QKI-7均增加了包括CCNB1、CCNB2、CCNE1、CDK14、CDK2AP1、CCND2和CCNC在内的关键有丝分裂调节因子的表达（补充图4e），表明其具有增强的有丝分裂活性。

在细胞水平上，QKI-6的过表达在连续传代过程中显著增加了SOX10? SCPs的数量，表明其在维持前体细胞增殖中的作用（图5c）。相比之下，QKI-7对SCPs的维持影响较小，这与在救援模型中观察到的有限效果一致。在诱导分化时，两种异构体都增加了SCs的数量（图5d），尽管QKI-7过表达产生的存活SCs数量显著高于QKI-6。纵向分析显示QKI-7支持SCs的持续扩展，表明其具有增强的存活和成熟能力（图5e）。在分化过程中，异构体的表达保持稳定（图5f, g），关键的SC谱系标记物（包括S100B、NGFR、MPZ、EGR2、MBP和GFAP）在各组间保持相似（图5h）。

**转录组分析：**
神经生长因子程序的转录组分析显示，QKI-7比QKI-6更强烈地诱导了NGF、NT3和IGFBP2的表达（图5i）。QKI-6过表达和QKI-7过表达的SCs的培养基（CM）共同上调了再生因子，如G-CSF、GDNF、GM-CSF、β-NGF、NT-3、NT-4、PDGF亚型、PLGF、SCF、VEGF-D、多种IGFBPs（IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4和IGFBP6）以及TGF亚型（TGF-β1和TGF-β3）和受体（包括IGF-1R、M-CSFR和VEGFR-3）（补充图5a,b）。值得注意的是，只有QKI-7-CM表现出FGF-4、FGF-6、IGF-1、M-CSF和TGF-α的水平升高，表明其具有更广泛和更专业的神经营养分泌组。

**ELISA分析：**
ELISA证实，QKI-7过表达的SCs分泌的BDNF和NGF水平高于QKI-6过表达的细胞和对照组（图5j）。功能上，QKI-7过表达的SCs培养基诱导的SH-SY5Y神经元的神经突生长显著长于QKI-6过表达或对照组的SCs培养基（图5k,l）。这一结果与QKI缺陷的救援设置不同，在后者中两种异构体将神经突延伸恢复到相似水平（图4k,l），表明QKI-7的完整神经再生潜力可能依赖于完整的内源性QKI网络或特定的转录环境。这些数据共同表明，QKI-6主要支持SCPs的增殖和早期扩展，而QKI-7驱动终末SCs的成熟和神经营养特化。

**QKI-7过表达在体内增强施万细胞介导的外周神经再生：**
为了评估QKI异构体在促进神经修复方面的转化潜力，我们使用小鼠SNT模型移植工程化的人类胶质细胞系细胞来评估它们的再生效果（图6a）。生成了两个对照组：一个包含NCSCs、SCPs和QKI-7-SCPs的前体阶段组，另一个由QKI-6-SCP-SCs和QKI-7-SCP-SCs组成的终末分化组。

**图6：**
QKI-7过表达的施万细胞在体内 sciatic 神经损伤后促进外周神经再生。

**替代文本的生成可能使用了AI：**

**实验设计示意图：**
使用 sciatic 神经切断（SNT）小鼠模型。将GFP标记的神经嵴干细胞（NCSCs）、施万细胞前体（SCPs）或 SC-Schwann 细胞（SCs）移植到损伤部位。在定义的时间点使用旋转棒测试评估运动功能，并在移植后8周收集组织进行分析。
**b.** 在移植前和移植后8周，对接受 PBS（对照组）、NCSCs、SCPs 或 QKI-7-SCPs 的小鼠进行运动协调评分，测量跌倒的潜伏期。旋转棒协议包括一个加速阶段（4–40 rpm，持续3分钟）和一个恒速阶段（40 rpm，持续2分钟）。评分代表每只小鼠三次试验的平均跌倒潜伏期，试验间隔为10分钟。数据以平均值±标准差（n=3只动物/组）表示。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后多重比较进行评估。*P<0.01。
**c.** 移植后8周，对纵向 sciatic 神经切片进行免疫荧光染色，检测髓鞘碱性蛋白（MBP）。比例尺，200 μm。
**d.** 在移植部位量化再生指数。顶部：代表供体细胞植入的GFP?区域。底部：代表髓鞘化的MBP?区域。数据以平均值±标准差（n=3–6只动物/组，取决于实验可用性）表示。统计显著性通过单因素ANOVA后进行Tukey事后多重比较进行评估。*P<0.01。
**e.** 在移植后8周，使用与部分b相同的旋转棒协议，对移植了SCP-SCs（对照组）、QKI-6-SCP-SCs 或 QKI-7-SCP-SCs 的小鼠进行运动表现评分。数据以平均值±标准差（n=3只动物/组）表示。统计显著性通过单因素ANOVA后进行Tukey事后多重比较进行评估。*P<0.01。
**f.** 移植后8周，再生 sciatic 神经长度的代表性图像（顶部）和量化结果（底部）。再生长度（mm）反映了轴突的生长。数据以平均值±标准差（n=3只动物/组）表示。统计显著性通过单因素ANOVA后进行事后多重比较进行评估。*P<0.01。
**g.** 在移植后8周，对 sciatic 神经切片进行免疫荧光染色，检测S100B（髓鞘化 SCs，顶部）、神经生长因子（NGF，神经营养因子，中间）和Tuj1/MBP（神经元和髓鞘标记物，底部）。比例尺，200 μm。
**h–m.** 在移植的神经段中量化再生标记物。GFP?区域（供体细胞植入）（部分h和j）；S100B?区域（髓鞘化 SCs）（部分i）；NGF?区域（神经营养支持）（部分k）；Tuj1?和MBP?区域（部分l和m）。数据以平均值±标准差（n=3只动物/组）表示。统计显著性通过单因素ANOVA后进行Tukey事后多重比较进行评估。*P<0.01。**

**所有行为评估和组织学分析均在移植后8周进行。**
使用旋转棒测试在细胞移植后8周进行运动协调评估。在这一移植后评估中，所有前体来源的移植组都显著改善了运动表现，与PBS处理的损伤后对照组动物相比。在这些组中，移植了QKI-7-SCPs的小鼠表现出最大的改善，表现为跌倒潜伏期显著延长（对照组：88.9±4.56秒，NCSCs：133.2±2.45秒，SCPs：144.0±2.23秒，QKI-7-SCPs：173.8±2.29秒；图6b）。在移植后8周进行的纵向 sciatic 神经切片免疫组化分析显示，SCPs 和 QKI-7-SCP 组中供体细胞植入和髓鞘再生明显。定量分析显示，QKI-7-SCP 受体的髓鞘化区域显著大于其他前体来源的移植组。

**在施万细胞移植组中，**
QKI-6-SCP-SCs 和 QKI-7-SCP-SCs 在移植后8周显著增强了运动恢复，其中 QKI-7-SCP-SCs 的功能益处最大（对照组：86.9±0.8秒，QKI-6-SCP-SCs：149.2±4.4秒，QKI-7-SCP-SCs：195.0±2.86秒；图6e）。在同一移植后时间点进行的形态测量分析证实，QKI-7-SCP-SC 移植物生成了最长的再生神经桥（对照组：7.46±0.26毫米，QKI-6-SCP-SCs：9.84±0.51毫米，QKI-7-SCP-SCs：12.48±0.27毫米；图6f）。与这些发现一致，移植后8周的免疫组化评估确认所有移植组中供体细胞广泛植入，如GFP?细胞分布所示（图6g,h,j）。值得注意的是，QKI-7-SCP 受体显示最多的S100B?施万细胞（图6g,i）和最高的NGF?免疫反应性（图6g,k），这与体外观察到的增强神经营养因子表达一致。此外，QKI-7-SCP 组的轴突再生最为明显，如扩大的Tuj1?轴突和MBP?髓鞘纤维域所示（图6g, l,m）。

**总之，**
这些结果表明，QKI-7通过促进终末施万细胞的成熟和神经营养能力，在体内增强移植后的功能恢复和组织再生。尽管QKI-7对早期前体细胞扩展的影响较小，但其对移植后结果的影响突显了其在驱动再生效果中的阶段特异性作用。结合QKI-6对早期SCPs存活和扩展的互补作用，这些发现支持QKI异构体协调调节施万细胞介导的外周神经修复的双重功能模型。这些发现揭示了一个先前未被充分认识的在PNS（周围神经系统）中由QKI介导的调控层，其作用超出了QKI在中枢神经系统（CNS）髓鞘形成中的已知角色。在中枢神经系统中，QKI的不同亚型被分隔开来，以支持胶质细胞发育的不同阶段：QKI-5介导核内RNA的剪接和输出，而细胞质中的QKI-6和QKI-7则调节mRNA的翻译和稳定性，包括关键的髓鞘相关转录本如MAG和MBP12、14、16、25、26、27。然而，它们在人类周围胶质细胞中的作用仍很大程度上尚未明确。在这里，我们证明了QKI-6和QKI-7在周围胶质细胞分化过程中被动态诱导，并执行不同的但互补的功能，这些功能对维持神经鞘的稳态和神经细胞的特化至关重要。

功能缺失研究显示，QKI对于维持神经鞘的促有丝分裂转录程序是必不可少的。QKI的敲低导致核心的G1/S和G2/M调控因子（CCNE1、CCNB1和CDK14）下调，同时上调细胞周期抑制剂（如CDKN1B，已知是QKI的靶点）28、29，最终导致细胞周期停滞、Ki67?增殖减少和凋亡增加。这些效应伴随着PI3K/AKT和MAPK通路（典型的促有丝分裂轴）的抑制，表明有丝分裂过程受到破坏。这些发现与QKI在祖细胞稳态中的关键作用一致，这一作用此前已在少突胶质细胞前体细胞和胶质瘤细胞中得到描述28、30、31。同时，全转录组水平的剪接分析在神经鞘细胞中识别出超过800个由QKI调控的可变剪接事件，其中许多事件涉及细胞骨架重塑、细胞内运输和神经发育相关基因。值得注意的是，我们观察到PLP1和PMP22这两个基因的亚型发生了病理变化，这两个基因分别与Pelizaeus–Merzbacher疾病21、32、33和CMT1A20、34相关。这些数据表明QKI作为周围胶质细胞转录组稳定性的分子守门人，可以防止在细胞谱系分化过程中出现疾病相关的剪接变异。

从功能上看，QKI缺陷的神经鞘细胞保留了其谱系特征，但无法维持神经营养因子的产生，表现出存活率降低和对神经突生长支持的减弱。亚型特异性的拯救实验进一步明确了这一差异：QKI-6恢复了细胞增殖并减轻了凋亡16、30、35、36，而QKI-7恢复了神经生长因子的表达，但对有丝分裂的影响有限9、16、18、24、28、37。这些发现表明QKI-6和QKI-7之间存在功能分工，QKI-6负责维持祖细胞的稳态，而QKI-7则调节终末分化和分泌组的成熟。与此模型一致的是，在野生型神经鞘细胞中过表达QKI-6增强了它们的增殖能力，而不改变其谱系特性；而QKI-7则加速了施万细胞的分化，并促进了再生性营养特性的形成。蛋白质组学分析显示，这两种亚型都分泌了关键的神经营养因子和促再生因子，包括NGF、NT-3、GDNF、IGFBPs、PDGFs和TGF-βs38、39、40、41。然而，QKI-7独特地增加了FGF-4、FGF-6、IGF-1、M-CSF和TGF-α等因子的分泌，这些因子已知能够支持施万细胞的成熟、巨噬细胞介导的细胞重塑和细胞外基质的重组42、43、44、45。重要的是，来自QKI-7过表达神经鞘细胞的培养基（CM）比QKI-6或对照组更能促进SH-SY5Y神经元的神经突生长，证实了其更强的神经再生潜力。值得注意的是，这种增强的神经营养活性在用QKI-7恢复的QKI缺陷细胞中并未重现，这表明其全部功能可能需要完整的QKI依赖性网络或协同作用的RNA结合蛋白的存在。相比之下，QKI-6似乎提供了更广泛的转录组稳定性，即使在没有内源性QKI的情况下也能部分恢复功能。这些观察结果突显了亚型活性的情境依赖性以及QKI-6和QKI-7功能的非冗余性。

在体内实验中，将过表达QKI-6或QKI-7的神经鞘细胞移植到SNT（感觉神经轴突）模型中显著增强了运动恢复和神经再生。尽管QKI-6促进了祖细胞的存活和移植，但QKI-7带来了更显著的再生效果，包括更多的S100B?施万细胞再生、更大的NGF?营养区大小以及更广泛的MBP?和Tuj1?轴突再生。值得注意的是，尽管增殖能力相当，QKI-7过表达的神经鞘细胞的表现优于未修饰的神经鞘细胞和神经干细胞（NCSCs），这表明QKI-7加速了移植后具有营养能力的施万细胞表型的获得。这些发现支持了一个双功能模型：QKI-6确保了祖细胞池的完整性，而QKI-7则调控终末分化和神经营养特性的形成。这项工作提供了重要的转化医学见解。目前用于周围神经修复的策略，包括自体神经移植、间充质基质细胞和部分特化的前体细胞，都受到谱系稳定性差、营养输出有限或移植效果不一致的困扰46、47、48、49、50。相比之下，基于QKI亚型的工程化方法通过精确的转录后调控能够生成谱系稳定的、具有修复能力的神经鞘细胞类似细胞。与可能破坏谱系特性的转录因子重编程不同，QKI靶向的方法在增强功能的同时保持了细胞的命运。总之，我们的发现确立了QKI-6和QKI-7作为人类施万细胞谱系发育的顺序调控因子。QKI-6以时间协调的方式发挥作用，支持祖细胞的扩增和转录组稳定性，而QKI-7则驱动神经营养程序和再生功能。它们亚型特异性的、情境依赖性的作用为胶质细胞工程提供了一个强有力的范例，并将QKI的调控确定为一种可用于周围神经修复的临床策略。未来在慢性损伤模型、炎症性神经病变和大间隙重建中的研究将有助于验证这种方法的治疗持久性和可扩展性。