两种希腊橄榄品种对水分亏缺的适应性初步研究

《Physiology and Molecular Biology of Plants》：Primed acclimation of two Greek olive cultivars to water deficit

　　**摘要**
气候变化加剧了水资源短缺问题，这对地中海地区的橄榄种植构成了威胁。了解橄榄品种对干旱的响应机制是制定策略以维持这一重要作物生产的关键。在本研究中，我们研究了两种希腊橄榄品种“Lefkolia Serron”和“Chondrolia Chalkidikis”对水分限制的响应，并通过长期逆境处理（priming）来评估它们的适应能力。我们结合了形态生理参数、初级代谢物分析以及与干旱相关的基因表达分析来开展研究。研究结果表明，这两种品种采取了不同的策略来应对水分短缺。具体而言，“Lefkolia Serron”表现出更为保守的响应方式，在重新面临干旱时仍能保持较高的光合作用效率、内在水分利用效率（iWUE）和抗氧化活性；而“Chondrolia Chalkidikis”则对干旱更为敏感，在形态生理、代谢和基因表达层面表现出更显著的变化。代谢组学数据揭示了植物在干旱周期中的能量代谢变化，而基因表达模式的主成分分析表明，长期干旱逆境处理能够调节转录过程，使处理过的植株与对照组趋于一致。预先经历干旱会形成一种“转录记忆”，使植物在反复遭受干旱时能够更有效地作出反应。这些发现表明，长期干旱逆境处理可能作为一种应对恶劣环境条件的策略，但其效果依赖于基因型，因为不同基因型的响应结果存在差异。了解橄榄的干旱响应机制并应用诸如长期干旱逆境处理这样的环保策略，是保护这一作物免受环境威胁的可持续方法。

**引言**
气候变化导致环境条件变得更加频繁和极端，威胁着许多农业系统，包括橄榄种植（Brito等人，2019年）。地中海地区作为橄榄种植的主要产区，越来越容易受到干旱和极端高温的影响（Devot等人，2023年）。值得注意的是，欧盟超过60%的与气候相关的农业损失归因于干旱（Naumann等人，2021年）。2024年10月的综合干旱指数（CDI）显示，地中海南部地区，特别是意大利和希腊，持续处于干旱警戒状态，这对植被造成了严重后果（https://joint-research-centre.ec.europa.eu/european-and-global-drought）。尽管橄榄具有一定的耐旱性，但极端干旱事件已经对这些地区的生产造成了损害（Brito等人，2019年）。这些条件导致果实变小、脱水，油含量降低，从而推高了市场价格。除了水资源管理和适应性措施外，培育耐旱橄榄品种并理解其适应机制对于在干旱地区保护这一标志性作物至关重要。希腊作为地中海生物多样性的热点地区，拥有许多尚未进行抗逆性遗传评估的本地品种（Bazakos等人，2023年；Tourvas等人，2023年）。

橄榄树的耐旱性已有充分研究，涉及多种生理和分子机制（Fernandes等人，2018年）。缺水条件下植物的主要生理变化包括叶片卷曲、气孔关闭和叶绿素含量下降（Trabelsi等人，2019年）。这些变化与叶片表面的蜡质层和密集的毛状体共同作用，减少了整体水分损失（Nteve等人，2024年）。除了地上部分的调整外，植物还会调整根系与地上部分的比例，发展更深更广泛的根系以在干旱条件下最大化水分吸收（Tankari等人，2021年）。橄榄树还会产生多种渗透保护物质，如糖类、蛋白质和氨基酸（Skodra等人，2021年）。糖类有助于植物的“甜味免疫”机制，其中单糖（如葡萄糖和果糖）和二糖（如蔗糖和海藻糖）在维持渗透平衡和保护细胞完整性方面发挥关键作用（Kumar等人，2021年）。此外，氨基酸还调节离子通道、氧化应激防御和基因表达途径（Heidarzadeh，2025年）。这些可溶性化合物的积累增强了细胞的渗透压，促进了水分吸收，从而维持了细胞内的水分平衡。这些生理和生化变化与干旱诱导的基因表达变化相关，这些变化导致了应激响应蛋白和mRNA的合成（S. Lisar等人，2012年）。参与渗透调节的关键基因，如Late Embryogenesis Abundant（LEA）和Dehydration-Responsive Element-Binding（DREB），调控了渗透保护物质的积累（Priya等人，2019年）。与干旱相关的基因还调控次级代谢产物的合成（如黄酮类、萜类化合物），并激活抗氧化防御系统（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），以减轻干旱条件下的氧化损伤（Hasanuzzaman等人，2020年）。此外，水通道蛋白通过参与跨膜的水分运输，维持了植物的水分传导性，从而在干旱期间提供了更好的适应能力（Paw?owicz和Masajada，2019年）。MAPKs（丝裂原活化蛋白激酶）等基因作为信号转导因子，激活了应激响应途径（Mahmood等人，2020年）。类似地，参与ABA信号传导的Pyrabactin Resistance 1-like（PYL-like）基因参与了气孔调节并提高了干旱条件下的水分利用效率（Wang等人，2025年），而myeloblastosis（MYB）和WRKY转录因子则参与了渗透胁迫响应和干旱诱导的氧化应激防御（Price等人，2022年）。最新研究表明，小RNA的参与调节了干旱响应基因，为水分不足提供了额外的转录后防御机制（Li等人，2024年）。

结合植物在生理、形态、代谢和分子层面的多方面响应数据，不仅有助于培育耐旱橄榄品种，还揭示了植物的“应激记忆”机制（Nteve等人，2024年；Skodra等人，2023年），这种机制使得植物能够更快更有效地应对反复出现的胁迫（Lagiotis等人，2023年）。通过应激记忆诱导植物韧性需要一个初始的胁迫事件（即逆境处理）。Liu等人（2022a）也发现了橄榄植物中的应激记忆形成机制。Ben Abdallah等人（2017年）研究了干旱对突尼斯耐旱性较差的“Chétoui”橄榄品种的逆境处理效果，发现预先经历干旱处理可以提高其耐旱性。在后续研究中，同一团队使用盐逆境处理诱导了“Chétoui”橄榄的干旱记忆，改善了其在干旱条件下的生理和生化响应（Ben Abdallah等人，2022年）。

本研究旨在深入探讨两种主要种植于希腊北部的橄榄品种“Lefkolia Serron”和“Chondrolia Chalkidikis”对干旱的响应机制及其通过长期逆境处理的适应能力。这些品种以其果实和橄榄油的质量特性而闻名。本研究有两个主要目标：（i）剖析这两种橄榄品种在干旱胁迫下的不同生理、形态、代谢和基因表达响应；（ii）评估它们通过长期逆境处理的适应能力。这些发现将有助于理解橄榄树的耐旱机制，优化抗旱品种的选育，并识别天然耐旱基因型。这些策略对于确保橄榄种植在气候变化加剧的挑战中的韧性和可持续性至关重要。

**材料与方法**
本研究使用了两年生的“Lefkolia Serron”（LS）和“Chondrolia Chalkidikis”（CC）橄榄品种。实验在塞萨洛尼基亚里士多德大学的温室条件下进行，时间为2020年6月至10月。平均温度在19.1至27.1°C之间，平均相对湿度在44%至79%之间。共使用了90株植物，每种品种各45株。植物种植在3升容量的盆中，盆土与珍珠岩的比例为4:1（体积比）。

**实验设计与干旱胁迫处理**
实验包括两个干旱期和一个恢复期，以模拟实际环境中的水分供应变化。第一个干旱期被用作逆境处理阶段。实验采用完全随机区组设计（CRD），每个处理有15株植物（生物学重复）。处理措施包括不同的灌溉方案：（i）对照组（C），持续且充足的水分供应（80%的田间持水量，FC）；（ii）处理组（P），在第一个干旱周期经历逆境处理（15%的田间持水量），随后进行恢复期（80%的田间持水量），然后再经历第二个干旱周期（15%的田间持水量）；（iii）未处理组（NP），在前两个阶段处于最佳灌溉条件下（80%的田间持水量），但在第三个阶段经历一次干旱周期（15%的田间持水量）（图1）。实验设计参考了Ben Abdallah等人（2017年）的相关文献（Hilker等人，2016年；Turgut-Kara等人，2020年）。43天的逆境处理加上显著减少的水分供应可以被视为长期干旱逆境处理。水分通过重量法施加，通过定期称重并在实验期间大约每2天重新浇水来维持盆土的目标重量。每盆添加的水量根据盆土的目标重量（PT）计算，公式如下：
$$ {\text{PT }} = {\text{PD }} + {\text{MW }} + {\text{FC }} \times \, \left( {{\text{PW }} - {\text{PD}}} \right) $$
（1）
其中PD和PW分别是移植前盆土的干重和湿重，目标重量根据在同一条件下生长的植物的地上生物量进行调整（Stavridou等人，2019年）。在实验期间的三个关键时间点收集叶片样本，并储存在-80°C下进行进一步分析。

**图1**
干旱胁迫和逆境处理的实验设计。设计包括三种灌溉处理（对照组、处理组和未处理组），每种处理每种品种各有15株植物。所有植物均按照田间持水量（FC）进行灌溉。对照组在整个实验期间（102天）保持80%的田间持水量。处理组首先经历43天的长期干旱逆境处理（15%的田间持水量），随后进行38天的恢复期（80%的田间持水量），然后再经历21天的第二个干旱周期（15%的田间持水量）。未处理组在前两个阶段处于最佳灌溉条件下（80%的田间持水量），但在第三个阶段经历一次干旱周期（15%的田间持水量）。

**生理参数**
评估了包括相对叶绿素含量、二氧化碳同化率（A）、蒸腾作用（E）、气孔导度（gs）和叶绿素a荧光（Fv/Fm）在内的生理参数。为了捕捉实验期间植物水分状态的变化，在每个处理的六个生物学重复样本中，在研究的三个不同阶段各测量一次（见表1）。

**表1**
实验时间点及对应的生理测量日期

**相对叶绿素含量**
相对叶绿素含量（RCC）的测定方法参考了Stavridou等人（2017年）。在每株植物的上半部分，选取三片完全展开的叶片的叶面进行测量，使用的是CCM-200叶绿素含量计（Opti-Sciences, Inc.，美国新罕布什尔州哈德逊）。每次测量是每片叶片三次独立测量的平均值。

**叶绿素α荧光**
利用OS30p叶绿素荧光计（Opti-Sciences, Inc.，美国新罕布什尔州哈德逊）测量了光系统II的最大量子产额（Fv/Fm），作为PSII光损伤的指标（Stavridou等人，2017年）。叶片在光屏蔽夹的封闭下适应黑暗环境30分钟。记录了叶绿素α荧光参数，如FO（最小荧光）和Fm（最大叶绿素荧光），并计算PSII的最大量子产额效率：Fv/Fm = (Fm - Fo) / Fm。

**气体交换测量**
使用便携式LCi T紧凑型光合作用系统气体交换分析仪（ADC BioScientific Ltd，英格兰赫茨）在8:00至12:00之间对每株植物完全展开的叶片进行了A、E、gs的气体交换测量（Skodra等人，2023年）。内在水分利用效率（iWUE）用于评估植物在干旱条件下平衡水分流失和碳同化的能力，计算公式为：iWUE = A / gs。

**形态测量**
实验结束时（Τ3），评估了几个形态参数，以评估植物在干旱压力下的表现以及干旱周期数量（两次对比一次）的影响。测量了每种处理下六株植物的茎和根的长度（厘米）。关于干物质积累，收获了每种处理下的六株植物。将植物分为根部和茎部，并测量其新鲜重量。将根部和茎部在70°C下干燥72小时后测量干重量。使用根茎比（R/S = 根干重量 / 茎干重量）来评估生物量分配。为了确定不同植物组织中的水分状态，计算了茎部（WCS）和根部（WCR）的水分含量：WC = [(新鲜重量 – 干重量) / 新鲜重量] × 100。

**代谢组学分析**
对橄榄叶片进行了初级代谢物的代谢组学分析，以研究其代谢谱的变化。在三个实验时间点（T1、T2和T3）收集了每种处理下三株植物的叶片，具体总结在表1中，并在Karagiannis等人（2021年，在线资源1）中描述。GC–MS分析使用的是Perkin Elmer Clarus? SQ 8仪器（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），具体方法如Skodra等人（2023年）所述。使用OpenChrom软件对鉴定出的化合物的峰面积进行量化，以便可靠地整合和分析色谱数据。化合物的鉴定基于标准品或NIST11或GOLM代谢组数据库（Michailidis等人，2019年）。代谢物以阿多醇的相对丰度表示，并提供在补充材料在线资源5中。

**基因表达分析**
进行基因表达分析以补充和验证生理和代谢组学结果。在最终时间点（T3）采集了十八个叶片样本，包括每个处理的三个生物学重复样本，用于确定特定干旱响应基因的表达谱。根据制造商的说明，使用NucleoSpin? RNA Plant Kit（Macherey–Nagel，德国）提取总RNA。使用Quawell UV Vis分光光度计（Q5000 US）评估RNA浓度和纯度，并在2%琼脂糖凝胶上确认RNA完整性。然后使用Superscript II逆转录酶试剂盒（Invitrogen，美国）进行cDNA合成，每个反应中使用500 ng的总RNA。在Applied Biosystems StepOnePlus?实时PCR系统上进行实时定量逆转录PCR（qRT-PCR），使用比较Ct方法。使用三个生物学cDNA样本和每个样本的两个技术重复来确定反应的准确性和重复性（补充材料，在线资源2）。数据使用ΔΔCt方法进行分析，并表示为2?ΔΔCt（Livak和Schmittgen 2001）。设计了针对干旱胁迫相关关键基因家族的引物，具体信息在补充材料在线资源2中。基因序列来自Phytozome数据库，使用PrimerQuest设计引物。此外，使用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证了所设计引物的特异性。在基因表达分析中，使用 elongation Factor 1-alpha (EF1A) 基因作为参考基因（Ray和Johnson 2014）。

**统计分析**
为了比较两个品种、三种处理之间的差异以及同一时间点品种×处理的交互作用，计算了所有生理、形态、代谢组和基因表达数据的平均值和标准差。在分析之前，代谢组数据集进行了log2转换。进行双向方差分析（two-way ANOVAs）以检测统计显著性差异，然后使用Tukey的Honesty Significant Difference (HSD) post hoc检验进行均值分离。使用以下公式计算补水后（T1 vs T2）和两个干旱周期之间（T1 vs T3）的生理参数的百分比变化：$$\frac{(New value-Old value)}{Old value}\times 100$$。使用欧几里得距离和平均链接方法对代谢物丰度数据进行层次聚类，以识别代谢物组。随后使用基于平均相关性的热图来可视化这些代谢物之间的成对关系和共调节模式。还进行了主成分分析（PCA）以解释基因表达数据。所有统计测试的显著性水平预设为α = 0.05（p值≤0.05）。分析和可视化在OriginPro、GraphPad、SRplot和ClustVIS软件中进行。

**结果与讨论**
在本研究中，两种以希腊为导向的橄榄品种“Lefkolia Serron”（LS）和“Chondrolia Chalkidikis”（CC）接受了干旱胁迫和长期处理，以研究它们的形态生理、生化和分子响应，并确定先前的胁迫暴露是否增强了干旱耐受性。

**处理增强干旱适应能力**
通过形态生理调整，LS和CC处理后的植物在各个阶段（T1 vs T2，T1 vs T3）的生理性状百分比差异显示出基因型特异性响应（表2）。CC在补水后（T1 vs T2）的光合速率（A）、蒸腾速率（E）和气孔导度（gs）恢复得明显更好。然而，在两个干旱周期后，LS的iWUE增加更多，并表现出更保守的水分管理策略。尽管LS的gs较高，但这并未导致E的相应增加，而在CC中，较高的gs与更大的水分流失相关。

**叶绿素含量和PSII效率的基因型依赖性变化**
在43天的干旱后（T1周期），相对叶绿素含量（RCC）在不同处理或品种之间没有显著差异（图2a）。同样，Boussadia等人（2023）在45天的胁迫期间观察到大多数突尼斯橄榄品种的RCC没有减少。然而，在24小时的补水后（T2），两种品种的RCC有显著差异（图2b）。LS处理后的植物显示出0.3%的轻微增加，表明恢复有限（表2）。相比之下，CC处理后的植物显示出2.05%的减少，表明补水后的响应较慢或可能无效（表2）。在T3（图2c），两种品种的处理后植物的RCC都高于未处理植物，尽管没有统计学上的显著性。CC增加了16.3%，而LS仅增加了0.81%。这与Ben Abdallah等人（2017）的报告一致，他们发现处理后的橄榄RCC增加。CC中RCC的增加表明处理可能促进了叶绿素的保留，可能是为了保护光合机制（Sintaha等人，2022）。

**叶绿素α荧光揭示光系统II的功能状态**
叶绿素α荧光揭示了光系统II（PSII）的功能状态以及在过量光照下的光损伤程度（Petridis等人，2012）。然而，PSII对水分亏缺的相对耐受性高于PSI，只有在严重干旱条件下才会出现负面影响（Lauriano等人，2006）。在我们的研究中，43天的干旱（图2d）和补水（图2e）并未显著影响不同处理间的(Fv/Fm)，但LS的值显著高于CC，表明PSII的光降解较少。同样，Ben Abdallah等人（2017, 2018）报告说，在干旱胁迫下的“Chétoui”橄榄植物的Fv/Fm未受影响，表明PSII效率得以保持。尽管处理效果不显著，但品种差异突显了遗传背景在干旱胁迫韧性中的重要性。在T3（图2f），经过最后的21天干旱后观察到显著差异。LS处理后的植物Fv/Fm仅减少了0.24%（表2），表明可能由于处理而增强了光保护。相反，CC处理后的植物Fv/Fm下降了6.23%，表明保护机制有限。这些发现表明LS处理后的PSII在波动的水分条件下更具韧性，可能是由于光保护、抗氧化机制和快速修复过程，使得植物能够在没有显著光合色素变化的情况下恢复（Petridis等人，2012）。另一方面，CC中较低的Fv/Fm表明PSII系统较为敏感（Jat等人，2024）。尽管如此，干旱胁迫下Fv/Fm的轻微下降允许橄榄植物维持电子传输并避免严重的光损伤（Guerfel等人，2009）。

**气孔调节对光合作用的增强作用**
在43天的干旱处理期间，两种品种的处理后植物的A、E和gs显著降低，与水分充足的对照组和未处理植物相比（图3a、d、g）。值得注意的是，LS的A高于CC（图3a），而对于E（图3d）和gs（图3g），两个品种之间没有统计学差异。气孔限制通常会降低光合速率，进一步影响植物生长（Cernusak 2020），这可以解释处理后植物A的减少。在干旱下的橄榄树中，类似的发现也证实了这些参数的减少（Ben Abdallah等人，2017；Petridis等人，2012）。根据Brito等人（2018）的研究，干旱胁迫下gs和A的显著减少是一种水分保存的适应机制。

**作物表现不仅取决于胁迫期间的响应，还取决于胁迫发生前和恢复期间的响应**
在这里，补水24小时后，处理后的橄榄植物在气体交换参数上表现出快速恢复；然而，它们的值仍低于水分充足的植物（图3b、e、h）。T1与T2的比较显示，CC在A（115.6%）、gs（100%）和E（52.4%）方面有显著恢复，而LS分别增加了19.6%、50%和38.3%（表2）。CC的这种快速恢复表明其光合系统能更好地应对补水，且干旱胁迫没有造成不可逆的损伤（Yang等人，2023）。这一趋势可能表明水分吸收和叶片冷却能力部分得到恢复（Sintaha等人，2022）。在第二个干旱阶段（T3），LS的A高于CC（图3c）。在品种内部，处理后和未处理的植物显示出相似的速率，但都低于对照植物。有趣的是，与处理前（T1）相比，经过处理的两种橄榄品种在第二次干旱暴露（T3）期间的气体交换率都有所提高（见图3c、f、i）。这表明处理增强了植物在随后干旱暴露后的生理功能。比较经过处理的植物在两次干旱周期中的表现，我们观察到LS品种的A增加了87.8%，而CC品种则增加了103.9%（见表2）。总体而言，经过处理的植物在第二次干旱暴露后仍保持了光合作用性能，这可能是由于处理的作用。Ben Abdallah等人（2017年）也报告了类似的结果，他们研究了经过处理的橄榄植物；然而，未经处理的植物的光合作用参数受到了负面影响，这可能是由于完全缺水，而我们的实验中水供应仅受到15%的限制。与仅经历一次干旱周期的植物相比，经过处理的两种品种的植物能够有效调节气孔开闭，从而减少通过蒸腾作用的水分损失。Sintaha等人（2022年）也发现，经历两次干旱周期的大豆植物的E和gs值较低，这支持了处理在提高耐旱性方面的潜在益处。这表明先前的干旱经历可能会诱导生理适应，使得在再次遭遇干旱时，植物能够通过调节气孔来改善水分保持，并同时确保光合作用功能的正常进行。基于生理反应的差异，LS和CC品种可能采取了不同的防御策略，这可能是由于它们的遗传特性不同。通常情况下，LS品种在水分充足时采取更为保守的水资源管理方式，而CC品种则对水分短缺更为敏感，并且在有水的情况下恢复得更快。

叶片内在水分利用效率（iWUE）的提高是橄榄植物适应水分亏缺的关键指标。叶片内在水分利用效率（iWUE）代表了光合作用吸收二氧化碳与通过气孔蒸腾失水之间的生理平衡。如图4所示，在所有时间点（T1、T2和T3），两种经过处理的品种的iWUE都显著高于对照组和未经处理的品种，在T3时达到最大值。此外，在所有时间点，LS品种的iWUE都高于CC品种。水分利用效率是一种重要的适应性特征，可以在水分短缺的情况下提高作物产量（Mashilo等人，2017年）。即使在水分恢复后，经过处理的品种的iWUE仍然较高，这表明处理改善了气孔调节，最终优化了光合作用。

在T3阶段，评估了LS和CC品种在不同灌溉处理下的地上部分和根系特征，结果总结在表3中。尽管品种间没有显著差异，但在所有特征上CC品种的表现都优于LS品种，除了地上部分长度之外。在处理方面，新鲜和干燥地上部分重量以及新鲜根系重量都存在显著差异。最佳灌溉条件下，对照组植物在所有特征上表现最佳，其次是未经处理的和经过处理的植物。值得注意的是，经过处理的植物根系长度比未经处理的植物更长。这种差异可以归因于不同干旱周期对根系结构的调整（Calvo-Polanco等人，2019年）。这与先前的研究结果一致，因为在干旱条件下，橄榄品种和其他植物物种更倾向于优先发展根系和增加根系的适应性（Nteve等人，2024年；Tadi?等人，2024年）。虽然干旱减少了经过处理和未经处理的植物的新鲜和干燥地上部分重量，但只有经过处理的植物在新鲜根系重量上表现出显著减少。这可能反映了经过两次干旱处理的植物根系中水分含量的减少。这样的反应可能包括合成渗透保护物质和抗氧化化合物（Fleta-Soriano和Munné-Bosch，2016年）。尽管这些机制提高了橄榄植物的耐旱性，但它们在能量上要求较高，可能会影响根系生物量的产生。

表3显示了在对照组、经过处理和未经处理条件下，LS和CC品种的地上部分和根系的形态和生物量测量结果。

表4展示了LS和CC品种在对照组、经过处理和未经处理条件下，地上部分与根系的比率（R/S）以及地上部分和根系的水分含量（WC）。R/S比率在品种间没有显著差异，但在处理间存在显著差异。经过处理的植物表现出最高的R/S比率，其次是未经处理的植物，而对照组的比率最低。较高的R/S比率表明资源更多分配给了根系生长，较少分配给了地上部分生长，有助于从更深的土壤中获取水分（Nteve等人，2024年；Sadhukhan等人，2024年）。这种能量重新分配，即植物将资源投入到结构强化而非不必要的营养生长中，是通过处理增强韧性的方式，这种机制在其他树种如柑橘属植物中也有所发现（Scialò等人，2025年）。这种调整可以被视为一种在干旱条件下增加水分吸收的耐旱策略。

WC是评估植物水分状况和耐旱性的重要指标（Boussadia等人，2023年）。在对照组和各种处理条件下，地上部分和根系的水分含量（WC）没有显著差异。通常情况下，干旱条件下WC会下降（Gholami等人，2022年），但耐旱品种的水分含量仍高于敏感品种（Karimi等人，2018年）。CC品种的根系较长，根系水分含量略高，尽管没有统计学上的显著性，但这表明其在干旱条件下具有更有效的水分吸收策略。

在T1和T2时期进行的代谢组学分析（补充材料，在线资源3）显示了LS和CC品种在对照组、经过处理和未经处理条件下叶片样本中初级代谢物的相对丰度。在两个时间点，鉴定出了20多种代谢物，包括糖类、糖醇、有机酸、醇类和其他化合物。在T1时期，两种品种的经过处理植物中与压力相关的代谢物增加，如渗透保护物质和有机酸，反映了植物对压力的适应性反应（补充材料，在线资源6）。重新浇水后，LS品种的代谢恢复到正常状态，压力相关代谢物的迹象减少，而CC品种则积累了能量储存化合物，表明了不同的响应策略（补充材料，在线资源7）。这些结果揭示了基因型对干旱压力和恢复的特定代谢调整（Obata和Fernie，2012年）。

图5展示了T3时期橄榄叶片样本的代谢谱，显示了两种品种和不同处理下的不同代谢模式。总共鉴定出24种代谢物，包括糖类、糖醇、有机酸、醇类和其他化合物。代谢物被分为两个主要组（A1-A2），每个组又分为子组B1和B2。处理也被分为两个主要组：A1包括CC品种的对照组，A2包括所有其他处理。在A2组中，CC品种的经过处理和未经处理的植物被归入子组B1；同样，B2组包括LS品种的所有处理。在24种代谢物中，有13种在LS和CC品种间存在显著差异，7种在处理间存在差异，6种在基因型与处理之间存在交互作用（补充材料，在线资源8和在线资源9）。

图5展示了T3时期收集的叶片样本中初级代谢物变化的热图，表示了对照组（C）、经过处理（P）和未经处理（NP）条件下的LS和CC品种。热图显示了以腺苷醇为内部标准的初级代谢物的对数2变换相对丰度（1 mg/mL），蓝色表示代谢物水平降低，橙色表示代谢物水平升高。对于代谢物（左侧）和实验组（顶部）都进行了层次聚类。

在LS品种中，所有处理下的代谢物积累模式相似，表明在不同水分条件下植物表现出稳定的生化调整。经过处理的LS品种中乳酸和甘油酸增加，而赤藓酸减少。乳酸通常与发酵代谢相关，有助于在水分不足时维持细胞pH值和能量平衡。甘油酸促进糖酵解和能量产生途径（Petridis等人，2012年）。反复的干旱周期使橄榄树经历越来越强的代谢调整，涉及有机酸（Dias等人，2021年）。尽管有机酸已被广泛研究，但它们在抗逆中的作用尚未得到充分证明（Panchal等人，2021年）。关于海藻糖，通常在干旱条件下其含量会增加（Shao等人，2022年），但我们的研究表明，LS品种的对照组和未经处理的植物中海藻糖含量增加，而经过处理的植物中海藻糖含量减少。对于LS品种的未经处理植物，检测到阿拉伯糖和蔗糖含量升高，这些代谢物与干旱条件下的渗透调节和能量供应有关。阿拉伯糖是一种多元醇，可以在干旱条件下稳定细胞结构并维持渗透平衡（Bacelar等人，2007年；Kumar等人，2021年）。糖类（如蔗糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、拉芬糖和果糖）的积累是由干旱驱动的，改变了植物中的源-汇关系（Kaur等人，2021年）。这些渗透调节物质和其他兼容溶质在干旱条件下对保护细胞结构起着重要作用（Sharma等人，2019年）。总体而言，LS品种在代谢谱上表现出一致性，表明其通过在不同水分条件下维持稳态来抵抗干旱压力。

在CC品种中，对照组植物显示出独特的代谢谱，特定代谢物有显著变化，而经过处理和未经处理的植物之间的代谢谱相似。与对照组相比，经过处理的和未经处理的植物中肌醇、柠檬酸、葡萄糖、奎宁酸和海藻糖的含量增加。经过处理的植物通常表现出更稳定的代谢谱，这可能是由于“压力印记”，使它们能够在随后的压力事件中更好地调节渗透保护物质（Dias等人，2021年）。尽管未经处理的植物“经验”较少，但它们可能表现出中等的代谢反应，因为它们开始适应干旱条件（Schwachtje等人，2019年）。与经过处理的植物相比，对照组植物中的糖类（如果糖、阿洛糖、蔗糖、半乳糖）和氨基酸（如葡萄糖酸和乳酸）浓度较高。这种初级代谢物的显著增加可能反映了植物在水分充足条件下的代谢反应，将更多资源分配给与正常生长相关的过程（Kumar等人，2021年）。CC品种中处理间代谢活动的这种差异突显了（i）水分可用性对橄榄树及其耐旱适应反应的重要性，以及（ii）遗传特性在决定植物对干旱压力反应中的作用。

为了研究干旱处理对两种橄榄品种分子反应的影响，我们使用RT-qPCR技术在最终时间点（T3）评估了11个干旱响应基因的表达。八个与干旱相关的基因（MAPK5、WRKY11、MI3PS2、ABARPYL4-9、AQP4、DEH10、OesSUSY和SOD2）在干旱处理后的表达存在统计学差异（见图6），而ProDH、STOMCTDEF10和STI1没有显著变化（补充材料，在线资源4）。

特别是，MAPK5在CC品种中的表达高于LS品种（见图6a），两种品种的经过处理植物的表达都高于未经处理的植物。作为细胞外信号转导的关键组成部分，MAPK5可能作为一种分子开关，介导应激适应（Lin等人，2021年）。在经过预处理的植物中，MAPK5的表达增加，与对照植物一样，这支持了干旱预处理有助于维持类似于非应激条件下的转录状态的观点。此外，转录因子WRKY11的表达也表现出类似的模式，在CC中的表达水平高于LS（图6b）。未经预处理的植物表现出更高的WRKY11表达，可能表明它们对胁迫更敏感，而经过预处理的植物则保持了接近对照的中等表达水平，这支持了它们对水分亏缺更有效的响应。WRKY家族能够正向调节多种生理过程，并增强多种木本植物的非生物胁迫响应（He等人，2012年；Yan等人，2014年）。参与合成与干旱相关的渗透保护物质肌醇磷酸的MI3PS2表现出显著的品种与处理之间的交互作用（图6c）。在CC对照植物中，MI3PS2的表达上调，而代谢物肌醇的水平降低（图5），这可能反映了在T3时代谢物合成不完全。CC中MI3PS2的高表达水平可能反映了早期响应，因为在那个特定时间点，相应的代谢物合成尚未完成（Jia等人，2019年）。关于ABA信号通路中的关键成分ABARPYL4-9，它表现出处理特异性差异（图6d）。通常，PYR/PYL/RCAR蛋白被证明可以提高许多植物物种的耐旱性（Pizzio等人，2013年）。在LS中，未经预处理的植物表达最低，而CC中的未经预处理的植物表达最高。这些模式表明了不同基因型对水分亏缺的ABA响应差异（Todaka等人，2019年），其中LS比更敏感的CC保持了更稳定的ABA调节，突显了它们不同的干旱适应策略。水通道蛋白AQP4的表达在LS中高于CC（图6e），表明了明显的品种特异性响应。水通道蛋白（AQPs）有助于水和溶质在水柱中的运输，以及跨膜的无电荷溶质的运输（Moshelion等人，2015年）。AQP4在两种品种的经过预处理和未经预处理的植物中的表达都受到干旱的影响，这与Faize等人（2020年）的研究结果类似，他们在干旱处理后观察到橄榄树的叶片、根部和枝条中的水通道蛋白转录水平有所不同。同样，以渗透保护作用而闻名的脱水素DEH10在LS中的表达也高于CC（图6f）。尽管在各处理组之间没有观察到显著差异，但两种品种的未经预处理的植物都显示出DEH10的轻微增加，这表明首次经历干旱的橄榄植物诱导了更强的脱水素响应。Sezer（2024年）的研究表明，特定脱水素基因在干旱条件下表达水平提高了六倍以上，表明了它们在橄榄树应激响应中的关键作用。有趣的是，经过预处理的植物没有诱导脱水素表达，这表明它们要么调整了应激响应，要么在预处理后需要较少的脱水素。oesSUSY的表达在LS中也高于CC（图6g），这与LS通过增强碳水化合物代谢来表现出更强耐旱性的观点一致。这种表达模式支持了LS的耐旱性，因为已有研究表明在干旱条件下细胞质中的蔗糖合成更高，并且在抗性和敏感品种之间存在差异表达（Thomas和Beena，2021年）。然而，与MI3PS2和肌醇合成类似，转录后和代谢调节机制似乎影响了蔗糖的合成和降解，因为蔗糖水平仅在CC的对照植物和LS的未经预处理的植物中较高（图5）。总体而言，糖代谢参与了橄榄树对干旱的响应和适应，包括简单糖类如蔗糖和葡萄糖水平的变化（Brito等人，2019年）。尽管转录上调，但代谢物水平表明可能存在转录后调节，可能是由于酶的激活或糖的分配（Ren等人，2023年）。相反，SOD2的表达在CC中高于LS（图6h）。通常，水分胁迫和盐度被证明可以诱导橄榄树叶片中SOD活性的增加，SOD是抗氧化防御系统中对抗ROS毒性的最有效成分之一（Mishra和Sharma，2019年）。然而，SOD的调节依赖于基因型，耐胁迫的品种表现出更高的表达水平（El Yamani和Cordovilla，2024年）。在LS中，经过预处理的植物比对照和未经预处理的植物表现出更高的表达，进一步强调了预处理诱导的保护效应。相比之下，CC中经过预处理的植物表现出最低的SOD2水平。这些发现支持了基因型对氧化胁迫的特异性响应，LS似乎从增强的抗氧化防御中受益，而CC则表现出快速但持续时间较短的响应。还进行了主成分分析（PCA）来解释基因表达数据（图7）。结果显示，PC1解释了总方差的48.9%，将不同品种区分开来，而基于PC2，23.8%的方差是由于处理之间的差异。一个有趣的结果是，在每个品种内部，对照植物和经过预处理的植物之间的相对接近性表明，预处理诱导了一种更类似于非应激状态的转录状态。这一点通过将未经预处理的植物与对照和经过预处理的植物分开进一步强调，表明在没有先前暴露于胁迫的情况下，基因表达发生了更强的变化。

图7：最终采样点（T3）的基因表达谱的主成分分析（PCA）结果。该图展示了基于所有分析基因的两种橄榄品种“Lefkolia Serron”和“Chondrolia Chalkidikis”在对照（C）、预处理（P）和未经预处理（NP）条件下的分离。“Lefkolia Serron”的样本显示为蓝色（LC：Lefkolia对照；LP：Lefkolia预处理；LNP：Lefkolia未经预处理），而“Chondrolia Chalkidikis”的样本显示为红色（CC：Chondrolia对照；CP：Chondrolia预处理；CNP：Chondrolia未经预处理）。聚类模式表明了基因型特异性的转录响应差异，“Lefkolia Serron”和“Chondrolia Chalkidikis”形成了不同的组。两种品种的对照（C）和预处理（P）植物在未经预处理的植物（NP）方面更为接近，两者都位于较低的四象限。

结论：在本研究中，我们调查了两种希腊橄榄品种“Lefkolia Serron”和“Chondrolia Chalkidikis”在水分亏缺条件下的响应机制，以及先前应激是否可以作为预处理剂的作用。关于预处理的研究，不同植物物种和胁迫类型的设计差异很大，没有标准化的时间框架，但关键要求是在恢复后施加第二种刺激，以便足以引发与记忆相关的响应（Hilker等人，2016年；H. Liu等人，2022a，b；Turgut-Kara等人，2020年；Vannay等人，2026年）。在我们的研究中，形态生理、代谢组和基因表达数据揭示了这两种品种的干旱适应策略。在LS植物中，长期干旱预处理略微降低了光合作用（T1），但增强了后期的抗胁迫能力（T3），表现为叶绿素α荧光、iWUE、光合作用恢复以及MAPK5、ABARPYL4-9和SOD2的上调。LS的代谢谱也表明了对所有处理的一致生化响应，暗示了应激记忆机制。CC植物在初始干旱期（T1）的形态生理表现下降，但在重新浇水后（T2）表现出强烈的恢复。在CC植物中，预处理在T3的好处有限：尽管叶绿素α荧光和iWUE有所改善，但水分损失仍然存在，表明其干旱适应能力较弱。基因表达分析显示干旱响应途径有轻微激活，但没有伴随的生理收益。此外，代谢组分析表明CC在所有处理中的代谢活动都很高，这意味着这是一种反应性的而非调节性或持续的适应响应。我们的研究结果强调，长期干旱预处理可以是提高橄榄品种耐旱性的有前景的方法。然而，其有效性似乎取决于基因型，这突显了进一步研究分子和生理机制的必要性。CC和LS这两种重要希腊品种对干旱的不同响应突显了它们不同的适应潜力，并证实了它们对于非灌溉橄榄树的重要性。干旱预处理和应激记忆机制的表达进一步表明了它们应对日益变化的气候的能力。这些知识可以直接应用于苗圃和农民，以生产耐旱的繁殖材料，并指导育种计划的选择。使用这种适应性的遗传材料可以帮助农民更高效和低成本地管理作物，特别是在气候变化带来的挑战下。