澳大利亚野生稻（Oryza meridionalis）对完全淹没环境的响应

《Tropical Plant Biology》：Responses of the Australian Wild Rice Oryza meridionalis to Complete Submergence

　　摘要
我们研究了澳大利亚野生稻（Oryza meridionalis Ng.）七个品种中是否存在赋予水稻耐淹性的SUB1A基因，并在四个品种中检测到了该基因。通过系统发育分析发现，O. meridionalis的SUB1A（OmeSUB1A）与O. sativa的SUB1A（OsSUB1A）具有78.6%–78.8%的序列一致性，它与其他AA基因组水稻物种的SUB1A基因分属于不同的分支。携带SUB1A的O. meridionalis品种在淹水条件下并未表现出显著的茎秆伸长现象，反而其SUB1A基因表达增强。相比之下，不携带SUB1A的品种在淹水条件下茎秆伸长明显增加。携带SUB1A的O. meridionalis品种中，SUB1A基因的表达水平与淹水后的存活率呈正相关。此外，在携带SUB1A的O. meridionalis品种中，淹水显著上调了ERF66和ERF67基因的表达，这两种基因在O. sativa中受SUB1A的转录调控，从而帮助其获得耐淹性；然而，在不携带SUB1A的品种中未观察到这种相互作用。这些结果表明，部分O. meridionalis品种携带SUB1A基因，因此能够通过抑制茎秆伸长来适应短期完全淹水环境，其背后的分子机制与耐淹性O. sativa品种相同。

引言
洪水相关的环境压力限制了植物的生长并威胁其生存。由于气候变化，全球洪水发生的频率正在增加（Tanoue等人，2016年）。洪水使植物暴露在缺氧或无氧环境中，限制了它们的有氧呼吸，阻碍了生长；在某些情况下，这可能导致植物过早死亡。然而，一些植物物种具有适应性特征，使它们能够耐受洪水（Bailey-Serres和Voesenek，2008年）。例如，亚洲栽培稻（Oryza sativa）中包含一些对洪水具有适应性的品种（Jia等人，2021年）。在东南亚和南亚的稻米种植区，雨季期间常会出现短期突发性洪水。大多数水稻品种会对突发性洪水作出快速茎秆伸长的反应；然而，这种生长反应往往会导致过度伸长和结构脆弱，从而导致倒伏以及洪水后的生长受损（Ismail等人，2009年）。因此，某些水稻品种被专门选育用于易受洪水影响的环境中，以确保成功生产（Singh等人，2017年）。这类品种表现出的适应性特征之一是耐淹性，通常被称为“休眠策略”。这种策略通过限制茎秆伸长和节约能量来帮助完全淹没的幼苗存活，使幼苗在洪水退去后能够恢复正常生长（Fukao等人，2006年；Xu等人，2006年）。像东印度品种FR13A这样的耐淹性水稻品种可以在完全淹没的条件下存活长达14天（Bailey-Serres等人，2010年）；这种耐淹性主要归因于Submergence1（Sub1）这一重要数量性状位点，该位点包含两个或三个ERF（ethylene RESPONSE FACTOR）转录因子基因，即SUB1A、SUB1B和SUB1C（Xu等人，2006年）。先前的研究表明，所有O. sativa品种都含有SUB1B和SUB1C基因，而SUB1A基因仅存在于少数品种中（Xu等人，2006年）。据认为，SUB1A基因在淹水期间通过抑制茎秆伸长来帮助植物耐受淹水（Xu等人，2006年；Fukao和Bailey-Serres，2008年）。SUB1A的两种等位基因（SUB1A-1和SUB1A-2）在其编码区存在两个单核苷酸多态性（SNP）；其中一个SNP导致第186位氨基酸的变化：SUB1A-1为Ser，而SUB1A-2为Pro。这种替换预计会导致SUB1A-1具有特定的磷酸化位点（Xu等人，2006年）。总体而言，携带SUB1A-1等位基因的水稻品种比携带SUB1A-2等位基因的品种更能耐受突发性洪水。因此，SUB1A-1可能对耐淹性的贡献更大（Xu等人，2006年；Singh等人，2010年）。SUB1A-1对茎秆伸长的抑制至少部分与SUB1C基因的表达下调有关，这可能抑制了碳水化合物代谢（Fukao和Bailey-Serres，2008年；Fukao等人，2006年）。此外，SUB1A-1在淹水条件下上调了ERF66和ERF67基因的表达，而ERF66或ERF67的过表达增强了植物的耐淹性（Lin等人，2019年）。因此，据报道ERF66和ERF67在SUB1A-1的调控级联反应中起下游作用，有助于耐淹性的形成。

O. meridionalis是一种原产于澳大利亚热带地区的野生稻物种，属于AA基因组水稻群（Vaughan，1989年；Moner和Henry，2018年）。该物种具有农艺价值，例如耐热性（Scafaro等人，2010年）和抗铁毒性（Wairich等人，2021年）。在澳大利亚，O. meridionalis分布于沿海和内陆地区。沿海地区受澳大利亚季风影响，在雨季会出现强降雨和洪水（Uehling，2019年）。因此，分布在这些沿海地区的某些O. meridionalis品种可能具有适应洪水环境的特性。

基于国际水稻图谱比对项目（International Oryza Map Alignment Project）获得的测序数据，Dos Santos等人（2017年）在O. meridionalis的SUB1位点内鉴定出一个“类似SUB1B的基因”，并在位点外鉴定出三个“其他类似SUB1的基因”。然而，该研究既未证明这些基因在耐淹反应中的潜在作用，也未明确O. meridionalis中是否存在OsSUB1A的同源基因。我们的初步种质调查发现，在多个O. meridionalis品种中存在一个可通过OsSUB1A特异性引物扩增的基因组区域。如果扩增产物是OsSUB1A的同源基因，那么携带该基因的品种可能具有耐淹性。为了验证这种潜在相关性，我们分析了O. meridionalis中SUB1A的存在及其序列，并评估了其与植物耐淹生长反应之间的关联。此外，我们还分析了O. meridionalis幼苗中SUB1A、SUB1C、ERF66和ERF67基因与生长反应之间的关联。

**材料与方法**
**植物材料**
本研究中使用的七个澳大利亚野生稻（O. meridionalis）品种列于表S1中。作为对照使用了两个O. sativa indica品种：FR13A（来自印度的耐淹品种）和Habiganj Aman II（来自孟加拉国的不耐淹品种）。野生稻品种由日本文部科学省（MEXT）支持的国立遗传学研究所提供。O. sativa品种保存在我们的实验室中。

**处理方法**
野生稻品种的稻粒在42℃下黑暗环境中预处理7天以打破休眠状态，随后在0.5%次氯酸钠溶液中表面消毒30分钟，并用自来水冲洗多次。将稻粒放置在湿润的滤纸上，然后在28℃下培养。每个直径5厘米、高7厘米的塑料盆中播种4粒发芽的稻粒，盆中加入每升土壤0.1克氮（N）、0.1克五氧化二磷（P2O5）和0.1克钾（K2O）。这些植物在7月和8月期间在日本兵库县的实验田中露天种植。整个实验过程中，所有植物都保持营养生长期。

**DNA分析**
从幼苗叶片中提取基因组DNA，使用含有200 mM Tris-HCl（pH 7.5）、250 mM NaCl、25 mM EDTA和0.5% SDS的缓冲液。使用TaKaRa Ex Taq（Takara Bio，日本）和相应的基因特异性引物对（表S2）进行SUB1A、SUB1B和SUB1C的PCR扩增。PCR产物在添加溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上分离，并在紫外光下观察。为了确定从O. meridionalis中扩增的SUB1A、SUB1B和SUB1C的全长序列，使用TksGflex DNA聚合酶（Takara Bio）进行扩增。PCR产物通过凝胶电泳纯化后进行Sanger测序。使用GENETYX软件（GENETYX Corporation，东京，日本）计算O. meridionalis的SUB1A、SUB1B和SUB1C序列与已知O. sativa SUB1A、SUB1B和SUB1C等位基因之间的序列一致性。使用UPGMA方法构建了代表O. meridionalis及其他AA基因组水稻物种中SUB1A、SUB1B和SUB1C氨基酸关系的系统发育树，并进行了1000次重复的Bootstrap分析以评估节点的统计支持度。

**幼苗的完全淹水处理**
18天大的幼苗被完全淹没在直径55厘米、高90厘米的半透明塑料容器中，容器中装有25–33℃的自来水，持续7天；对照幼苗在同一条件下在有氧环境中生长7天。之后，幼苗在有氧条件下再生长7天以分析其存活率。淹水前后以及转移到有氧条件后的7天分别测量植物长度。

**RNA分离和表达分析**
从淹水0天、1天和3天的幼苗中切取基部茎段（1厘米长），立即置于液氮中冷冻，并储存在-80℃下以备后续使用。根据制造商的说明，使用ISOSPIN Plant RNA试剂盒（NIPPON GENE，东京，日本）从收集的茎组织中提取总RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒（Takara Bio）以1 μg总RNA、oligo(dT)和随机六聚体引物合成第一链cDNA。

**定量RT-PCR**
使用KOD SYBR qPCR Mix（TOYOBO，大阪，日本）和MyGo Pro Real-Time PCR（Funakoshi，东京，日本）进行定量RT-PCR，分析SUB1A、SUB1C、ERF66和17s rRNA基因的表达，17s rRNA作为内参进行标准化，每个基因包含三个生物学重复。用于表达分析的引物列于表S2中。

**结果**
**SUB1基因的种质调查**
通过针对相应O. sativa基因设计的引物组，使用基因组PCR在七个O. meridionalis品种中检测了三个ERF基因（SUB1A、SUB1B和SUB1C）的存在（表S2）。SUB1A特异性引子在W1635、W1638、W2105和W2112品种中产生了扩增产物，而SUB1B和SUB1C特异性引子在所有测试品种中都产生了扩增产物（图1a）。这些扩增产物被测序并与O. sativa的SUB1A、SUB1B和SUB1C进行比对。从O. meridionalis基因组DNA中获得的扩增产物的核苷酸序列与O. sativa的相应基因具有最高的序列一致性（图1b）；这些基因分别被命名为OmeSUB1A、OmeSUB1B和OmeSUB1C。

**图1**
该图像的替代文本可能是通过AI生成的。

**O. meridionalis中SUB1A、SUB1B和SUB1C基因的DNA分析**
a. 使用OsSUB1A-、OsSUB1B-和OsSUB1C特异性引物对七个O. meridionalis品种的基因组DNA进行PCR分析。
b. (a)中扩增产物（推测的SUB1A、SUB1B和SUB1C）的核苷酸序列与O. sativa的SUB1A、SUB1B和SUB1C等位基因的核苷酸序列的一致性。
OmeSUB1A的核苷酸序列在W1635、W1638、W2105和W2112品种中100%相同（图S1），这些品种相对于OsSUB1A序列存在多个SNP和InDels（图S2）。OmeSUB1A的预测起始密码子位于OsSUB1A的下游30个碱基对处（图2）。此外，OmeSUB1C C末端区域的5个碱基对缺失导致相对于OsSUB1A的移码，产生了一个提前终止的密码子（图2）。尽管OsSUB1A包含一个由两个外显子组成的开放阅读框（ORF），但预测OmeSUB1A包含的ORF仅由一个外显子组成（图2）。由于遗传结构的差异，不含内含子的OmeSUB1A的基因组序列长度大约是含有817 bp内含子的OsSUB1A的一半。因此，我们将OmeSUB1A的ORF序列（828 bp）与OsSUB1A的两种等位基因形式OsSUB1A-1和OsSUB1A-2（均为846 bp）进行了比较；结果显示OmeSUB1A与OsSUB1A-1之间的同源性为78.6%，与OsSUB1A-2之间的同源性为78.8%（图1b和S1）。OsSUB1A中第556位的关键核苷酸是区分耐淹等位基因SUB1A-1和不耐淹等位基因SUB1A-2的特征，该核苷酸在OmeSUB1A中对应于第604位，是第202个氨基酸残基。OmeSUB1A的这一核苷酸是胞嘧啶，与OsSUB1A-2相同（图S1-S3）。相应地，OmeSUB1A蛋白与OsSUB1A-2的氨基酸同源性更高（74.1%），而与OsSUB1A-1的同源性为73.8%（表S3）。通过cNLS Mapper分析，预测OmeSUB1A蛋白以及OsSUB1A蛋白都含有核定位信号（Kosugi等人，2009年）。

图2：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

图2显示了O. meridionalis的SUB1A基因与耐淹品种FR13A的SUB1A基因之间的结构比较。OmeSUB1A的起始密码子位于OsSUB1A的起始密码子下游30 bp处。与OsSUB1A不同，OmeSUB1A在C末端区域有一个5 bp的缺失，导致移码和提前出现的终止密码子。因此，尽管OsSUB1A包含一个由两个外显子组成的ORF，但预测OmeSUB1A包含的ORF仅由一个外显子组成。

此外，在七个O. meridionalis样本中发现了六个OmeSUB1C等位基因；它们的ORF与已知的七个OsSUB1C等位基因的同源性为85.0%–90.2%（图1b）。另外，还发现了五个OmeSUB1B等位基因，它们与九个OsSUB1B等位基因的同源性为93.2%–94.6%（图1b）。

**对完全淹没的响应**：
将十七天大的O. meridionalis样本的幼苗完全淹没7天后，在有氧条件下继续生长7天（图3）。在淹没期间，SUB1A阴性样本的茎秆显著伸长，而SUB1A阳性样本（除了W2105外）没有显著伸长。随后，在有氧条件下，SUB1A阳性样本的倒伏情况比SUB1A阴性样本少；SUB1A阳性样本的存活率超过70%，而SUB1A阴性样本的存活率低于45%（图3）。这种对淹没的不同响应与具有SUB1A和HA II的O. sativa品种FR13A的响应相似。

图3：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

图3显示了O. meridionalis幼苗对淹没的响应。十七天大的幼苗被完全淹没7天后，在有氧条件下继续生长7天。对照组幼苗在同一时期在有氧条件下生长。在淹没前后测量了植株长度，并在实验结束时估计了存活率。样本中是否存在SUB1A基因分别用“+”或“-”表示。每个值代表八个幼苗的平均值±标准误差（SE）。不同的字母表示显著差异（p < 0.05，Tukey检验）。

在淹没的幼苗基部区域，检测了SUB1A、SUB1C、ERF66和ERF67的相对表达水平。淹没显著增加了SUB1A阳性O. meridionalis样本中SUB1A的表达（图4a）。W1635、W1638和W2112中的SUB1A转录水平与FR13A中的水平相当，而W2105中的水平显著较低（约为这些样本的一半）（图4a）。在这四个样本中，除了W2112在第3天检测到显著增加外，整个实验过程中SUB1C的表达没有显著诱导（图4b）。然而，在缺乏SUB1A的三个样本（W1625、W1627和W1629）中，淹没后SUB1C的表达显著增加（图4b）。在FR13A中SUB1C的表达几乎没有诱导，但在HA II中显著上调。此外，淹没显著诱导了ERF66和ERF67的表达，这两种基因是O. sativa中SUB1A的下游基因，在SUB1A阳性样本和FR13A中均如此（图4c、d）。

图4：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

图4显示了O. meridionalis样本中SUB1A、SUB1C、ERF66和ERF67基因的表达分析。通过实时定量RT-PCR使用基因特异性引物组分析了淹没0天、1天和3天后的植物基部部分的相对表达。每个值代表三个生物重复实验的平均值±标准误差。星号表示显著差异（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；ns，不显著；Dunnett检验相对于初始水平）。

**讨论**：
在O. meridionalis中，我们发现了OmeSUB1A、OmeSUB1B和OmeSUB1C，这些基因基于序列相似性被认为与O. sativa中SUB1位点上的SUB1A、SUB1B和SUB1C是同源的，尽管它们之间的串联关系目前尚不清楚。Dos Santos等人（2017年）报道的“SUB1B样基因”的ERF结构域与本研究中鉴定的OmeSUB1B的ERF结构域具有100%的氨基酸同源性；因此，这两个基因被认为是相同的（图S4；表S4）。然而，OmeSUB1A和OmeSUB1C的ERF结构域与其他三个“SUB1样基因”的ERF结构域的同源性低于75%，而与OsSUB1A和OsSUB1C的同源性超过98%（图S5；表S4）。因此，本研究中鉴定的OmeSUB1A和OmeSUB1C与Dos Santos等人（2017年）报道的基因不同。

在O. meridionalis幼苗中，发现淹没诱导的茎秆伸长与实验后的最终存活率之间存在显著的负相关（图5a）。O. meridionalis样本可以分为两组：具有OmeSUB1A的组表现出较低的茎秆伸长和较高的存活率，而缺乏OmeSUB1A的组表现出较高的茎秆伸长和较低的存活率。此外，在OmeSUB1A阳性样本中，淹没诱导的OmeSUB1A的表达水平与幼苗存活率之间存在显著的正相关（图4a）；OmeSUB1A表达水平较高的样本（W1635、W1638和W2112）表现出较低的茎秆伸长，而OmeSUB1A表达水平最低的样本W2105表现出较高的茎秆伸长（图3和4a）。这些发现表明，SUB1A阳性的O. meridionalis样本以及耐淹品种FR13A表现出一种“休眠策略”，这取决于SUB1A的表达水平。这一观点进一步得到了OmeSUB1A蛋白的ERF结构域与OsSUB1A的ERF结构域高同源性（98.3%）的支持（Nakano等人，2006年），该结构域负责DNA结合。总体而言，预测OmeSUB1A在诱导植物耐淹性方面的功能与OsSUB1A类似。

图5：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

图5显示了茎秆伸长与存活率、SUB1A表达与存活率、SUB1C表达与茎秆伸长、SUB1A表达与ERF66或ERF67表达、ERF66表达与存活率以及ERF67表达与存活率之间的相关性。图(a)、(b)、(c)、(e)和(f)中的存活率和茎秆伸长是根据图3中提供的植物生长数据绘制的。图(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中SUB1A、SUB1C、ERF66和ERF67的相对表达水平是根据图4中第1天的数据绘制的。相关性回归系数（r）是仅使用O. meridionalis样本的数据确定的（* p < 0.05，** p < 0.01）。

然而，OmeSUB1A中的第176个氨基酸是脯氨酸，与OsSUB1A-2中的丝氨酸不同（图S3）。尽管早期有报告称携带OsSUB1A-2的水稻品种由于该基因表达较低而几乎不表现出耐淹性（Xu等人，2006年），但在一些高表达OsSUB1A-2的品种中检测到了耐淹性（Singh等人，2010年），这被认为与OsSUB1A-1品种的调控途径不同（Sharma等人，2018年）。淹没条件下OmeSUB1A的显著上调可能与O. meridionalis的耐淹性有关，这是通过类似于高表达OsSUB1A-2的品种的调控途径激活的。

系统发育分析显示，OmeSUB1A是AA基因组水稻物种中SUB1A基因组成的单系群的基础成员（图6）。因此，OmeSUB1A可能是AA基因组水稻物种中较早分化的SUB1A谱系；然而，它与其他SUB1A基因的关系比与SUB1B或SUB1C的关系更密切。同样，OmeSUB1B和OmeSUB1C分别是AA基因组物种中SUB1B和SUB1C基因组成的单系群的基础成员。这些O. meridionalis SUB1基因的基础分支可能反映了Zhu等人（2005年）提出的该物种的进化历史，表明O. meridionalis代表了AA基因组水稻群中最早分化的谱系，并形成了一个单系群。

图6：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

图6显示了Oryza物种中SUB1A、SUB1B和SUB1C氨基酸序列的系统发育分析。使用UPGMA方法基于O. meridionalis（Ome）、O. sativa（Os）、O. rufipogon（Oru）、O. nivara（On）、O. glaberrima（Ogla）和O. longistaminata（Olo）的氨基酸序列构建了系统发育树。每个节点都显示了1000次重复实验的自助法（bootstrap）值。

在OmeSUB1A阳性样本中，淹没显著诱导了ERF66和ERF67的表达（图4c和d），这些基因在O. sativa中的同源物已被报道为SUB1A的直接转录靶标（Lin等人，2019年）。在O. meridionalis中，ERF66和ERF67的表达与SUB1A的表达以及幼苗的存活率之间存在显著的正相关（图5d和f）。因此，ERF66和ERF67也参与了O. meridionalis阳性样本的耐淹性，这与O. sativa中的耐淹性相似。相比之下，在O. meridionalis中发现了OmeSUB1C的表达与茎秆伸长之间的显著正相关（图5c）。类似地，在O. sativa中，认为SUB1C的表达通过促进碳水化合物代谢来支持植物在淹没条件下的伸长（Fukao等人，2006年）。携带OmeSUB1A的O. meridionalis样本在淹没期间表现出OmeSUB1C的表达受到抑制（图4b和5c）；因此，这些样本的耐淹性可能与碳水化合物代谢的抑制有关，类似于在O. sativa中观察到的情况。

本研究分析的七个O. meridionalis样本包括四个来自澳大利亚北部沿海地区的样本（W1625、W1627、W1629和W1635），该地区受澳大利亚季风影响较大，以及三个来自昆士兰内陆地区的样本（半干旱地区，受季风影响较小）（图S7；Northern Australia Climate Program 2020a、b）。来自湿润地区的样本W1635携带OmeSUB1A并表现出耐淹性（图3），而所有来自半干旱地区的样本都携带OmeSUB1A并在淹没后表现出较高的存活率。因此，O. meridionalis中SUB1A介导的耐淹性似乎难以与澳大利亚季风气候下的季节性洪水适应联系起来。然而，古气候和古生态学研究表明，季风的影响曾经向南延伸到中全新世（Lowry和McGowan，2024年），并且雨林和湿地植被曾经在现在被归类为半干旱至干旱的内陆地区普遍存在（Martin，2006年）。因此，当前研究中检查的内陆样本可能是在这些历史环境条件下获得耐淹性的适应性特征，这一特征一直延续至今。先前有报告指出一些O. meridionalis样本具有耐旱性（Pham等人，2006年）。在O. sativa中，SUB1A已被证明通过上调活性氧（ROS）清除酶来增强耐旱性（Fukao等人，2011年）。尽管尚未在O. meridionalis中研究OmeSUB1A在这种ROS调节中的作用，但类似的机制可能也有助于O. meridionalis的耐旱性。这可能解释了在半干旱内陆地区自然生长的O. meridionalis中OmeSUB1A的保守性。

在当前研究中，我们在几个澳大利亚野生水稻O. meridionalis样本中鉴定了SUB1A基因。携带OmeSUB1A的样本的幼苗表现出耐淹性，但没有淹没诱导的茎秆伸长，这可能导致了更高的存活率。在淹水条件下，OmeSUB1A及其下游转录因子ERF66和ERF67的表达显著增强；这些基因的上调可能有助于提高O. meridionalis幼苗的存活率。此外，OmeSUB1A阳性品系幼苗在淹水条件下株高生长受到抑制，这可能与OmeSUB1C的未诱导有关，而OmeSUB1C的抑制可能与碳水化合物代谢的减缓有关。总体而言，O. meridionalis所表现出的耐淹性可能与OmeSUB1A相关，其机制类似于O. sativa中OsSUB1A阳性耐淹品种的机制。进一步研究淹水耐受性（例如在长时间淹水条件下）或干旱耐受性，将有助于了解OmeSUB1A所提供的耐受性水平是否与OsSUB1A相当或具有差异，以及其在育种应用中的潜在价值。