根据母本鱼类的野生或养殖来源，评估用于追踪鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）幼虫起源的化学分析方法

《Aquaculture International》：Evaluation of chemical-analytical methods to trace the origin of salmon lice (Lepeophtheirus salmonis) larvae according to the wild or farmed origin of maternal host fish

　　摘要
鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）对野生大西洋鲑鱼（Salmo salar）种群构成了威胁，而开放式海养鲑鱼养殖加剧了其数量增加和感染率上升的趋势。虽然已经开发出模型来预测鲑鱼虱从宿主鱼身上的扩散情况，但缺乏能够验证鲑鱼虱幼虫来源的方法，而这对于进一步了解其传播机制至关重要。由于鱼体上的虱子幼虫或水样中的虱子幼虫可能来自不同的母体，因此分析单个幼虫是必要的。这项探索性研究评估了几种化学分析方法，以确定它们追踪单个鲑鱼虱若虫来源的潜力，具体来说是追踪这些虱子的母体是否附着在野生鲑鱼或养殖鲑鱼上。鲑鱼虱幼虫的脂质特征和结合同位素（δ15N和δ13C）谱型可以反映宿主鱼的来源，但由于样本量非常有限，对单个幼虫进行可靠分析颇具挑战性。在单个幼虫中检测到了多种微量元素（如砷和铷）以及主要元素（如磷、钾和镁）。当虱子的母体附着在野生鲑鱼或养殖鲑鱼上时，砷/钾、铷/砷和砷/磷的元素比率存在差异，这一现象与成年虱子和宿主鱼中的观察结果一致。由于这些方法具有高灵敏度，并且可能与饮食有关，因此元素谱型成为确定单个虱子幼虫野生或养殖来源的有前景的方法。然而，需要更广泛的采样和验证来确认这些特征是否足够独特和可靠。

引言
鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）是一种自然寄生在鲑科鱼类身上的寄生虫，其从养殖鲑鱼传播到野生鲑鱼种群被视为对挪威野生鲑鱼种群的主要威胁（Shephard和Gargan 2017；Stige等人2024；Thorstad和Finstad 2018；Vollset等人2017）。尽管每条养殖鱼身上的虱子数量较少，但由于宿主数量众多，感染压力异常高（Dempster等人2021；Vollset等人2017）。研究表明，养殖鲑鱼是鲑鱼虱传播的主要来源（Dempster等人2021），并且已经进行了大量研究来了解和模拟海虱幼虫的传输过程，并预测其对野生鲑鱼的影响（Asplin等人2020；Moriarty等人2024；van Nes等人2023；Vollset等人2017）。鲑鱼虱的生命周期使其能够在海洋环境中有效传播。它们的卵在雌性体内受精后，形成两条卵链悬挂在她的身体上。一只雌性可以产下多达11对卵链，每对卵链中含有大约300-800个卵（Boxaspen 2006；Pike和Wadsworth 1999）。幼虫是浮游生物，在发育成能附着在宿主身上的若虫阶段之前会经历两个无节幼体阶段。在浮游阶段，虱子不会进食（Bron 1993；Gravil 1996；Tucker等人2000），而附着在宿主身上的若虫则以宿主的黏液和皮肤为食（Bron等人1993）。附着后，虱子会经历多次蜕皮，依次发育为chalimus I-II、pre-adult I-II阶段，最终成为成虫（Hamre等人2013）。chalimus阶段通过前部丝状物固定在宿主身上，不具备移动能力。pre-adult和成虫阶段的虱子可以在鱼体上自由移动，以宿主的皮肤、黏液和血液为食，导致鲑鱼出现严重的健康问题，包括生长减缓、疾病抵抗力下降和死亡率增加（Finstad和Bj?rn 2011）。这些寄生虫生命周期阶段在鱼体间的移动能力有限。自由游动的幼虫阶段是在海洋环境中传播的主要形式。已有许多研究探讨了鲑鱼虱幼虫的繁殖、死亡率和感染性（Brooker等人2018；Karlsen等人2024；Samsing等人2016；Skern-Mauritzen等人2020；Stige等人2021）。它们主要的水平传播方式是通过洋流，洋流可以将它们带到相当远的距离（Krko?ek等人2005），同时也会受到光照、温度和盐度等环境因素的影响（Crosbie等人2020, 2019；Heuch等人2005；Novales Flamarique等人2000）。为了减少鲑鱼虱从养殖场传播到野生鲑鱼种群的负面影响，挪威建立了“交通灯”系统（贸易工业和渔业部2017），该系统根据养殖鲑鱼可能引起的野生鲑鱼幼鱼死亡率来调节不同生产区域的鲑鱼生产量。评估基于养殖鲑鱼传播导致的野生鲑鱼幼鱼预期死亡率的数据，结合水动力和统计模型来预测虱子的扩散情况（挪威研究委员会2021）。用于估计虱子扩散的模型（Aldrin等人2023, 2013；Asplin等人2020；Lien等人2022）在一定程度上得到了野生鲑鱼幼鱼和在哨兵笼中部署的幼鱼上虱子数量的监测数据的验证，但在传播动态和模型参数方面仍存在知识空白（Serra-Llinares等人2024；van Nes等人2023；Vollset等人2023, 2018）。尽管估计98%携带卵链的成年雌性鲑鱼虱来自养殖鱼（Dempster等人2021），但可能存在地区差异，在没有水产养殖设施但存在野生鲑鱼种群的峡湾中，这些鱼可能是虱子的主要来源。确定鲑鱼虱幼虫来源的可靠方法将有助于更好地理解其传播机制。

鉴于鱼体上的虱子幼虫（或同一地点的水样中的虱子幼虫）可能来自不同的母体，因此分析单个幼虫是必要的。然而，每个幼虫的重量仅为2至6微克干重，这对用于追踪野生和养殖来源的分析方法来说是一个挑战。众所周知，饮食和水生环境都会影响鱼类和其他海洋生物的化学组成。因此，通过绘制鲑鱼虱幼虫的独特生化特征谱型——这些特征源于野生鲑鱼和养殖鲑鱼化学组成的差异——是追踪其来源的一种非常相关的方法。

养殖大西洋鲑鱼的饮食中陆地成分的比例高于野生鲑鱼（Aas等人2022b）。自水产养殖早期以来，鲑鱼饲料的成分发生了显著变化。1990年，挪威养殖鲑鱼的饲料中海洋成分约占90%；到2013年，鱼油和鱼粉的比例分别下降到11%和18%；到2020年，这些比例进一步降至10%和12%（Aas等人2022b）。随着水产养殖的扩展和海洋成分的稀缺，预计未来几十年植物基饲料仍将是主要成分。饮食来源的差异导致野生鲑鱼和养殖鲑鱼组织中的各种化学成分存在差异（Anderson等人2010；Jensen等人2020；Thomas等人2008）。在各种化学特征中，脂肪酸谱型是最具区分度和应用最广泛的指标，因为它主要受饮食影响（Martinez等人2009；Thomas等人2008；Torstensen等人2000；Aas等人2022a）。先前的研究表明，肌肉、鳞片和其他器官中的脂肪酸谱型可以区分养殖鲑鱼和野生鲑鱼（Axelson等人2009；Grahl-Nielsen和Glover 2010；Martinez等人2009；Olsen等人2013；Skilbrei等人2015；Standal等人2009；Strand等人2023）。同样，成年鲑鱼虱的脂肪酸组成也受其宿主鱼的脂肪酸组成影响（Tocher等人2010），从而导致来自野生鲑鱼和养殖鲑鱼的虱子之间存在差异（Tocher等人2010）。此外，稳定同位素特征（如N15/N14（δ15N）和C13/C12（δ13C）也受饮食影响，研究表明δ15N和δ13C在野生鲑鱼和养殖鲑鱼之间存在差异（Anderson等人2010；Taccardi等人2020；Thomas等人2008）。然而，这些特征从饮食传递到鱼体的机制比脂肪酸组成更为复杂，例如Whiteman等人（2019）总结的批量同位素比率所示。据报道，鲑鱼虱的δ13C反映了宿主鱼的特性（Butterworth等人2004；Dean等人2011），而δ15N则有所富集（Taccardi等人2020）。δ15N（Butterworth等人2004）和δ13C（Dean等人2011）已被提出作为根据宿主鱼的野生或养殖来源来追踪鲑鱼虱的参数。此外，鲑鱼虱的元素组成差异也可能作为潜在的标记物，因为已经证明野生鲑鱼和养殖鲑鱼的元素谱型存在差异（Anderson等人2010），以及来自这些来源的成年虱子的元素谱型也存在差异（Shinn等人2000）。然而，元素谱型也可能受到环境因素的影响，如水化学成分（Flem等人2017；Shinn等人2000）。

通过不同的化学谱型根据其母体宿主来追踪鲑鱼虱幼虫似乎是一种有前景的方法，以区分虱子幼虫的来源。然而，需要评估各种分析方法的稳健性和灵敏度。本研究旨在（1）评估脂质谱型、同位素特征和元素组成作为判断鲑鱼虱若虫是否来自野生鲑鱼或养殖鲑鱼的潜在指标；（2）评估这些方法分析单个鲑鱼虱若虫的潜力。

材料与方法
本研究包括2012年和2023年进行的两次独立研究的数据，第二次研究建立在第一次研究的基础上。在每次研究期间，评估了被认为具有足够灵敏度和区分野生和养殖来源潜力的方法。在2023年研究之前，元素分析和脂质组学的分析方法得到了改进，因此优先选择了这些灵敏度较高的方法，而GC-FID和同位素分析自2012年以来没有重大技术进步。在研究过程中，样本被送往适合分析单个虱子幼体的分析技术。

参考样本包括从商业渔场（养殖鲑鱼）和中挪威野生鲑鱼监测站的袋网中收集的大西洋鲑鱼（Salmo salar）和带有卵链的鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）（表1）。表1 挪威特伦德尔格地区（Tr?ndelag）第6和第7生产区采集的样本概览（渔业局2017年数据）以及2012年和2023年测试的分析方法
**完整表格**

每次采样时，从3条养殖鲑鱼和1至3条野生鲑鱼中收集鱼组织（和黏液）样本。2023年的采样中，由于袋网捕获的鱼类数量较少，野生鱼的数量受到限制。野生鱼的肌肉样本仅来自在网中发现的死亡鱼类或因受伤而被安乐死的鱼类。对于养殖鱼类，肌肉和黏液样本来自同一网箱中的鱼类，但不一定来自与虱子样本相同的个体。

与养殖鲑鱼相比，野生鲑鱼携带的成年雌性虱子数量更多，因为法规限制了养殖鲑鱼身上的虱子数量（每条鱼0.2–0.5只）。因此，从养殖鱼类身上采集虱子样本需要选择多条鱼，以获得足够的卵链用于孵化分析。

**鱼组织样本和成年雌性鲑鱼虱子的采集方法**
使用无菌设备从鱼背鳍后方和下方采集2×2厘米的肌肉样本。2023年的采样还包括以类似方式采集的2×2厘米皮肤样本，以及通过刮取尽可能多的黏液并将其转移到1.5毫升Eppendorf试管中的黏液样本。所有鱼样本（肌肉、皮肤、黏液）每个样本重复采集两次。鱼样本在运输到实验室前被放置在便携式冷冻柜（-20°C）或冰箱（4°C）中保存2–4小时，之后转移到-80°C的冷冻柜中待进一步分析。

**虱子的采集与处理**
使用镊子将带有卵链的成年虱子从鲑鱼身上分离出来，并放入含有海水的1升塑料瓶中（2012年采样）或含有过滤海水的培养管中（2023年采样），然后运输到实验室。到达实验室后，将卵链从母虱身上分离出来并孵化。部分成年雌性虱子和额外的卵链也被冷冻（-80°C）后进行冷冻干燥，并按照化学分析部分（脂肪酸和元素分析）的方法进行处理。为了去除海水，所有虱子样本在冷冻（-80°C）前都用纯净水或蒸馏水冲洗。

**卵链的孵化与桡足类的采集**
卵链主要成对采集。2012年从每个来源采集的卵链在60升含有充气海水的塑料容器中孵化（10°C）。每个容器中汇集了25–40只虱子的卵链（批量孵化）。大约两周后，使用筛子（Cell Strainer，100 μm，BD Falcon）收集桡足类。在用Cole Parmer Aquatron Water Still – A4000D蒸馏水短暂冲洗（3秒）后，将桡足类转移到塑料杯中，并尽快用移液管分装到1、5、10和100只个体的Eppendorf试管中，以防止破裂。每次采样的试管数量在123到170个之间。

2023年从单个虱子身上采集的卵链（每个采样点5–9只）在B?tnes等人（2024年）描述的流动式培养箱中单独孵化。选择这种方法是为了确保桡足类的来源可追溯到母虱和宿主鱼。每天监测培养管中的桡足类数量，以确定孵化日期。根据孵化日期、水温和发育时间（Hamre等人2019年），在桡足类发育到该阶段后的2天内进行采集。桡足类被分组（1、5、20和50或100只），放入称重杯中，然后转移到1.5毫升的Eppendorf试管中（分别为10、5、5和3个试管）。每个桡足类系列包含23个试管。去除多余的海水后，用超纯水（1–1.5毫升）冲洗样本1–2次，然后冷冻（-80°C）待进一步分析。

**数据分析流程**
2023年的采样程序在采样过程中得到了进一步优化。在2023年的最后一次采样中（FJ；表1），根据后续分析需求将桡足类分别放入不同的试管中（GC分析用玻璃管，元素分析用酸洗过的Eppendorf管，脂质组学用Bertin管）。这种方法减少了操作步骤并降低了污染风险，尤其是对于元素分析。

**化学分析**
**脂肪酸分析（气相色谱法，GC）**
2012年和2023年的样本均进行了GC分析。冷冻干燥后的成年雌性虱子、卵链和鲑鱼虱子桡足类样本（或如上所述直接放入GC玻璃管中以减少处理/转移步骤）首先经过Abdulkadir和Tsuchiya（2008年）提出的改良方法处理，随后进行气相色谱（GC）分析。对于含有50或100只桡足类的样本，所有溶液体积都加倍。上层异辛烷相被转移到另一个试管中并蒸发至残留物适合放入GC小瓶内。该程序也在两个空Eppendorf试管上作为对照进行。甲基化的脂肪酸使用Agilent Technologies 7890A气相色谱仪和火焰离子化检测器（GC-FID）以及7693自动进样器（Agilent Technologies，美国加州帕洛阿尔托）进行分析，具体方法参照Kristinova等人（2014年）的描述。检测器温度设定为250°C，使用氢气作为载气，保留时间从2、6、4分钟改为8、10和13分钟。通过将脂肪酸的保留时间与商业标准品进行比较来鉴定脂肪酸，并使用内标进行定量。结果以总脂肪酸的重量百分比表示。2023年采样的含有5–50只桡足类的混合样本也进行了主成分分析（见下文）。

**脂质提取与脂质组学**
2023年采集的桡足类样本进行了脂质组学分析。脂质提取和后续分析按照Malzahn等人（2022年）的方法进行。所有含有1至50只桡足类的样本首先使用Folch脂质提取法（Folch等人1957年）在Bertin管中处理，然后在Agilent 1260 UPLC与4670三重四极杆质谱仪上结合多重反应监测模式（MRM）进行靶向脂质组学分析。这产生了一份潜在脂质列表，这些脂质随后作为变量用于R语言中的多变量分析（使用mixOmics库）。分析过程中采用了两种均质化方法：使用Precellys24（tm）均质器和活塞式均质器。最终选择了使用Precellys的均质化方法。

**同位素分析**
2012年采集的鱼肌肉和桡足类样本的同位素比值（δ15N和δ13C）分析使用Thermo Finnigan DELTAPLUSXP同位素比质量谱仪（IRMS）进行。含有100只桡足类的样本在转移至锡胶囊前在原始Eppendorf管中冷冻干燥；而含有10只或5只桡足类以及单个桡足类的样本则用Cole Parmer Aquatron A4000D蒸馏水从Eppendorf管转移到锡胶囊中再冷冻干燥。通过放大镜计数移液管中的桡足类数量来确认数量准确性。宿主鱼的肌肉样本在冷冻干燥前用超纯水均质化。约2毫克干燥肌肉样本被转移到锡胶囊中，然后测定干重、包装并通过IRMS测量。因此，单个和批量（5、10和100只）的桡足类以及宿主鱼的肌肉样本均使用IRMS进行分析。仅对鱼样本进行了重量测定。分析的认证参考材料（CRM）显示出良好的准确性（IAEA-CH-6：δ13C为-10.33，与CRM值-10.45相比；IAEA-N-1：δ15N为0.29±0.36，与CRM值0.43相比；IAEA-N-2：δ15N为19.94±0.37，与CRM值20.4相比）。

**元素分析**
2023年采集的鱼和虱子样本进行了元素分析。冷冻干燥后的桡足类在采样时使用的相同Eppendorf管中消化（最后一批使用酸洗过的Eppendorf管）。消化过程中，向每个Eppendorf管中加入30微升超纯HNO3，在80°C的加热室中封闭盖子加热3小时。消化后，每个样本稀释至300微升，再向每个Eppendorf管中加入270微升0.05% HNO3和1.11微克/升的内标。单个桡足类或最多50只桡足类的样本也采用相同方法处理。然而，含有100只桡足类、母虱或宿主鱼黏液的样本则向Eppendorf管中加入100微升超纯HNO3并稀释至1000微升，再加入900微升0.05% HNO3和1.11微克/升的内标。宿主鱼的皮肤和肌肉样本使用ultraWAVE（Milestone）消化，加入约1克冷冻鱼组织并加入5毫升超纯HNO3。消化后的样本转移到酸洗过的50毫升Sarstedt试管中并稀释至50毫升（I型水）。所有桡足类样本都放入-80°C的冷冻柜中待进一步分析。2023年的采样程序在采样过程中进一步优化。在2023年的最后一次采样中（FJ；表1），根据后续分析需求将桡足类分别放入不同类型的试管中（GC分析用玻璃管，元素分析用酸洗过的Eppendorf管，脂质组学用Bertin管）。这种方法减少了操作步骤并降低了污染风险，特别是对于元素分析。

**数据处理的统计分析**
统计分析和数据处理使用Microsoft Excel和Minitab v20（Minitab Inc., PA, USA）进行。使用Tukey方法对脂肪酸组成、同位素比值和元素比值进行单因素方差分析（ANOVA）（Minitab v20）。统计显著性水平设定为p<0.05。脂肪酸结果以平均值和标准差表示，并在图表中用平均值和单个值展示。元素分析结果以箱形图显示，箱形图表示中间50%数据的范围（Q3–Q1），箱内的线表示中位数。箱的边界表示第25和第75百分位数，箱须表示数据的分布范围（排除异常值）。

**主成分分析（PCA）**
使用Wold等人（1987年）的方法进行主成分分析（PCA），基于脂肪酸组成（使用Minitab v20中的相关矩阵/自动缩放值）和脂质组学数据（使用R语言中的mixOmics库（Rohart等人2017年）进行可视化差异和分组。部分最小二乘-判别分析（PLS-DA）（Barker和Rayens 2003）用于R语言中的脂质组学数据，以识别野生和养殖来源之间的差异和模式。

**结果**
**鲑鱼虱子、卵链和桡足类的脂肪酸组成**
2012年采样的成年雌性虱子及其相应卵链的脂肪酸组成进行了分析，来源分别为“WA”（n=4）和“FB”（n=2）。结果见补充表S1。成年虱子的主要脂肪酸为C22:6n-3、C18:1n-9、C16:0和C20:5n-3。母虱的脂肪酸组成在卵链中也有体现，但存在一些差异。主要区别在于卵链中的C22:6n-3含量较低，而C18:1n-9含量较高。成年虱子的平均C22:6n-3含量分别为27±3%（野生来源）和22±1%（养殖来源），而相应卵链的含量分别为18±3%和15±2%（个体间减少了24–49%）。成年虱子中C18:1n-9的含量为22±2%（野生来源）和23±1%（养殖来源），而在卵链样本中，这一含量分别为27±3%（野生来源）和30±2%（养殖来源）。C20:1n11的含量在卵链中也普遍高于成年虱子，但其占总脂肪酸的比例相对较低（1.6–3.3%）。对于植物来源特有的脂肪酸，如C18:2n-6、C18:3n-3、C20:2n-6和C20:3n-6，卵链中的含量往往较高或与成年虱子相当。

养殖来源的卵链与野生来源的卵链在脂肪酸组成上存在差异：养殖来源的卵链中C18:1n-9、C18:2n-6、C18:3n-3、C20:2n-6、C20:3n-6、C22:6n-9的含量显著更高，而C16:0、C16:1n-7、C20:5n-3和C22:6n-3的含量则较低（表S2）。在分析2012年和2023年采集的共集Copepodites样本时，也观察到了类似的野生与养殖来源之间的差异（表S3和S4）。特别是C18:2n-6、C18:3n-3、C20:2n-6和C20:3n-6这四种脂肪酸，在2012年和2023年采集的卵链及共集Copepodites样本中均表现出养殖来源的特征。仅C18:2n-6和C18:3n-6在分别评估两组样本时显示出明显的野生与养殖来源差异（表S4，2023年样本）。在2023年的样本中，所有养殖来源的Copepodites中C18:2n-6的含量均超过3.5%，略高于2012年相应样本的值（<3%）。基于2012年的数据，C18:1脂肪酸（其中C18:1n-9占主导）是共集Copepodites样本中最丰富的脂肪酸。

图1：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。全尺寸图像。

图2：2012年（B）或2023年（C）从养殖（蓝色）和野生（红色）鲑鱼中收集的卵链（A）及共集Copepodite样本中的选定脂肪酸。数据以总脂肪酸的重量百分比形式呈现，包括平均值（条形图）和单个值（圆圈）。对于卵链，n=3–10；对于Copepodites，n=3–9个混合样本。

图2A：基于宿主鱼类（母虱）的野生或养殖来源，使用脂肪酸组成进行的主成分分析（PCA）在得分图中显示出明显的分离（图2A）。共集Copepodites在PCA得分图中的位置由上述典型植物脂肪酸的含量决定，如载荷图（图2B）所示。

图2：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。全尺寸图像。

图3：2023年收集的Copepodites中脂肪酸数据的PCA得分（A）和载荷（B）图。每个点代表来自不同养殖（蓝色）和野生（红色）来源的共集Copepodites样本。

图4：2012年和2023年的GC-FID分析结果显示，单个（n=1）Copepodites的色谱图质量不足以量化脂肪酸。5个或20个Copepodites的混合样本产生了定义明确的色谱图，但重复样本中峰强度的可重复性较低且变化较大。因此，2023年的GC分析主要目的是确认2012年发现的野生与养殖来源之间脂肪酸组成的差异是否仍然存在，并检测任何变化。脂肪酸组成还作为解释2023年样本脂质组学分析结果的基准。

图5：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。全尺寸图像。

图6：初步测试表明，单个Copepodite的样本信号不足以进行稳健的分类，因此评估了分析20个Copepodites混合样本的性能。为了进行脂质组学分析，选择了尽可能来自不同虱子和宿主鱼的Copepodite样本。PLS-DA（图3）能够从数据中生成一个模型，其95%置信区间有轻微重叠。PLS-DA模型第一个组分的误差率（使用留一法交叉验证的perf-function mixOmics）分别为养殖来源的29%和野生来源的27%。该组分主要由TAG、SM和某些PC组成。这些假定分配的化合物根据样本在图3A中的x轴位置有助于分离样本。

图7：该图像的替代文本可能是通过AI生成的。全尺寸图像。

图8：PLS-DA得分图（A）和PLS-DA分析中载荷1的解释变量（假定分配的脂质分子）（B）。载荷1为正值的变量与得分图右侧的位置相关（养殖来源），而载荷1为负值的变量与野生来源相关。

图9：从PLS-1的载荷（图3B）可以看出，PLS-1中分子量较高的TAG物种（碳原子数>52）都与负值相关，导致野生样本位于图的左侧。进一步观察发现，PLS-1中负值最高的TAGs（如TAG 55:1、TAG 55:0、TAG 57:4、TAG 59:5、TAG 55:3）具有奇数个碳原子。假定分配的SM 43:0、SM38:2、SM44:7、SM43:1和SM44:8在PLS-1中的载荷较高，表明它们有助于将养殖来源的样本定位在图的右侧。

图10：2012年收集的鲑鱼肌肉的δ15N（15N/14N）平均值在野生鲑鱼中为11.64±1.29‰，而在养殖鲑鱼中显著较低（p=0.035）。δ13C（13C/12C）在野生和养殖鲑鱼中的平均值分别为-19.95±0.71‰和-24.99±1.25‰，养殖鲑鱼中的值也显著较低（p<0.001）。

图11：100个Copepodites（来自WA和FC来源）的混合样本结果显示，来自野生鲑鱼的鲑鱼虱幼虫的δ15N平均值为11.98±0.41‰，而来自养殖鲑鱼的鲑鱼虱幼虫的δ15N显著较低（p<0.001）。δ13C在来自野生和养殖鲑鱼的Copepodites中的平均值分别为-21.07±0.90‰和-23.98±0.82‰（p<0.001）。结合这两种同位素比值，可以清晰区分野生和养殖来源（图4）。

图12：分析单个Copepodite的结果显示无法确定样本中的氮浓度，因此也无法确定δ15N。然而，可以确定单个Copepodite样本中的碳含量，进而确定δ13C。分析来自四个不同来源的多个Copepodite样本的结果显示，来自“野生”来源的Copepodites的δ13C平均值约为-23.22±1.5‰，与来自“养殖”来源的Copepodites显著不同（δ13C=-24.26±0.93‰，图5A）。单个Copepodite、100个Copepodites的混合样本或养殖宿主鱼的肌肉组织中的δ13C没有显著差异，但野生来源的单个Copepodite的平均δ13C显著低于野生宿主鱼的混合样本或肌肉组织（图5B）。

图13：2012年从两个养殖（蓝色，FC）和野生（红色，WA）宿主鲑鱼中收集的Copepodite样本中的δ13C箱线图，n=4–10。B：比较来自养殖（蓝色）和野生（红色）宿主鲑鱼的1个Copepodite、100个Copepodite和鱼组织样本中的δ13C范围。

图14：ApexQ-ICP-MS在300 μL的单个Copepodite消化样本中检测到多种元素（补充表S5），并且消化样本中元素的浓度随着消化Copepodite数量的增加而增加。分析了来自野生和养殖宿主鱼的2个不同成年虱子的不同数量的Copepodites（n=1、5、20、50或100），以评估该方法在减少样本量时的稳健性。结果显示，某些可检测元素（例如As/K和Zn/K）的比例在单个（n=1）Copepodite样本和多个Copepodite（5、20、50或100）的混合样本之间没有变化（图6）。其他元素如Rb/As和As/P（以及Cd/K，结果未显示）的比例从单个Copepodite到5个Copepodite的混合样本有所下降，而在更多Copepodite混合的样本中趋于一致（n=10、50或100）。

图15：分析鱼样本（肌肉和皮肤，补充表S6）的结果显示，养殖和野生宿主鱼中的Copepodites中某些元素的浓度存在显著差异。野生鲑鱼的肌肉和皮肤中的As和Cd水平显著高于养殖鲑鱼（p<0.001和p=0.003），而Rb水平在养殖鲑鱼中显著高于野生鲑鱼（p=0.016）。主要元素如P、K和Mg的浓度在宿主鱼来源上没有显著差异。Mg、K和P的浓度与皮肤组织的样本重量相关（R2=0.27–0.67），但由于每条鱼的消化质量相似（0.95–1.05克），因此无法在肌肉组织中观察到这种相关性。Zn的浓度在所有鱼类中一致较高，但在野生或养殖鲑鱼之间没有显著差异。

图16：A–D和补充表S7展示了不同样本类型中上述元素的比率：单个Copepodite、成年虱子、黏液、皮肤和肌肉。补充表S7还提供了基于野生或养殖来源的ANOVA结果（显著性水平p<0.05）：鱼组织和成年鲑鱼虱子中的As/K比率在野生和养殖来源之间存在显著差异（所有p<0.05）。在单个Copepodite中，野生来源的样本显示出较高的As/K比率，但差异不具统计学意义（p=0.06）。相比之下，Zn/K比率仅在单个Copepodite中在野生和养殖来源之间存在显著差异（p=0.001）。Cd/K比率在任何样本类型中都没有基于来源的显著差异。Rb/As比率在所有样本类型中都存在显著差异（所有p<0.05），而As/P比率在鱼皮肤样本类型中除外（p=0.156）。不同野生和养殖来源的As/P比率显示在补充图S8中。图7的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像为元素比率的箱线图：As/K（A）、Zn/K（B）、Rb/As（C）以及As/P（D），这些数据来自2023年收集的养殖（蓝色）和野生（红色）鲑鱼的个体桡足类、成年海虱以及宿主鱼的肌肉、皮肤和黏液。星号（**）表示通过ANOVA（p<0.05）确定野生和养殖来源之间存在显著差异。

讨论
基于宿主鱼的野生或养殖来源，海虱的化学成分存在差异。

脂肪酸组成分析
脂肪酸组成分析是区分传统养殖鲑鱼和野生鲑鱼的可靠方法（Axelson等人，2009年；Grazina等人，2020年）。对母虱、卵链以及由此产生的桡足类的脂肪酸组成的分析清楚地表明，与野生鲑鱼相比，养殖鲑鱼组织中的植物脂肪酸含量更高，这反映在分析的海虱样本中。结果与先前的研究一致，这些研究表明，在养殖鲑鱼上采集的成年海虱中C18:2n-6和C18:3n-3的含量高于野生鲑鱼（Tocher等人，2010年）。本研究中桡足类中这些脂肪酸的相对含量高于Tocher等人（2010年）的报告，并且从2012年到2023年有所增加。这可以归因于鲑鱼饲料中植物饲料成分的使用增加。

与成年雌性海虱相比，卵链中C22:6n-3的比例降低，而C18:1n-7的比例增加。这与先前的研究结果一致，可以用卵链中三酰甘油（TAGs）和中性脂类的较低水平来解释（Tocher等人，2010年）。

当前数据集中分析的合并桡足类的结果表明，脂肪酸组成可以作为区分样本是否来自野生或养殖鲑鱼宿主的明确标志。

正如预期的那样，在来自不同海虱的桡足类中观察到了脂肪酸组成的某些变化，特别是在从不同鱼类中采集时。采样是在夏季进行的，此时野生鲑鱼会向上游迁徙。然而，由于饮食和身体组成的季节性变化，较大的样本集预计会有更大的变化。相比之下，养殖鲑鱼的脂肪酸组成通常表现出有限的季节性变化（Aas等人，2022a），但其脂肪酸组成将取决于饲料。先前研究在大西洋鲑鱼的脂肪酸组成中报告称，养殖大西洋鲑鱼鱼片中的18:2n-6含量约为12-14%（Jensen等人，2020年；Aas等人，2022a），而野生大西洋鲑鱼鱼片中的含量则低于2%（Jensen等人，2020年；Thomas等人，2008年）。海鳟也是采样计划的一部分，但在采样活动中没有捕获到任何海鳟。来自其他地区的研究表明，褐鳟的脂肪酸组成存在显著的季节性变化（Bay?r等人，2010年），但据作者所知，目前缺乏关于挪威野生海鳟的此类数据。因此，需要进一步的研究来确定脂肪酸谱是否足够具有特征性，以可靠地区分来自养殖鲑鱼与野生海鳟或其他鲑鱼宿主的桡足类。

脂质组学谱型
通过LC–MS/MS进行的脂质组学分析可以提供更详细的脂质谱型，根据脂肪酸中的碳原子数量和双键数量来映射数百种脂质分子（Hansen等人，2022年；Jiao等人，2015年；Malzahn等人，2022年）。尽管样本量有限，但使用LC-QQQ和MRM的脂质组学方法在仅基于第一个PLS-DA成分的情况下展示了区分野生和养殖来源桡足类样本的潜力，误差较低。合并的桡足类样本的脂质组学谱型在野生和养殖来源之间存在差异，这是由于脂肪酸组成的明显差异。基于假定分配的脂质分子的解释表明，“养殖”来源的桡足类与几种鞘磷脂（SM）相关，而含有大量碳原子和奇数碳原子的TAG与“野生”来源相关。

鱼类营养学研究已经确定，中性脂质通常比极性脂质更受饮食的影响（Olsen等人，1991年，2013年），但极性脂质也受饮食影响（Bell等人，1991年）。含有超过54个脂肪酸碳原子的TAG与富含鱼类的饮食相关（Luo等人，2023年）。自然界中的大多数脂肪酸具有偶数个碳原子（Wakil，1960年）。然而，也有一些脂肪酸具有奇数个碳原子（Gotoh等人，2008年），正如Lankinen等人（2016年）所讨论的，奇数链脂肪酸的含量可能与饮食有关。对大西洋鲑鱼肌肉的GC–MS分析（Molversmyr等人，2022年）发现，野生鱼类中的C15:0、C17:0、C17:1n-7和C21:5n-3含量略高于养殖鱼类。本研究的脂质组学分析中没有包括鱼类肌肉样本。然而，在桡足类中，这些个别脂肪酸的含量占总脂肪酸的不到0.5%（通过GC分析）。因此，虽然这些脂肪酸可能作为野生来源的潜在标志物，但与植物来源的脂肪酸相比，它们作为野生/养殖分类的区分因素似乎不够稳健。鞘磷脂是存在于细胞膜中的极性脂质，占成年海虱脂质的约3%（Tocher等人，2010年）。大西洋鲑鱼皮肤的脂质组学谱型显示SM42:3是最丰富的鞘磷脂（Ivanova等人，2021年），而其他鱼类物种中则报告SM44:2是最丰富的（Wang等人，2019年）（后者还在SM中鉴定了C16:3）。据作者所知，SM44:7和SM44:8（含有大量双键的长链脂肪酸的鞘磷脂）之前尚未在鱼类组织或海虱中报道。然而，PC44:7已在鱼类组织中报道（Wang等人，2019年）。本研究的一个明显局限性是分配是暂定的，结果应谨慎解释。尽管如此，含有长链多不饱和脂肪酸的SM的存在可能暗示与野生来源的潜在联系。

同位素比率
众所周知，δ13C同位素比率在海洋和陆地碳源之间存在差异；海洋环境通常富含较重的13C同位素（Chisholm等人，1982年）。虽然动物组织的δ13C反映了其饮食的δ13C，并且对于每个营养级来说相对稳定（增加0-1‰），但δ15N通常每个营养级会增加约3‰（Camin等人，2016年；Pike和Wadsworth，1999年；Post，2002年）。因此，初级生产者的δ15N值预计低于次级和三级生产者。商业鱼饲料含有更多的陆地植物成分，预计其δ15N和δ13C低于主要以鱼类、鱼苗和浮游甲壳类为食的野生大西洋鲑鱼的饲料（Rikardsen和Dempson，2010年）。

野生鲑鱼与养殖鲑鱼相比具有更高的δ15N，这与多项早期关于野生和养殖鲑鱼的研究结果一致（Anderson等人，2010年；Dempson和Power，2004年；Moreno-Rojas等人，2008年），而其他研究也报告了野生鲑鱼的δ15N类似或低于养殖鲑鱼（Molkentin等人，2007年）。同样，野生大西洋鲑鱼与养殖大西洋鲑鱼相比具有更高的δ13C，这也与几项最近的研究一致（Butterworth等人，2004年；Dean等人，2011年；Molkentin等人，2007年），而其他研究则报告野生鲑鱼的δ13C低于养殖大西洋鲑鱼（尽管使用了经过脂质校正的值（Dempson和Power，2004年）。正如Camin等人（2016年）所回顾的，关于13C和15N在野生和养殖鲑鱼中是减少还是增加的不一致结果，也可能由于分析了大量组织以及不同的物种、来源、蛋白质消耗或由于食物稀缺或丰富而导致的代谢周转（Camin等人，2016年）。例如，在测量大量组织中的稳定同位素比率时，养殖鲑鱼中较高的脂质含量可能导致较高的δ13C，可能掩盖了摄入饲料的较低δ13C（与野生鱼的猎物相比，Molkentin等人，2015年）。另一方面，δ15N受脂质含量的影响较小，因为脂质几乎不含氮（Molkentin等人，2015年）。然而，小型生物的全身δ15N测量可能会受到肠道内容物的影响，正如Dean等人（2011年）在研究鲑鱼虱寄生阶段时所报告的，因为饮食通常具有较低的δ15N。由于过去几十年商业鱼饲料中陆地植物成分的增加，预计养殖鲑鱼的δ15N和δ13C已低于野生鲑鱼。

合并和个别桡足类的δ13C结果表明，养殖来源的较低δ13C特征也反映在桡足类中。关于δ15N，合并的桡足类样本显示了类似的趋势，但由于只分析了每种来源的一个组（因为无法分析个别桡足类），因此无法得出结论。成年海虱中的氮和碳主要来源于宿主鱼（Dean等人，2011年）。据报道，宿主鱼组织和全身外寄生虫之间的δ13C和δ15N谱型之间的关系因宿主鱼组织和研究的寄生虫种类而异（Dean等人，2011年；Taccardi等人，2020年）。Dean等人（2011年）分析合并的桡足类样本后得出结论，δ13C显示出将L. salmonis追溯到宿主鱼的野生或养殖来源的潜力，而δ15N不太适用，因为分析的野生和养殖鱼类的δ15N特征不够明显。海虱幼虫的δ13C特征与宿主鱼无法区分，直到L. salmonis的早期chalimus阶段。然而，在分析寄生阶段时还应考虑肠道内容和在鱼体上的附着位置（Dean等人，2011年）。L. salmonis在海鱼鳃上的chalimus阶段的δ15N比率低于在鳍和体表面的比率，这可以通过海虱在鳃上优先摄取血液来解释。虽然吸血通常在鱼体上的移动前成虫I阶段开始（Heggland等人，2020年），但在鳃上采集的海虱可能会更早开始吸血，尽管鳃感染主要在实验室试验中观察到（Heggland等人，2020年）。

本研究中分析的非摄食性浮游海虱桡足类阶段预计其氮和碳来源于其母虱。然而，需要分析更广泛的来源才能确定δ13C和δ15N是否足以区分合并样本的野生和养殖来源，正如大多数研究中所推荐的，结合几种同位素比率可以提高方法的稳健性（Li等人，2016年回顾）。尽管化合物特异性同位素分析（例如，在氨基酸、脂肪酸或甘油中）可能是一种更准确的方法（Budge等人，2023年；Thomas等人，2008年；Wang等人，2018年），但由于样本量较少，这对于分析个别海虱幼虫并不十分相关。

元素谱型
养殖和野生鲑鱼肌肉中总As的元素组成差异与先前的研究结果一致（Anderson等人，2010年；Lundebye等人，2017年）。肌肉中的Cd水平在野生和养殖鲑鱼之间也存在显著差异，但浓度较低，与先前研究表明的鲑鱼肌肉中这种元素的积累有限一致（Berntssen等人，2010年；Lundebye等人，2017年）。虽然报道野生鲑鱼的肌肉中必需微量元素Zn的含量高于养殖鲑鱼（Anderson等人，2010年；Lundebye等人，2017年），但在本研究中发现的浓度相似，而在皮肤样本中观察到较大的组内变化。在Oplegnathus fasciatus的野生和养殖鱼类肌肉组织中，也报告了Zn、Cd和As的显著差异（Lu等人，2024年），以及养殖和野生虾之间的As差异（Carter等人，2015年）。这两项研究都指出，这些元素的浓度在养殖鱼类中低于野生鱼类，本研究分析的有限样本中也观察到了同样的模式。其根本机制在于，养殖鱼类和野生捕捞的鱼类具有不同的食物来源，并且暴露于不同的环境条件下，从而导致元素特征的可区分性。众所周知，像Hg、Pb、Cd和As这样的金属会通过水、沉积物和食物在野生海洋鱼类体内积累（Julshamn等人，2004年；Larsen和Hjermann，2022年）。水产养殖饲料中的金属浓度比野生猎物中的更为可控，这可能导致养殖三文鱼的生物积累量低于野生三文鱼。关于三文鱼和成年三文鱼虱子的研究结果显示，包括As/K、Rb/As和As/P在内的多个元素比率在野生和养殖来源之间存在差异。对于桡足类幼体，As/K比率在野生和养殖来源之间存在差异，但统计上不显著，而Rb/As、As/P以及Zn/K比率则显示出显著差异。这些结果表明，后者比率对于区分三文鱼虱子的野生和养殖来源是相关的。已经进行了元素分析以追踪成年三文鱼虱子的来源（Shinn等人，2000年）。初步研究表明，通过多元元素分析可以区分来自不同地点（四个养殖组和三个野生组）的成年三文鱼虱子与其宿主鱼。然而，单变量元素分析不足以在同一地点区分所有野生和养殖的海虱。作者强调，由于元素特征的生物学基础尚未确立，需要进一步研究来确认其区分来源的可靠性（Shinn等人，2000年）。海洋生物的元素特征可能受到遗传、饮食和环境条件的影响，包括元素的浓度和生物利用度，后者因素可能因地点、深度和盐度而异（Shinn等人，2000年）。Li等人（2016年）在综述多元素和稳定同位素分析以确定渔业和水产养殖产品的来源时指出，必须澄清元素指纹作为认证方法的机制，以确保其可靠性和稳定性。元素分析在追踪养殖和野生亚洲鲈鱼的地理来源方面显示出潜力，并且据报道比稳定同位素更准确；然而，建议结合这两种方法以提高准确性（Gopi等人，2019年）。

据我们所知，这是首次研究不同化学指纹以追踪处于幼虫阶段的单个三文鱼虱子的来源。幼虫的样本量很少（2-6微克），这对上述几种分析方法来说是一个挑战。通过识别化学比率而不是化学浓度可能有助于克服确定幼虫体重的难题；然而，样本量少仍然是许多分析方法的挑战。

脂肪酸组成
提取脂质通常是脂质分析的第一步。对于脂肪酸的分析，下一步是将脂肪酸转化为甲基化形式，然后使用不同的检测器（如FID）进行气相色谱（GC）。直接甲基化而不先提取脂质（Abdulkadir和Tsuchiya，2008年）是一种针对小体积样本的替代方法，之前已在Calanus finmarchicus（桡足类幼体V期）上进行了测试（Bergvik等人，2012年）。然而，三文鱼虱子幼体的质量太低，无法使用所采用的方法检测脂肪酸组成。需要进一步开发该方法，以确保对n=5和n=10个桡足类幼体的样本获得可重复的结果。甲基化效率可能因样本的完整性而异，因为原始方法（Abdulkadir和Tsuchiya，2008年）涉及精细研磨，由于样本量小而具有挑战性。另一个不确定因素是，甲基化程度可能因存在的脂质类别而异（Christie，1993年；Schlechtriem等人，2008年；Sehl等人，2018年）。

脂质组学分析
使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行脂质分析比传统的GC具有更高的灵敏度，并允许对不同脂质类别中的脂肪酸进行详细分析（Chatterjee等人，2019年；Malzahn等人，2022年）。然而，该方法需要脂质的均质化/提取步骤，这可能导致样本损失并引入不确定性，尤其是在样本量较小时。当前实验的综合数据表明，所开发方法的总体灵敏度太低，无法通过单个桡足类幼体获得良好的结果，因此不能用作测试来源的方法。此外，解释非靶向脂质组学的结果比分析脂肪酸谱更复杂。另一种方法是使用更针对性的脂质组学方法，例如，获取有关含有C18:2n-6的脂质分子的信息（Luo等人，2023年；Yun等人，2020年）；然而，需要进一步研究以确定这些方法的灵敏度是否足以分析单个桡足类幼体。

稳定同位素
对混合样本中的整个桡足类幼体进行稳定同位素分析可以区分养殖和野生来源的样本。单个海虱幼体中的氮含量不足以通过IR-MS检测氮，因此无法测量δ15N。然而，单个海虱中的碳浓度足以确定整个身体的δ13C。通常需要结合多种同位素比率才能充分分类野生/养殖来源；然而，由于样本质量低，使用现有方法对单个三文鱼虱子幼体进行多次破坏性分析是不可行的。

元素比率
当前的工作表明，在收集的样本中，宿主鱼类、成年三文鱼虱子和桡足类幼体的组织中的多个元素比率在养殖和野生来源之间存在差异。这些发现说明了使用多个元素比率作为指纹来追踪桡足类幼体到其宿主鱼来源的潜力。桡足类幼体的数量对多个识别出的比率影响有限，表明ApexQ-ICP-MS方法具有高灵敏度，可以精确识别单个桡足类幼体中的多个元素比率。成功识别了单个桡足类幼体中的As/K、Rb/As、As/P和Zn/K比率，并显示出在测试的野生和养殖来源之间存在差异。由于野生和养殖来源的桡足类幼体之间存在一些重叠，单个元素比率不足以可靠地识别宿主来源，但组合多个元素比率可能足够可靠。尽管Rb/As在野生和养殖来源之间有显著差异，但这些元素的比率随样本中桡足类幼体的数量而变化，这表明分析过程中可能存在污染问题。某些元素比率（如Cd/K）也预期在野生和养殖来源之间存在差异，基于野生和养殖三文鱼的Cd差异以及早期研究结果，但在单个桡足类幼体中无法准确识别。然而，相信使用在酸洗管中直接采样的开发方法将减少背景噪声并提高灵敏度，从而可能允许在指纹工具中包含更多的元素比率。

实施元素比率以追踪桡足类幼体来源的可行性
当前研究表明，成年三文鱼虱子、卵链以及由此产生的桡足类幼体混合样本中的多种化学指纹根据宿主三文鱼是野生还是养殖的不同而有所差异。在本研究中测试的方法中，元素分析显示出追踪单个三文鱼虱子来源的最大潜力，因为其分析灵敏度很高。然而，需要分析更广泛的样本范围，以确定所建议方法追踪三文鱼虱子野生或养殖来源的潜力。当前研究仅从挪威Tr?ndelag地区的两个有限地理区域（生产区6和7）采集了野生和养殖的大西洋三文鱼样本。然而，除了大西洋三文鱼之外的其他鲑鱼种类，如野生海鳟（Salmo trutta）（可以携带大量虱子）以及北极红鲑（Salvelinus alpinus）和粉红鲑（Oncorhynchus gorbuscha），也可能对虱子的传播有所贡献（Bj?rn和Finstad，2002年；Braden等人，2015年）。实际上，由于海鳟倾向于停留在峡湾内部（Finstad等人，2005年），它们可能成为没有水产养殖设施地区三文鱼虱子的主要宿主。因此，追踪方法应能够区分来自养殖鱼类的桡足类幼体和来自野生鲑鱼的桡足类幼体。由于海鳟通常栖息在河流附近，其饮食中陆地来源的比例可能高于野生三文鱼，因此包括来自野生海鳟的桡足类幼体是很重要的。因此，进一步的研究应集中在通过分析挪威更广泛地区的参考样本来评估该方法的变异性和可靠性，包括其他鲑鱼种类。

一个关键假设是，野生和养殖鲑鱼之间的饮食差异反映在鱼类、母虱子及其卵链中，最终反映在桡足类幼体中。用富含有机形式矿物质的鱼粉替代植物来源的鱼粉，导致了需要添加含有Zn、Fe、Cu、Mn和Se等无机形式必需矿物质的预混料（Kokkali等人，2025年；Prabhu等人，2019年；Aas等人，2022b）。然而，饲料的矿物质组成差异很大（Tacon和De Silva，1983年），并且养殖三文鱼的不同大小和批次之间可能存在差异，野生三文鱼也可能因食物和环境条件的不同而有所不同。当前研究的结果表明，元素谱型中最显著的差异与水产养殖饲料中特定元素的较低水平有关（例如，野生来源的桡足类幼体显示出比养殖鱼类更高的As/K和Zn/K）。分析更广泛的鱼类样本将有助于评估元素指纹在区分野生和养殖来源方面的可靠性。由于野生/养殖来源之间的某些比率存在重叠，可能需要结合多种比率才能进行可靠的分类。

还需要进一步研究不同元素从鱼类转移到虱子的机制以及元素指纹在虱子生命周期中的稳定性。带有卵链的成年虱子根据宿主的营养而增大（Hamre等人，2019年）。因此，初始幼体的化学指纹预计不会在雌性成年虱子、卵链或产生的桡足类幼体中大量存在。在浮游阶段，三文鱼虱子幼体在附着宿主之前不进食。然而，不同浮游阶段中元素指纹的变化仍有待研究。桡足类幼体附着在新宿主鱼后开始进食，它们的元素指纹可能会逐渐反映新的宿主鱼。目前尚不清楚桡足类幼体的初始元素指纹在附着后能保留多久。先前的研究表明，例如，无节幼体和桡足类幼体的脂质储备消耗取决于温度（Hamre等人，2013年；Taccardi等人，2021年），这表明元素谱型也可能受到这些因素的影响。

在进行了上述更广泛的筛选和验证后，可以应用一种成功的方法来确定虱子幼体的野生或养殖来源。通过建立一种稳健且经过验证的方法来分析单个虱子幼体（最好是新附着的桡足类幼体在鱼身上），并将其指纹与全面的参考样本数据库进行比较，可能可以追踪宿主鱼的野生或养殖来源。一种有效的方法可以提供宝贵的见解，例如，了解桡足类从养鱼场被携带的距离，以及野生鲑鱼在传播过程中所起的作用。该方法的一个可能应用是在有限的地理区域内进行研究，以更好地理解传播动态并改进扩散模型，从而实现更有效的控制和预防。对于寄生阶段，还需要进一步研究以确定其在新宿主上定居时的元素特征稳定性，以及肠道内容物和环境因素如何改变这些特征。所提出的方法没有考虑有机生产的鲑鱼宿主，因为这会引入显著的变异，并可能导致野生/养殖鲑鱼之间的分类不那么明确，因为有机养殖中使用的海洋成分比例高于传统养殖。另一个方面是，聚集在养鱼场附近的野生鱼类可能会摄入饲料残渣，导致其元素特征与养殖鱼类相似。尽管已有研究表明，如黑线鳕、狭鳕和鳕鱼等物种会聚集在养鱼场周围（Dempster等人，2009年；Uglem等人，2009年），并且它们的脂肪酸组成可能与水产养殖饲料相似（Fernandez-Jover等人，2011年；Skog等人，2003年），但据作者所知，尚未有研究报道鲑鱼也会出现在养鱼场附近。

结论：已经评估了不同的化学分析方法来确定桡足类阶段的单个鲑鱼虱幼虫的来源，特别是追踪其母虱是否附着在野生或养殖的鲑鱼上。本研究清楚地表明，尽管单个鲑鱼虱桡足类的样本量很小，但仍可以使用ApexQ-ICP-MS方法分析元素比例。对鱼类（肌肉和皮肤）组织样本的分析显示，野生鱼体内的多种金属浓度高于养殖鱼。在单个幼虫中测得的几种元素比例（如As/K、Rb/As、As/P和Zn/K）因宿主来源的不同而有所差异。这些比例（最好结合使用，因为某些元素比例之间存在重叠）可能被用作识别鲑鱼虱幼虫来源的生化特征。然而，由于本研究仅涉及有限的地理来源和宿主鱼类，因此需要通过更大的数据集进行进一步验证，涵盖更多地区和其他野生鲑鱼种类，以确定元素比例是否能够可靠地区分野生和养殖宿主。还需要进一步研究宿主鱼类和鲑鱼虱中元素特征的来源和稳定性。尽管存在这些局限性，目前的工作已经证明所开发的方法可以用于分析单个鲑鱼虱幼虫。经过进一步验证和优化后，元素比例有可能成为区分野生和养殖鲑鱼宿主的工具。该方法的一个潜在应用是研究特定地理区域内虱幼虫的传播情况，从而增加对传播动态的了解，并支持更好的控制和预防措施。

对混合桡足类样本的分析表明，在当前研究中，脂质谱和碳（C）及氮（N）的稳定同位素可以用来区分来自野生和养殖鲑鱼宿主的虱类。然而，应分析涵盖不同季节、地理区域和宿主物种的更广泛样本集以验证这些发现。无论如何，还需要进一步的方法开发，以便能够在单个鲑鱼虱桡足层面上进行分析。这包括使用GC-FID进行脂肪酸组成分析、使用LC–MS/MS进行脂质组学分析以及使用IRMS进行氮同位素分析。