球茎生态型及栽培地点调节了Bacillus sp. D5菌株对藏红花产量和品质提升的效应程度

《Discover Bacteria》：Corm ecotype and cultivation location modulate the magnitude of Bacillus sp. strain D5 mediated enhancement of saffron yield and quality

　　**摘要**
这是首次全面的多变量分析，评估了一种基于芽孢杆菌D5（Bar D5）的生物制剂对土壤肥力和藏红花生长表现的影响，研究对象包括传统和非传统种植区域中的两种藏红花生态型。来自克什米尔（Km）和基什特瓦尔（Kw）的两种藏红花生态型的球茎经过Bar D5生物制剂处理后，在传统种植地普尔瓦玛（Pulwama）和非传统种植地曼迪（Mandi）进行栽培。研究评估了生物制剂、种植地点和生态型之间的相互作用对植株生长、开花、柱头产量和质量、土壤物理化学性质、根际细菌动态以及Bar D5在田间的持久性的影响。Bar D5处理显著增强了开花、柱头生物量和质量参数，以及植株的形态特征，包括茎长、根长和数量、叶数和子球茎重量。尽管Bar D5处理后茎和子球茎的数量有所减少，但单个球茎的重量增加了，这表明资源分配向营养生长和繁殖潜力倾斜。值得注意的是，在非传统种植地，Bar D5处理的球茎产生的柱头质量与传统种植地相当。两种地点的土壤健康参数（包括氮、磷、钾、有机碳和钙含量）也得到了显著改善。主成分分析和皮尔逊相关性分析显示，Bar D5生物制剂在非传统地区具有提高藏红花产量和质量的潜力。然而，处理效果受到种植地点和生态型的影响。克什米尔生态型的表型稳定性高于基什特瓦尔生态型。在两个地点中，Bar D5的效果在曼迪更为明显。

**1 引言**
藏红花（Crocus sativus L.），被誉为“红色黄金”，是世界上最昂贵的香料[1,2]。由于其药用特性（如抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗分泌、抗抑郁和抗癌作用）[3,4,5]，它在食品、纺织、化妆品和制药行业中有着广泛的应用[3,4,5]。这些特性归因于柱头中的生物活性次级代谢物，主要是crocin、crocetin、picrocrocin和safranal[6,7]。
由于各种生物和非生物因素的限制（包括土壤肥力下降[8,9]），全球藏红花产量一直在下降。为了弥补这一差距并增加产量，人们采取了多种策略，例如将藏红花种植引入非传统地区以及采用受控环境栽培系统，包括水培和气培等无土栽培方法[1, 10,11,12,13]。尽管受控栽培系统能够获得更好的产量和质量，但它们对基础设施要求较高，对于小规模农民来说可能成本较高[14]。因此，在非传统地区引入藏红花种植是一种更可行的增产方法。此前，藏红花已成功引入印度查谟地区的普恩奇（Poonch）县曼迪（Mandi）这一非传统地区；然而，那里的球茎和柱头质量不如传统种植地普尔瓦玛（Pulwama）[1]。
藏红花属于鸢尾科（Iridaceae），是一种单子叶、多年生、三倍体的雄性不育草本植物[2]。它被认为是单基因型的，缺乏遗传多样性[15]。藏红花通过球茎进行无性繁殖，并在三年内完成生命周期[1, 16]。在营养生长阶段产生小球茎的球茎称为母球茎，而小球茎则称为子球茎[2]。母球茎的大小与香料的产量和质量呈正相关[17,18,19]。为了增加母球茎的大小，农民通常使用化学肥料，但这会降低土壤质量并导致土壤和水污染[20]。通过使用生物肥料可以减轻化学肥料的危害，生物肥料既能提高作物产量和质量，又能改善土壤肥力，同时不损害环境[21]。
一种本地分离的芽孢杆菌D5（Bar D5）株系从藏红花球茎的球茎层中提取，此前已证明其在田间的有效性，并显示出替代化学肥料的潜力[22]。其他藏红花种植国家（如伊朗、印度、西班牙、摩洛哥等）也报告了基于植物生长促进细菌（PGPB）的生物制剂的效果[23,24,25,26,27,28,29]。然而，这些研究存在一些共同的限制，本研究对此进行了探讨。首先，大多数田间研究仅持续了一到两年，包括之前的Bar D5田间研究。由于藏红花是一种多年生作物，其生命周期至少为三年[16, 30]，因此需要对其整个生命周期内的效果进行深入研究。其次，大多数研究仅评估了有限的参数，往往侧重于球茎产量指标，而忽视了对植株生长、土壤性质、这些因素之间的相互作用以及所研究PGPB在田间的持久性的全面评估。第三，大多数研究仅在特定的农业气候条件下考察了单一生态型。相比之下，本研究在整个三年生命周期内进行了观察，使用了两种不同的生态型，在两个种植地点进行了研究，重点关注开花参数、基于活性代谢物的香料质量、形态参数、土壤性质以及Bar D5在田间的持久性。这种为期三年、多参数、双地点-生态型的研究方法显著推进了评估Bar D5生物肥料在传统和非传统地区藏红花生产系统中的实际可行性和长期可持续性。本研究在印度查谟和克什米尔地区的皮尔潘贾尔（Pir Panjal）山脉的普尔瓦玛（传统种植地）和曼迪（非传统种植地）进行了评估，此前曼迪地区已开始种植藏红花[1]。Bar D5在两个地点和两种生态型中均对植株生长和产量产生了积极影响，尽管效果强度主要受地点影响，其次受生态型影响。

**2 材料与方法**
2.1 田间试验样品采集
从当地农民处获取了两种不同生态型的健康球茎，重量为8–10克：克什米尔地区（Pampore，北纬33° 59’ 53.31” 东经74° 54’ 41.14”）的Km生态型和查谟和克什米尔地区基什特瓦尔区（北纬33° 21’ 9.54” 东经75° 41’ 24.88”）的Kw生态型。球茎采集于2020年7月中旬，并于2020年8月初种植在选定地点。种植前，球茎被储存在实验室的暗色黄麻袋中，温度为4°C。
2.2 田间试验地点选择
本研究选择了两个地点进行田间试验：一个是传统的普尔瓦玛（位于克什米尔山谷），另一个是非传统的曼迪（位于普恩奇地区），该地区此前已开始种植藏红花[1]。每个地点的地理坐标、海拔和土壤类型见表1。2020–2023年研究期间的气候条件（包括温度范围、年降雨量和湿度百分比）见表2。
2.3 Bar D5生物制剂的制备
芽孢杆菌D5（Bar D5）株系取自印度查谟大学生物技术学院的宏基因组学实验室的菌种库。该菌株此前从印度基什特瓦尔地区的藏红花球茎的球茎层中分离得到[22]。生物制剂的制备方法遵循Magotra等人的方法[22]。将活性生长的Bar D5菌落从营养琼脂平板接种到200毫升营养肉汤中，在37 ± 1°C下培养48小时，同时以180转/分钟的转速在摇床（Scigenics）中持续摇动，直到细胞计数达到10^8 CFU/mL。通过菌落形成单位（CFU）测定检查细胞活力，然后将含有活性细胞的肉汤与高压灭菌的碳酸钙（CaCO3）粉末按1:1（体积/重量）比例混合。作为对照，未接种的无菌肉汤也在相同条件下与CaCO3混合。混合物在35°C下干燥，装入无菌密封的塑料袋中，室温（约25°C）下保存直至使用。生物制剂于2020年7月制备，并于2020年8月用于球茎处理。使用前重新检查了储存的生物制剂中的Bar D5含量。
2.4 球茎处理和田间试验
制备了一种均匀的悬浮液，包含一个月龄的生物制剂、无菌蒸馏水（1:1体积/重量）和1%无菌羧甲基纤维素（CMC）作为粘合剂。将健康球茎浸入悬浮液中30分钟（每100毫升悬浮液10个球茎），以确保球茎表面均匀覆盖。处理后，球茎在室温下风干3–4小时，然后储存在实验室的4°C黄麻袋中。总共采集的Km和Kw球茎中，50%用对照制剂处理（用无菌水代替Bar D5培养液处理），50%用Bar D5生物制剂处理（测试处理）。这样形成了四组不同的球茎，详见表3。
田间试验于2020年8月初在两个地点进行，采用完全随机区组设计（CRBD）。准备了尺寸为2英尺×4英尺的矩形高床，周围有20厘米的排水沟。球茎以10厘米的间距种植，行间距为20厘米，深度为13–15厘米[1]。每个地点每个处理组种植三个重复床。在整个植物生长周期中，手动去除杂草，未进行额外灌溉。数据收集分为两个生长阶段：开花期（11月）和营养生长期（3月），连续三年（2020–2021、2021–2022和2022–2023年）。
2.5 样品采集
2.5.1 开花期数据收集和参数评估
2020年至2023年每年10月和11月，分别在普尔瓦玛和曼迪手工采摘花朵。开花期间记录环境参数（如温度和湿度，见补充表1）。采集后立即将柱头在阴凉处干燥20–24小时，然后储存在黑色玻璃罐中。记录花朵数据，包括花朵数量、柱头长度（厘米）以及柱头的鲜重和干重（毫克）。
2.5.2 柱头的生化分析
根据ISO标准协议[14, 31]，通过光谱法分析了活性代谢物crocin、picrocrocin和safranal。柱头用液氮冷冻粉碎成粉末，随后将粉末（100毫克）与蒸馏水（900毫升）混合在1升容量瓶中。溶液在黑暗中涡旋1小时，以防止活性化合物因光照而降解或异构化。取20毫升样品，与180毫升蒸馏水混合后，通过PTFE过滤器（0.45微米，Himedia）过滤。使用UV-Vis分光光度计（Thermo Scientific GENESYS? 10 S）分别在440、330和257纳米波长下测量滤液的吸光度，以检测crocin、picrocrocin和safranal的含量。代谢物的百分比使用以下公式估算：$$ \:{\text{E}}_{{1{\text{cm}}}}^{{1\% }} = \left( {\frac{{\text{A}}}{{\text{M}}}} \right){\text{X}}100 $$其中，A是吸光度，M是柱头的干重（毫克）。2.5.3 生长阶段数据收集和参数评估在2021年至2023年的每年3月的第二周，从每个处理组中随机选取10株植物进行采样。记录了形态参数，包括茎和根的长度（厘米）、每个球茎的茎数、每根茎的根数、每株植物的叶数、子球茎的数量以及子球茎的重量（克）[1, 22]。2.6 根际土壤分析为了研究Bar D5对土壤养分、总芽孢杆菌数量以及田间条件下Bar D5稳定性的影响，在生长阶段每年从两个地点收集根际土壤样本，因为植物仅在生长阶段被拔除。将对照组（KmC和KwC）和处理组（KmT和KwT）的根际土壤样本合并，以生成每个地点的复合对照和处理样本。2.6.1 根际土壤分析在生长阶段从每个处理组收集根际土壤样本，并外包给印度的Yara Fertilizers Pvt. Ltd.进行全面的矿物质分析。分析的土壤性质和矿物质包括pH值、电导率、氮（N）、磷（P）、钾（K）、有机碳（OC）、硫（S）、锌（Zn）、硼（B）、铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、钼（Mo）、钙（Ca）和镁（Mg）的含量。2.6.2 根际土壤中总芽孢杆菌负荷和Bar D5丰度的估算使用热处理方法从根际土壤样本中分离出总芽孢杆菌[22]。细菌负荷使用以下公式计算[32]，$$\:\text{C}\text{F}\text{U}/\text{g}=\frac{(\text{N}\text{u}\text{m}\text{b}\text{e}\text{r}\:\text{o}\text{f}\:\text{c}\text{o}\text{l}\text{o}\text{n}\text{i}\text{e}\text{s}\times\:\text{D}\text{i}\text{l}\text{u}\text{t}\text{i}\text{o}\text{n}\:\text{f}\text{a}\text{c}\text{t}\text{o}\text{r})}{\text{V}\text{o}\text{l}\text{u}\text{m}\text{e}\:\text{p}\text{l}\text{a}\text{t}\text{e}\text{d}}$$通过扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）确定Bar D5在总芽孢杆菌负荷中的相对丰度。为此分析，从每个处理组的总芽孢杆菌分离平板中随机选取20个菌落进行分子鉴定。使用三饱和酚提取法[33]提取基因组DNA。通过分光光度法和琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量和完整性。使用引物16S 8F和16S 1522R[22]扩增16S rRNA基因。扩增产物用Hae III限制性内切酶切割，并按照Urshev等人[34]提供的协议分析切割模式。为了生成参考切割模式，使用Hae III扩增并切割实验室中的纯Bar D5培养物的DNA。Bar D5的相对丰度表示为每个样本中具有与Bar D5匹配ARDRA模式的菌株所占的百分比。2.7 统计分析、多元分析和相关性分析对于开花数量的分析，取了所有三个处理组三个床位的汇总数据。对于柱头的鲜重和干重，取了10个随机样本的平均值。对于形态特征的分析，取了10个生物重复实验的平均值[1]。使用IBM SPSS Statistics版本26进行统计分析[35]。数据以处理组和对照组之间的差异表示，平均值为Δ (T-C)，分别针对第一年、第二年和第三年。开花数量、crocin含量、picrocrocin含量和根数分别除以20、10、1.5和10，以便与其他参数的范围对齐，以便进行对比线图可视化。实际数据在补充文件（表1-19）中，使用Tukey’s HSD测试进行显著性检验（p < 0.05）。进行主成分分析（PCA）和皮尔逊相关性分析，以研究Bar D5对两种生态型（Km和Kw）在两个不同地点（Pulwama和Mandi）连续三年中的多变量效应。数据集包括植物生理特征、产量属性、土壤养分变化（ΔOC、ΔN、ΔP、ΔK、ΔCa）和微生物参数（总芽孢杆菌负荷和Bar D5负荷）。通过Z-score标准化消除单位和尺度偏差。提取前两个主成分（PC1和PC2），并生成双标图以可视化样本聚类。分析在Python（v3.10）中使用scikit-learn库（StandardScaler和PCA模块）[36]进行。使用NumPy和pandas计算皮尔逊相关系数（r），以量化植物、土壤和微生物变量之间的成对关系[37]。使用seaborn和标准化数据生成热图，并固定变量顺序，以便直接比较不同地点和球茎生态型之间的差异。结果部分报告了显著的相关性（p < 0.05）。3 结果三年田间数据（2020–2023年），涵盖了生长和开花阶段，包括完整的藏红花生命周期，显示在图1a-f和2a-g中。Kashmir（Km）和Kishtwar（Kw）生态型的Bar D5处理显著改善了生长、开花数量、生物量和与柱头质量相关的代谢物积累，无论是在传统还是非传统栽培地点。尽管Bar D5处理对藏红花产量和质量的总体效果是积极的，但详细分析显示对Bar D5处理的响应模式并不均匀。Bar D5介导的增强程度在传统和非传统地点以及两种生态型之间有所不同，表明响应既受地点也受生态型的影响。此外，增强程度在研究期间并不是静态的；从第一年到第三年逐渐变化。为了系统地捕捉Bar D5对两个地点两种生态型选定参数的年际变化，结果表示为处理组和对照组植物之间选定参数的平均差异[Δ (Treated-Control)]，而不是绝对值。对照组和处理组的相应绝对值在补充表1–17中给出。3.1 Bar D5处理对开花、柱头生物量和质量的影响Bar D5处理在所有三年中显著增加了两个栽培地点的开花数量（图1a）。在Pulwama，Bar D5介导的增强程度在两种生态型之间有所不同：在Pulwama-Km中，第二年的增加最大，第三年略有上升；而在Pulwama-Kw中，第三年的增加最高。相比之下，在Mandi，两种生态型的开花数量从第一年到第三年逐渐增加（图1a）。Bar D5处理还增加了所有三年栽培期间的柱头鲜重和干重。与开花数量不同，对照组和处理组之间的柱头鲜重差异在第一年最大，第二年减少，第三年趋于稳定，但有两个例外：(i) 在Pulwama-Km中，差异持续减少到第三年；(ii) 在Mandi-Kw中，差异从第二年增加到第三年（图1b）。总体而言，Bar D5对柱头鲜重的影响在Pulwama三年中的效果比在Mandi更明显。此外，在Mandi的第一年，Bar D5介导的柱头干重增强程度显著，然后在第三年减少。在第二年，Mandi-Km的差异最大，其次是Pulwama-Kw和Mandi-Kw。在第三年，两个地点的干重响应相当，Pulwama的差异略高（图1c）。Bar D5处理显著增加了两种生态型的三种质量决定性代谢物——crocin、picrocrocin和safranal的含量（图1d-f）。对于crocin浓度，Bar D5介导的增强程度在第一年最高，第二年下降，第三年再次增加，所有四个地点-生态型组合均如此（图1d）。到第三年，Mandi的crocin浓度增加幅度高于Pulwama（图1d）。与crocin不同，picrocrocin的时间模式明显；处理组与对照组之间的差异在第一年最低，第二年最高，第三年适中。这种模式在所有四个地点-生态型组合中都是一致的（图1e）。总体而言，Pulwama的picrocrocin浓度增加幅度高于Mandi（图1e）。对于safranal浓度，记录了生态型特定的响应。在Km生态型（Pulwama-Km和Mandi-Km）中，第一年的差异最大，第二年减少，第三年再次增加，反映了crocin的年际变化模式（图1f）。相比之下，对于Kw生态型（Pulwama-Kw和Mandi-Kw），增强程度从第一年到第三年逐渐增加（图1f）。图1该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像图表显示了两种藏红花生态型对Bar D5制剂在三个栽培年份中的响应差异[Δ (Treated-Control)]，包括开花百分比和柱头质量：a 开花百分比 b 柱头鲜重 c 柱头干重 d crocin含量 e picrocrocin含量 f safranal含量 第一、第二和第三年的数据收集3.2 Bar D5制剂对生长参数的影响与开花参数类似，大多数生长参数都得到了Bar D5处理的改善，但有两个例外：茎数和子球茎数量。在所有地点-生态型组合中，处理组的这两个参数都持续减少（图2a-b）。在Pulwama，两种生态型的茎数减少在第二年不显著，第三年显著减少。在Mandi，两种生态型的反应不同：Mandi-Kw从第一年到第三年逐渐减少，而Mandi-Km从第一年到第二年减少加剧，第三年略有缓解。总体而言，Pulwama的茎数减少幅度大于Mandi，特别是在第三年（图2a）。与茎数类似，Bar D5处理组的子球茎数量也减少了；然而，减少的时间模式在两个地点之间有所不同。在Pulwama，两种生态型在第二年的减少幅度最大，第三年略有缓解。在Mandi，两种生态型的减少模式与茎数减少相似（图2b）。尽管Bar D5处理组的子球茎数量减少了，但与未经处理的对照组相比，子球茎的重量显著增加。Bar D5介导的子球茎重量增强程度从第一年到第三年在所有四个地点-生态型组合中逐渐增加（图2c）。Bar D5对茎长的影响似乎具有地点特异性。在Mandi，两种生态型在第二年的增强幅度略有增加，然后在第三年减少（图2d）。相比之下，在Pulwama，两种生态型的增强在第二年减少，第三年稳定（图2d）。此外，在Mandi，第二年两种生态型的叶数增加更为明显。然而，到第三年，增强幅度在所有四个地点-生态型组合中趋于一致，但在Pulwama的第二年，两种生态型的增强幅度更大（图1c）。三种质量决定性代谢物——crocin、picrocrocin和safranal在两个地点-生态型组合中均显著增加（图1d-f）。对于crocin浓度，Bar D5介导的增强程度在第一年最高，第二年下降，第三年再次增加，所有四个地点-生态型组合均如此（图1d）。到第三年，Mandi的crocin浓度增加幅度高于Pulwama（图1d）。与crocin不同，picrocrocin的时间模式明显；处理组与对照组之间的差异在第一年最低，第二年最高，第三年适中。这种模式在所有四个地点-生态型组合中都是一致的（图1e）。总体而言，Pulwama的picrocrocin浓度增加幅度高于Mandi（图1e）。对于safranal浓度，记录了生态型特定的响应。在Km生态型（Pulwama-Km和Mandi-Km）中，第一年的差异最大，第二年减少，第三年再次增加，反映了crocin的年际变化模式（图1f）。相比之下，对于Kw生态型（Pulwama-Kw和Mandi-Kw），增强程度从第一年到第三年逐渐增加（图1f）。图1相比之下，Pulwama-Kw偏离了这一趋势，在第一年增长之后，第二年出现了急剧下降（见图2g）。图2的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。图表显示了两种藏红花生态型对Bar D5生物制剂反应的差异[Δ（处理组-对照组）]，以及三年栽培期间在两个地点的植被参数：a. 新芽数量 b. 子球茎数量 c. 子球茎重量 d. 新芽长度 e. 叶片数量 f. 根的数量 g. 第一年、第二年和第三年的根长度。

3.3 Bar D5生物制剂对土壤养分动态的影响
如材料与方法部分2.6所述，土壤比较代表的是特定地点的响应，并不反映生态型之间的差异。在分析的15个参数中（材料与方法部分2.6.1），只有有机碳（OC）、氮（N）、磷（P）、钾（K）和钙（Ca）在处理组和对照组土壤之间存在显著差异。在两个地点，处理组土壤中的有机碳增加最为明显，尽管年际模式有所不同。在Pulwama，处理组与对照组土壤之间的有机碳差异从第一年增加到第二年，然后在第三年下降；而在Mandi，有机碳差异从第一年增加到第三年（见图3a-b）。Bar D5对磷和钾的影响在两个地点呈现大致相似的年际模式，尽管增强的程度有所不同。处理组与对照组土壤之间的磷差异随时间逐渐减小。对于钾，差异在第二年增加，在第三年减少（见图3a-b）。钙的动态在两个地点有所不同。在Pulwama，处理组与对照组土壤之间的差异随时间减小；而在Mandi，差异从第一年减少到第二年，然后在第三年再次增加。总体而言，Bar D5对土壤肥力产生了积极影响，特别是通过增加有机碳、氮、磷和钾的含量。Pulwama的反应相对温和，而Mandi则显示出更为明显和持续的养分增强模式。

图3的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。图表显示了三年栽培期间，在两个地点（a. Pulwama b. Mandi），根际土壤矿物质对Bar D5处理的差异[Δ（处理组-对照组）]，包括有机碳（OC）、氮（N）、磷（P）、钾（K）和钙（Ca）的含量，以及第一年、第二年和第三年的数据收集情况。

3.4 根际土壤中Bacillus和Bar D5负荷动态
图4a-d展示了在Pulwama和Mandi两个地点，连续三年藏红花生命周期中，处理组和对照组根际土壤样本中总Bacillus负荷和Bar D5负荷的比较分析。在Pulwama和Mandi，两个地点的处理组和对照组样本中的总Bacillus负荷在第一年最高，第二年急剧下降，第三年进一步下降（见图4a-b和补充表18）。有趣的是，当计算剩余的Bacillus（非Bar D5）负荷时，处理组土壤中的负荷大约是对照组土壤的一半（见图4e-f）。与总Bacillus负荷类似，Bar D5负荷也从第一年急剧下降到第二年，并在第三年进一步减少（见图4c-d和补充表19）。正如预期的那样，Bar D5负荷在两个地点的处理组样本中随时间保持较高水平（见图4c-d）。

3.5 多变量和相关性分析
3.5.1 主成分分析（PCA）
主成分分析（PCA）解释了74.5%的总方差，表明所测量变量的生物学相关性很强。PC1解释了43.5%的方差，主要代表了土壤肥力和微生物丰度变量，包括土壤有机碳（OC）、氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、总Bacillus负荷和柱头鲜重。PC2解释了31.0%的方差，主要捕捉了不同栽培年份之间的时间变化，清楚地区分了第一年的样本和第二年及第三年的样本（见图5）。在Pulwama，Pulwama-Km和Pulwama-Kw的样本在第二年和第三年都沿着负PC1轴聚集，与肥力和微生物相关的负荷向量相反。在Mandi，两种生态型在三年中都沿着正PC1轴聚集，与肥力和微生物相关的负荷向量一致。

3.5.2 皮尔逊相关性分析
与PCA结果一致，皮尔逊相关性分析揭示了由地点（Pulwama vs. Mandi）和球茎生态型（Km vs. Kw）塑造的不同关联模式。在两个地点，开花参数（开花百分比、柱头鲜重和干重）和根系特征（数量和长度）形成了一个强烈的正相关簇，表明在Bar D5处理下产量、质量和植物生长得到了协调改善。土壤养分的改善（ΔOC、ΔN、ΔP、ΔK、ΔCa）形成了一个独立但相关的关联块，在两个地点都与微生物负荷有中等程度的正相关。生态型之间的比较进一步揭示了不同的交互作用模式。Km表现出紧凑且一致的相关块，各特征之间的关联相对均匀，表明对Bar D5的生理反应稳定且协调（见图6c）。相比之下，Kw显示出更分散的相关结构，土壤养分、微生物负荷和植物特征之间的关联变化更大（见图6d）。这种更大的变异性表明Kw在Bar D5处理下具有更大的表型可塑性。

4 讨论
在包括印度、伊朗、土耳其和摩洛哥在内的多个藏红花种植国家，已有文献记录了PGPB对藏红花生长和产量的有益影响[22,23,24,25,26,27,28,29]。据报道，Rahnella aquatilis S11P1在摩洛哥的Taliouine地区增加了子球茎的数量和重量以及叶片数量[25]；Bacillus altitudinis FS2在印度喜马偕尔邦的非传统地区产生了大型子球茎[26]；Bacillus megaterium、Brevibacillus laterosporus和Paenibacillus mucilaginosus在中国田间条件下增加了子球茎的重量[23]；Burkholderia gladioli E39CS3在印度克什米尔地区增加了新芽长度和数量、根长度和数量以及子球茎数量和生物量[27]。一项为期两年的田间研究表明，K和Fe-Zn生物肥料的联合施用改善了伊朗的柱头产量、球茎重量和数量[24]。从藏红花球茎中分离出的Bacillus sp. D5菌株在印度克什米尔的Kishtwar地区提高了藏红花的产量和质量[22]。有趣的是，与早期研究[22]相反，本研究中所有形态参数都有所增加，除了新芽和子球茎数量在Bar D5处理后的植物中减少（见图2a-b）。这种对比结果可能是由于土壤气候条件、农艺实践和田间管理的差异。之前也有报道指出，生物制剂处理后新芽和子球茎数量会减少。例如，在西班牙进行的研究中，Bacillus subtilis FZB24减少了新芽数量[28]；在伊朗进行的研究中，Bacillus cereus BA6和Bacillus anthracis BA9减少了子球茎数量但增加了子球茎重量[29]。这种减少表明Bar D5可能重新编程了藏红花植物的资源分配，这需要进一步研究。较大的子球茎在农艺上更有优势，因为重量超过8克的子球茎在后续栽培周期中每球茎有可能产生更多的花朵和更大的柱头[15, 38]。此外，Bar D5显著增强了处理植物中柱头中质量代谢物（如crocin、picrocrocin和safranal）的浓度，在两个地点和两种生态型中都如此（见图1d-f）。这些化合物赋予香料颜色、味道和香气，并根据ISO 3632标准决定了藏红花的品质和市场价值[39, 40]。质量代谢物的时间模式对于确定每个地点的最佳收获时间具有实际意义。数据表明，Bar D5处理过的球茎在第一年的花朵产生的柱头具有最大的代谢物增强，这表明应优先考虑使用新处理的球茎进行商业柱头生产。有许多报告指出，在田间条件下，生物肥料可以提高质量代谢物的浓度。例如，在伊朗，50%的化学肥料与包括Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa和Azotobacter chroococcum在内的生物肥料的组合使crocin、picrocrocin和safranal的浓度分别增加了44%、62%和47%[41]。在印度，Burkholderia gladioli E39CS3使crocin和safranal的浓度分别增加了69.3%和246.8%[27]。在摩洛哥，PGPR菌株Rahnella aquatilis和Variovorax paradoxus提高了柱头的质量，表现为crocin、picrocrocin和safranal含量的增加[25]。在本研究中，两种生态型的处理样本中，两个地点的质量代谢物数量都有所增加。因此，非传统地点的香料质量达到了与传统地点相当的水平，而在传统地点，Bar D5的应用进一步提高了柱头的质量（见补充表5–7）。

PCA分析表明，生物制剂的效果受到地点和生态型的影响，但地点对生物制剂反应的影响大于生态型（见图1和2）。这种模式表明，地点的年际变化而不是生态型特异性差异是观察到的变化的主要原因。在Pulwama，从肥力相关轴的偏离可能反映了持续栽培下的养分逐渐耗尽或微生物动态的变化（见图5）。相比之下，在Mandi观察到Mandi-Km和Mandi-Kw之间有明显的分离，表明在该地点的土壤条件下生态型依赖性的差异更为明显。Mandi-Kw样本更接近于肥力和微生物相关变量以及更高的柱头产量，而Mandi-Km样本更接近于子球茎重量，表明这两种生态型在该地点的资源分配模式不同（见图5）。据报道，生物肥料的施用增强了土壤中固定养分的移动，从而提高了养分保持、植物生长、产量、球茎大小和养分吸收，同时减少了化学肥料的依赖[24, 30, 43]。在Pulwama，过度使用化学肥料和农药以及砖窑和水泥粉尘的沉积降低了土壤质量[44]。这些输入减少了土壤肥力，同时增加了重金属（As、Pb、Cr）的积累，导致微生物活性和土壤肥力下降，最终限制了克什米尔的藏红花产量[44, 45]。Mansotra等人[46]报告称，Pampore（Pulwama）的土壤pH值为碱性（8.5），养分水平相对较低，真菌多样性也较低，相对于Kishtwar和Ramban的土壤。在本研究中，Mandi的土壤受化学投入的影响较小，这可能解释了Mandi对Bar D5处理的反应更强，与生态型无关。

总体而言，PCA和相关性热图分析表明，栽培地点和球茎生态型在塑造Bar D5如何影响植物表型、土壤健康和微生物动态方面起着关键作用。在地理位置方面，Mandi展示了比Pulwama更协调的土壤-微生物-植物相互作用网络。从生态型来看，Kw在土壤养分改善、微生物丰度和产量特征之间表现出更强的耦合，而Km则显示出相对保守的特征结构，其内部分配模式更为明确。多项研究强调了土壤健康作为藏红花产量和质量关键决定因素的重要性[30, 43,44,45, 47,48,49]。不同地点和生态型之间子球茎数量与子球茎重量之间的持续负相关表明，球茎增殖与生物量积累之间存在基本的生物学权衡。有研究表明表观遗传学在决定藏红花不同表型方面起着核心作用[50]，而生态型显著影响藏红花的开花数量和产量[51,52,53,54]。在同一农业条件下进行的为期两年的田间研究表明，来自意大利（撒丁岛和阿布鲁佐）、西班牙（卡斯蒂利亚-拉曼查）和希腊（科扎尼）的四种生态型在分子标记上没有差异，但在营养形态参数上存在表型差异[15]。同样，在伊朗进行的为期两年的田间研究也发现不同生态型在营养参数和对生长季节的响应上存在显著差异[54]。与本研究类似，摩洛哥在两种不同农业气候条件下进行的为期三年的田间研究也表明，四种生态型在不同农业气候条件下的营养参数表现出不同的响应[55]。两种生态型在两个地点的Bacillus和Bar D5的总负荷从第一年到第三年都有所下降。这种在所有地点-生态型组合中一致的时间趋势表明，Bacillus总负荷的下降在很大程度上独立于生态型和种植地点。对于两种生态型来说，处理组样品中的Bacillus负荷都低于对照组样品（图4e-f），这表明Bar D5可能影响了Bacillus群落，并抑制了其中某些菌株的生长。文献中有很多报道指出生物肥料会改变处理植物的根际微生物组的生物量和多样性[56,57,58]。根际微生物群落结构通常由植物通过化学信号传递、养分供应、环境调节和竞争性抑制等多种机制塑造[59, 60]。据报道，多年生作物由于其广泛的根系、持续的土壤覆盖以及整个生命周期中根系分泌物的不断释放，能够稳定根际微生物组[61, 62]。然而，在藏红花中，尽管根系存在于开花和营养生长期，但在休眠期则不存在；不过，与第二年相比，第三年根际中Bacillus（尤其是Bar D5）的含量显著增加。似乎球茎可以作为微生物种群的储存库，维持稳定的内生或球茎内微生物种群，每年重新播种到根际中，或者土壤微生物种子库与植物选择压力的结合每年重新构建类似的根际群落结构。随着时间的推移，两种生态型在两个地点的Bacillus和Bar D5总负荷都减少了。这种在所有地点-生态型组合中的持续下降趋势表明，Bacillus总负荷的减少主要与生态型和种植地点无关。对于两种生态型来说，处理组样品中的Bacillus负荷都低于对照组样品（图4e-f）。这表明Bar D5可能影响了Bacillus群落，并抑制了其中一些菌株的生长。文献中有很多报道指出生物肥料会改变处理植物的根际微生物组的生物量和多样性[56,57,58]。根际微生物群落结构通常由植物通过化学信号传递、养分供应、环境调节和竞争性抑制等多种机制塑造[59, 60]。据报道，多年生作物由于其广泛的根系、持续的土壤覆盖以及整个生命周期中根系分泌物的不断释放，能够稳定根际微生物组[61, 62]。然而，在藏红花中，尽管根系存在于开花和营养生长期，但在休眠期则不存在；不过，与第二年相比，第三年根际中Bacillus（尤其是Bar D5）的含量显著增加。似乎球茎可以作为微生物种群的储存库，维持稳定的内生或球茎内微生物种群，每年重新播种到根际中，或者土壤微生物种子库与植物选择压力的结合每年重新构建类似的根际群落结构。随着时间的推移，Bar D5对植物参数和土壤质量的影响也减少了。第三年根际中Bar D5的负荷远低于用于启动球茎处理的初始负荷；这表明需要每年重新施用Bar D5来提高藏红花的产量和质量并改善田间土壤质量。许多研究者报告了根际中PGPB负荷与植物生长和质量之间的相关性[63, 64]，并建议重新施用这种生物制剂。综合多变量分析显示，尽管Bar D5生物制剂能有效提高藏红花的质量和产量，但其效果的大小受到地点、生态型、土壤健康状况以及生物制剂在田间的作用时间的复杂相互作用的影响。

**结论**
基于Bacillus sp. D5菌株的生物肥料提高了传统种植区（Pulwama）和非传统种植区（Mandi）的球茎和香料的质量。然而，传统种植区的表现优于非传统种植区，Km生态型在产量和质量上也优于Kw生态型。种植地点和生态型强烈影响Bar D5提高香料质量和产量的潜力。有趣的是，经过Bar D5处理后，非传统种植区Mandi的香料质量提升到了传统种植区Pulwama的水平，而Pulwama处理过的植物的香料质量进一步得到提升。尽管三年后从处理过的球茎中分离出了Bar D5，但其负荷却减少了。Bar D5负荷的减少与效果的大小直接相关。与其他刺激剂一样，为了获得最佳效果，需要标准化Bar D5的施用时间。有趣的是，对柱头质量的最大影响出现在第一年后，而对球茎质量的最大影响出现在第三年后。研究表明，根据研究的最终目标，可以在Bar D5处理后安排收获时间。此外，球茎似乎为Bar D5提供了一个适宜的生存环境，因为在休眠期没有根系存在的情况下，Bar D5仍然在整个生命周期中存在。无论地点和生态型如何，Bar D5的效果还取决于土壤健康状况。在Mandi土壤中，由于农业化学品的使用较少，Bar D5的效果更好。