由水文因素引起的变化驱动了新热带地区水库中鱼类环境DNA（eDNA）的生态学特征

《Hydrobiologia》：Hydrology-induced changes drive fish eDNA ecology in a neotropical reservoir

　　摘要
环境DNA（eDNA）宏条形码技术是评估受威胁的新热带水生环境生物多样性的强大工具，然而，静水系统中水位波动对eDNA可检测性和分布的影响仍知之甚少。因此，我们对Ingleses湖（一个小型城市新热带水库）的鱼类群落进行了多年的eDNA宏条形码调查，涵盖了高水位和低水位时期。研究发现，eDNA的可检测性受到水文变化的影响：在低水位条件下，每个地点的平均α多样性较高，而平均β多样性较低。尽管鱼类群落保持了稳定的核心组成（PERMANOVA F = 2.26，P = 0.056），但多元分布的均匀性存在显著差异（PERMDISP F = 22.23，P = 0.003）。这些结果支持这样的假设：水库的高水位条件导致物种可检测性降低，可能是由于eDNA被稀释所致。关键的是，结合高水位和低水位的调查数据得到的物种积累曲线接近渐近线，这表明在动态水文周期中进行时间重复采样对于最大化新热带静水系统中的eDNA检测效率至关重要。

引言
制定保护政策需要持续有效的生物多样性评估（Dudgeon & Strayer, 2025）。然而，使用传统采样方法监测生物多样性丰富的水生环境是一项巨大挑战，因为这既耗时又耗费资源，且需要存储捕获的样本（Miya et al., 2020）。在新热带地区这一点尤为重要，因为该地区拥有全球3%以上的淡水资源，并且拥有世界上最丰富的淡水鱼类物种（Reis et al., 2016; Tonella et al., 2023）。尽管生物多样性丰富，新热带环境却是受威胁最严重的地区之一，主要原因是自然资源的过度开发、气候变化以及外来物种的引入（Vitule, 2009; Pelicice et al., 2017; Prakash, 2017）。因此，需要更稳健和快速的生物多样性评估技术来改善新热带淡水地区的生物监测（Carvalho & Leal, 2023）。环境DNA宏条形码技术（即对生物体释放到环境中的DNA进行高通量测序）作为一种创新方法，相较于传统方法，在物种检测和鉴定方面表现出优势（Layton et al., 2006; Ficetola et al., 2008; Goldberg et al., 2011; Jerde et al., 2011; Dejean et al., 2012; Kelly et al., 2014）。该技术能够从单一环境样本中识别多种不同的生物体，减少了野外采样时间，并简化了环境监测的物流工作（Ruppert et al., 2019; Carvalho et al., 2025）。为了有效利用eDNA进行保护和生物监测，必须更好地理解影响物种可检测性的多种因素。方法学上，物种恢复可能会受到标记选择、引物不匹配以及PCR抑制剂存在的影响（Uchii et al., 2019; Hilário et al., 2023）。从生态学角度来看，可检测性主要由释放到环境中的DNA与其通过水流降解或去除的比例决定（Barnes & Turner, 2016）。此外，eDNA的释放速率因生物特性而异，生物体通过皮肤细胞、黏液、粪便和其他有机物质不断释放DNA（Jane et al., 2015; Klymus et al., 2015; Sassoubre et al., 2016）。环境条件如温度、pH值、紫外线辐射、沉积物组成和悬浮颗粒也会影响eDNA的持久性，从而影响其降解（Jane et al., 2015; Strickler et al., 2015）。水动力学，特别是水流，通过稀释和运输DNA来调节eDNA的浓度，从而影响其在流动水体中的空间分布和可检测性（Wilcox et al., 2016）。尽管对eDNA生态学的多个方面有了越来越多的了解，但对于静水系统（如水库和湖泊）中水位变化如何影响eDNA的稀释、分布和检测概率仍存在显著的知识空白（Harrison et al., 2019; Hervé et al., 2022）。在新热带地区，eDNA研究已应用于评估水库鱼类群落（Valdez-Moreno et al., 2019; Dal Pont et al., 2021）。例如，Dal Pont et al.（2021）使用eDNA宏条形码技术监测Itaipu水电站（巴拉那河，巴西南部）大坝和鱼类通道系统对鱼类群落的影响，并将其与传统监测方法进行了比较。在其他地区（亚热带和温带），eDNA宏条形码技术发现大坝区域物种丰富度和多样性低于自由流动河流段（Larson et al., 2017; Di Muri et al., 2020; Shu et al., 2022）。在中国的一项研究中，Zhang et al.（2020）使用eDNA宏条形码技术监测了不同大小（0.03平方公里、1.22平方公里和43.4平方公里）的淡水水库中的鱼类群落，发现两个较小水库的岸线和内部采样恢复的生物多样性相似，有助于确定使用eDNA进行此类环境生物监测的采样策略。尽管已知季节性动态会影响不同水生系统中的eDNA可检测性（Buxton et al., 2017; Stoeckle et al., 2017），但这些研究均未明确测试水库水位波动对新热带地区鱼类eDNA检测灵敏度的影响，而这些知识可以指导未来研究的采样设计和调查。

方法
Ingleses湖（IL）是21世纪初通过Peixe河筑坝形成的水库，位于巴西米纳斯吉拉斯州中部（Ascom/Sisema, 2010），属于上圣弗朗西斯科河流域。该水库没有常年流入的河流或溪流，主要由地下水补给和降雨形成，其水位通过大坝管理人为调节以用于发电。因此，IL是一个准封闭系统，鱼类群落相对稳定，主要受人为引入和局部灭绝的影响。如果我们假设鱼类群落是稳定的，就可以测试水位（例如低水位与高水位）对eDNA宏条形码检测鱼类物种灵敏度的影响。该水库的蓄水量约为1600万立方米，表面积为2.27平方公里。除了发电外，其水在缺水时期也可用于城市供水。例如，在2020年10月至2021年4月期间发生的严重干旱期间（被认为是贝洛奥里藏特大都会地区111年来最严重的干旱），从IL释放水以增加Velhas河的流量，导致湖泊水位降至历史最低记录（Cruz, 2021a）。

样品采集、过滤和提取
在水库的两个水文时期采集了水样：高水位（约18米；16个样本）和低水位（<12米；24个样本）。这些分别称为高水位和低水位。2020年至2022年间共在四个岸线站点（P1–P4，表1；图1A）进行了五次采样。2020年11月（高水位）时，采样仅限于P1和P2站点；从2021年10月开始（低水位），增加了P3和P4两个站点。最后一次采样（2022年1月）是在水库水位恢复后进行的。

表1 通过eDNA宏条形码检测到的分类单元
图1
Ingleses湖的地图以及通过DNA宏条形码检测到的分类单元的维恩图。A. Ingleses湖在巴西的位置，米纳斯吉拉斯州以灰色突出显示，以及其在上圣弗朗西斯科河流域（Nova Lima地区—左下）的水文网络中的位置。右侧面板显示了湖泊中的采样站点（P1–P4）。B. 维恩图显示了通过eDNA宏条形码在各个采样站点检测到的分类单元分布，数字表示每个采样站点检测到的分类单元数量；C. 维恩图比较了低水位和高水位期间检测到的分类单元。

在每个站点采集了三个重复样本。使用Mendes等人（2024）描述的协议，用消毒过的瓶子、一次性试剂盒和手套采集水样。样品在冰上保存直至过滤。过滤在干净的实验室中使用EZ-fit Manifold（Merck Millipore）和混合纤维素酯（MCE）膜过滤器（直径47毫米，孔径0.45微米；Merck Millipore）进行，过滤器安装在连接到EZ-stream电动泵（Merck Millipore）的塑料漏斗上。为了监测潜在污染，每组重复样本都过滤了一组矿泉水作为阴性对照。过滤器储存在含有白色硅胶（2–4毫米颗粒度）的15毫升Falcon管中，并在-20°C下保存直至提取。

所有仪器都经过严格灭菌：镊子浸泡在2.5%漂白剂中10分钟，然后用蒸馏水冲洗，喷洒70%乙醇并灼烧。工作台、电动泵和歧管系统使用针对残留核酸和蛋白质的清洁剂（Cleaner, LGC Biotecnologia）进行消毒。过滤后，使用DNeasy PowerWater Kit（Qiagen）根据Mendes等人（2024）的改编协议从MCE过滤器中提取DNA。简要来说，PW1裂解缓冲液预加热至60°C以增强DNA的回收。在机械裂解之前，过滤器被破碎并浸泡在加热的缓冲液中。后续的纯化步骤遵循制造商的指南，DNA在100微升的EB缓冲液中洗脱。每个地点的每次采样都分别进行提取，并在操作之间对设备和表面进行彻底的去污。为了监测潜在的污染，每批六个样本中处理一个空白提取样本。所有提取都在一个与主实验室物理分离的洁净室内进行，专门用于eDNA的工作流程，包括一个前室和一个提取室。在所有操作过程中，工作人员都穿着一次性实验外套、手套和口罩以最小化污染风险。

**eDNA扩增和测序**
扩增使用针对线粒体12S rRNA基因的MiFish引物进行（MiFish-U-F：5’-GCCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；MiFish-U-R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’）（Miya等人，2015年）。为了实现多重扩增，引物被合成成具有独特5’索引序列的不同版本。对于每次采样事件（每个样本的三个重复样本合并为一个），使用一组独特的索引引物组合。PCR反应每个过滤器进行三次，最终体积为20微升，包含6.84微升蒸馏水、10微升2×Amplitaq Gold 360 Master Mix（Applied Biosystems）、0.16微升BSA（0.1微克/微升）、每种引物0.5微升（10纳摩尔）和2微升模板eDNA。热循环程序包括：初始变性95°C 10分钟；40个循环，每个循环95°C 30秒、61°C 45秒和72°C 30秒；然后是72°C 7分钟的最终延伸。反应后保持在10°C。每个PCR运行中都包含一个阴性对照，用分子级水代替eDNA以监测污染。所有生物样本和过滤对照都进行了三次重复实验。

**生物信息学和数据分析**
原始测序数据使用自定义管道处理（Hilário等人，2023年），该管道在R语言（v4.1.0）中实现（R Core Team，2024年）。首先，使用Cutadapt（Martin，2011年）对序列进行解复用和引物修剪。由于2020年11月采样的P1样本中解复用失败，这些样本的读取数据被合并到重复样本中以进行后续分析。随后的质量控制和扩增子序列变异（ASV）推断使用DADA2包（Callahan等人，2016年）进行。工作流程从过滤和修剪配对末端读取开始（filterAndTrim函数），允许前向和反向读取的最大预期误差（maxEE）为30，丢弃长度小于30 bp的序列（minLen = 30），并过滤掉PhiX（rm.phix = TRUE）和未配对的读取（matchIDs = TRUE）。质量控制后，使用learnErrors对序列错误率进行建模，然后进行去重复（derepFastq）和样本推断（dada）。配对末端读取随后以至少10 bp的重叠进行合并，并允许最大1个错配（minOverlap = 10，maxMismatch = 1）。最后，应用de novo chimaera检测（removeBimeraDenovo）生成最终的ASV丰度表（表S1）。本研究生成的原始测序数据可在Zenodo仓库中获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.18894880。此外，此工作流程中使用的所有自定义脚本都可在https://github.com/gbrl-mendes/LI_paper公开获取。

**分类学分配**
ASV的分类学分配使用BLASTr包（Hilário，2022年）进行，该包在R环境中自动化执行BLASTn 2.12.0+搜索（Altschul等人，1990年）。所有ASV都针对完整的NCBI核苷酸数据库（Sayers等人，2022年）进行查询，该数据库在2023年12月进行了更新，并补充了LGC 12Sdb数据库（Hilário等人，2023年），其中包含来自圣弗朗西斯科河流域70个物种的12S参考序列，共有134条序列。对于每个ASV，使用Pseudoscore（Ps）指标评估前三个最佳匹配结果，该指标结合了序列身份和查询覆盖率：
$$Pseudo\,\,score = \frac{{Identity\,\,value \times Coverage\,\,value}}{{100}}$$
然后使用NCBI taxIDs获取每个最佳匹配ASV的分类学等级。根据Ps值自动定义最可靠的分类学等级：如果Ps等于或大于98%，则ASV被分配到物种级别；如果Ps值等于或大于95%且小于98%，则分配到属级别；如果Ps值等于或大于90%且小于95%，则分配到科级别。对于Ps值小于90%且大于或等于80%的ASV，被分配到目级别。Ps值低于80%且未被分配到辐鳍鱼类的ASV被丢弃。

分类学分配后，我们应用了一个长度过滤步骤，仅保留长度在185到200 bp之间的ASV。选择这个特定范围是基于我们文库的片段分布，因为超出这个范围的序列主要与非目标分类单元相关（例如原核生物）或导致低置信度的分类。因此，超出这个范围的序列以及未分配的序列被排除。此外，从过滤、提取或PCR阴性对照中检测到的ASV也从相应的样本中移除，以最小化交叉污染。这些被排除序列的详细列表见表S3。

**综合整理**
初步过滤后，所有ASV由当地鱼类专家进行了审查。ASV使用MUSCLE（Edgar，2004年）和默认设置进行比对，并在MEGA 12中使用100次自助法生成最大似然系统发育树（Kumar等人，2024年）。使用DECIPHER包（Wright，2016年）中的DistanceMatrix函数计算序列之间的平均遗传距离，并在邻接树中可视化，以支持分子分类学的整理（图S1）。综合评估考虑了前三个BLASTn匹配结果和Pseudoscore、系统发育位置、圣弗朗西斯科河流域（SFRB）的生物地理记录以及相对读取丰度（RRA）。整理调整遵循三种主要方法：（i）合并——当遗传距离较低且只有一个候选者在SFRB中有确认的生物地理记录时，将分配给密切相关的物种合并为一个操作分类单元（例如Coptodon rendalli（Boulenger，1897）、Hoplias sp.、Oreochromis niloticus（Linnaeus，1758）、Pimelodus sp.）；（ii）分类学升级——当约170 bp的12S rRNA片段缺乏足够的分辨率来区分同属物种，或者最近的分类学修订使物种级别的分配变得不确定时，将鉴定提升到属级别（例如Psalidodon sp.、Leporinus sp.、Megaleporinus sp.）；（iii）保留——由高Pseudoscore、单系聚类以及在圣弗朗西斯科河流域确认存在的鉴定保持不变（例如Moenkhausia costae（Steindachner，1907）、Astyanax lacustris（Lütken，1875）、Serrasalmus brandtii Lütken，1875）。与生物地理上不合理的鉴定或非目标分类单元匹配的读取被排除在后续分析之外。个别整理决策的完整文档见表S2。所有被排除鉴定的综合总结——包括技术过滤和分类学整理的移除——详见表S3，而用于后续分析的最终保留数据集见表S4。

**生态分析**
生态分析在R v4.1.0中使用tidyverse包（Wickham等人，2019年）进行数据操作，并使用ggplot2（Wickham，2016年）进行可视化。根据最近的基准测试，确定稀疏化是控制扩增子研究中测序努力不均匀性的最稳健方法（Schloss，2024年），通过迭代稀疏化子采样到最低采样量（31,753个读取）来实现数据标准化。具体来说，使用vegan包中的“rrarefy”函数计算了100次随机稀疏化迭代的平均丰富度指数（ɑ-多样性）。同样，使用vegan中的“avgdist”函数在1,000次随机稀疏化迭代上计算Jaccard差异指数来估计β-多样性。然后使用“cmdscale”函数对结果共识距离矩阵进行主坐标分析（PCoA），以可视化群落组成模式。使用“adonis2”通过PERMANOVA测试高水温和低水温和之间的差异，并使用PERMDISP（“betadisper”函数评估多变量分散的均匀性。此外，使用ggpubr包中的compare_means函数通过Wilcoxon检验评估高水温和低水温和之间的丰富度变化。最后，使用vegan的“specaccum”函数构建物种积累曲线以评估采样完整性。

**结果**
高通量eDNA宏条形码测序生成了总共3,295,524个原始读取。经过生物信息学处理、质量过滤和综合整理后，保留了2,831,016个高质量读取（占85.9%）。排除阴性对照后，生物样本平均每个样本产生234,673±203,976个读取。这个数据集对应于273个ASV，归属于15个不同的分类单元，其中5个分类单元属于属级别，10个属于物种级别（图2A；表1）。值得注意的是，被排除的读取包括1885个归属于海洋鱼类Salmo salar的读取，这些读取在低水期在P1和P2站点被检测到。这些序列被排除是因为这种物种在新热带淡水系统中的存在是意料之外的。此外，在过滤阴性PCR对照和排除非目标ASV的大小后，2022年高水期的P1和P2样本中不存在辐鳍鱼类序列，只检测到人类来源的ASV。因此，这个特定活动的结果仅限于P3和P4进行比较分析（表S5）。

**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**基于eDNA宏条形码的鱼类群落分析。**
A. 不同采样站点和水位的分类单元组成。瓷砖图显示了每个检测到的分类单元在各个站点（P1–P4）和水位（高和低）的相对读取丰度（RRA）。（Char = Characiformes，Cich = Cichliformes，Sil = Siluriformes，Cypr = Cyprinodontiformes）。B. 物种积累曲线。所有样本（绿色），高水位水库（蓝色），低水位水库（红色）。垂直条代表95%置信区间。C. 高水位与低水位水库鱼类群落β-多样性组成的主坐标分析（PCoA）。高水位状态的采样站点（P1–P4）用蓝色椭圆圈出，而低水位状态的站点则在红色椭圆内。箭头表示对群落差异有贡献的分类单元。

在多年的eDNA监测中，Characiformes目（4个科和9个物种）和Siluriformes目（2个科和3个物种）显示出最多的鉴定数量。相比之下，Cichliformes目的RRA和ASV数量最多，有1,624,714个读取（约57.38%）归属于94个ASV，而Characiformes目有1,184,931个读取（约41.85%）归属于145个ASV（表1）。

**鱼类ASV在四个采样点的空间分布**
四个采样点中一致检测到五个分类单元：Coptodon rendalli、Hoplias sp.、Oreochromis niloticus、Psalidodon sp. 和 Rhamdia quelen（Quoy & Gaimard，1824）（图1B）。其中，C. rendalli、Hoplias sp.、Psalidodon sp. 和 R. quelen显示出最高的读取丰度（表1）。其他读取丰度较低的分类单元仅在单个采样点被检测到，例如Hemigrammus marginatus Ellis, 1911和Serrasalmus brandtii仅在P2被检测到，Schizodon knerii（Steindachner，1875）和Trichomycterus sp. 仅在P3被检测到，Myleus micans（Lütken，1875）仅在P4被检测到。

在高水期，eDNA宏条形码检测到的ɑ-多样性平均值为每个站点4.5±3.1个分类单元。P2的丰富度最高（九个分类单元），其次是P1（四个），P3（三个），P4（两个）。九个分类单元是单一存在的，每个站点只检测到一个：Astyanax lacustris、Hemigrammus marginatus、Leporinus sp.、Psalidodon sp.、Serrasalmus brandtii、Oreochromis niloticus、Poecilia reticulata Peters, 1859和Rhamdia quelen（图2A）。在这个活动中，C. rendalli在所有站点都被检测到（图2A）。

在低水期，基于eDNA的采样产生的平均物种丰富度为每个站点8±2.1个分类单元。最高丰富度记录在P3（n = 10），其次是P2（n = 9），P4（n = 8），P1（n = 5）。五个分类单元（Hoplias sp.、Psalidodon sp.、C. rendalli、O. niloticus和R. quelen）在所有站点都一致被检测到。只有三个单一存在的分类单元：Moenkhausia costae、Myleus micans和Trichomycterus sp.（图2A）。

比较两个水文时期（图1C），三个分类单元仅出现在低水期（M. micans、Pimelodus sp.、Trichomycterus sp.），三个分类单元仅出现在高水期（H. marginatus、S. knerii、S. brandtii）。在两种条件下，始终检测到九个物种群：A. lacustris、C. rendalli、Hoplias sp.、Leporinus sp.、M. costae、O. niloticus、P. reticulata、Psalidodon sp. 和 R. quelen。在所有调查中，只有五个物种群（C. rendalli、Hoplias sp.、O. niloticus、Psalidodon sp. 和 R. quelen）在每个地点都被检测到（图2A）。特定地点的独有检测结果出现在P2（H. marginatus、S. brandtii）、P3（S. knerii、Trichomycterus sp.）和P4（M. micans），而在P1没有发现独有检测结果（图2A）。结合两个水文时期的采样数据，得到了一个近乎渐近的物种积累曲线，表明两个时期的采样工作提高了物种eDNA的检测效率（图2B）。相比之下，分别仅基于高水位或低水位采样的曲线并未达到饱和状态。基于稀疏化群落矩阵计算的β-多样性距离矩阵的PCoA分析，解释了群落组成总变异的63.92%（轴1：36.03%，轴2：27.90%）。低水位时期的鱼类群落结构更为均匀，占据的多变量空间较小（图2C），β-多样性距离也较低。虽然PERMANOVA分析显示群落组成中心点有边际显著的差异（F = 2.26，R2 = 0.27，P = 0.056），但PERMDISP分析揭示了低水位和高水位时期之间多变量分散度的显著差异（F = 22.23，P = 0.003）。

讨论
我们的研究表明，水文变化可能是影响新热带地区水库中鱼类eDNA可检测性的关键因素。我们观察到，在低水位时期，物种丰富度（α-多样性）和群落同质化（β-多样性）显著高于高水位时期。这些发现支持了这样的假设：水库水量的减少可能有助于eDNA的检测，这可能是由于浓度效应；而高水位条件似乎与更高的随机性和检测变异性相关。尽管eDNA宏条形码分析检测到的物种数量几乎是传统方法的两倍，但物种积累曲线表明，无论水位如何，仅在一个水文时期进行采样都不足以捕捉到全部的本地生物多样性（图2B）。这一结果表明，在水文周期内进行时间重复采样对于最大化新热带人工静水系统的生物多样性清单完整性至关重要。低水位阶段α-多样性的增加和β-多样性的减少表明，水量可能是影响eDNA可检测性的一个驱动因素。然而，我们强调这种水文效应可能与其他未测量的近因因素共同作用，例如干旱条件。例如，热带湖泊的低水位时期通常伴随着水温的升高（Sharip等人，2019年）。对于鱼类而言，温度的升高会加速新陈代谢速率（Killen等人，2010年；Thalinger等人，2021年；Yates等人，2021年）。此外，栖息地的物理收缩迫使鱼类密度增加，可能引发应激反应和更高的活动水平，从而进一步增加eDNA的释放和检测概率（Wilcox等人，2016年）。由于本研究没有连续监测物理和化学变量，我们的结果应被视为对这些相互关联的干旱诱导压力的综合响应，而不仅仅是水量浓缩的直接后果。此外，由于我们的采样设计主要分析了2020年11月之后的低水位站点的数据（增加了两个站点），这可能使得高水位季节检测到的β-多样性偏高。

此外，水位变化影响了IL水库中稀有和底栖鱼类物种的eDNA宏条形码检测结果。例如，在高水位时期，检测结果稀少，且通常仅限于特定地点的单个物种（图2A）。相比之下，低水位条件导致更均匀的分布，多个物种群（Coptodon rendalli、Hoplias sp.、Psalidodon sp.、Rhamdia quelen 和 Oreochromis niloticus）在几乎所有采样地点都被检测到。有趣的是，Siluriformes目中的底栖物种（R. quelen、Pimelodus sp. 和 Trichomycterus sp.）几乎仅在低水位时期被检测到（图2A）。此外，读数最多的物种（>3万次读取）在所有采样地点均未被检测到。在四个采样地点通过eDNA宏条形码检测到的15个鱼类物种群中，只有五个在所有地点都被一致检测到：Coptodon rendalli、Hoplias sp.、Oreochromis niloticus、Psalidodon sp. 和 Rhamdia quelen（图1B）。其他具有高RRA的物种，如M. costae、H. marginatus 和 S. knerii，虽然读数超过3万次，但在高水位和低水位时期都未能被检测到。相比之下，R. quelen是一种中等体型、高度移动的鲶鱼，尽管读数不到2万次，但在所有四个采样地点都被检测到，其检测结果可以归因于其移动性。其他在大多数采样地点未被检测到的高eDNA读数物种主要是小型鱼类，这些鱼类可能在局部范围内分布。

在低水位和高水位之间未检测到鱼类群落的显著差异，表明季节间维持了一个稳定的核心群落。这一结果在意料之中，因为IL水库位于流域的最上游部分，作为一个准封闭系统运作。因此，鱼类群落不受支流或上游河流的影响，因为IL水库主要由地下水输入和直接降雨补给，其水位通过大坝管理人工调节以用于水力发电。低水位对检测灵敏度的影响进一步体现在海洋物种Salmo salar的意外出现上。这种海洋物种在低水位时期的检测可能源于食物废物或污水输入。历史记录显示Ingleses湖曾发生过粪便大肠菌群污染事件（Carvalho，2008年；Vidigal，2008年），表明存在持续的人为输入。其他eDNA调查中也报告了类似的海洋或非本地物种的假阳性结果（Fujii等人，2019年）。Salmo salar仅在低水位条件下被检测到，这加强了低水位环境会增加eDNA浓度和可检测性的假设。重要的是要强调，eDNA宏条形码分析可能会检测到假阳性结果，从而影响物种监测结果，这一局限性需要谨慎考虑。更好地理解eDNA生态学和静水环境中的同质化有助于设计采样策略。例如，我们的结果表明，即使对于像IL水库这样物种丰富度较低的小型水库，也需要至少从4个采样地点各取6个样本（每个500毫升）才能检测到稀有物种。事实上，Sellers等人（2024年）使用eDNA宏条形码在英国的101个湖泊中测试了鱼类物种检测概率和采样工作量的影响，结果显示，在几乎90%的湖泊中，仅用10个水样就能检测到95%的完整鱼类种类，无论湖泊面积大小如何。

我们基于eDNA的清单与2021年进行的传统监测调查（SEMAD，2021年）检测到了相似的物种和鱼类丰度。例如，eDNA读数较多的物种，如Coptodon rendalli、Oreochromis niloticus 和 Hoplias sp.，也是传统调查中报告的生物量较高的物种。尽管eDNA宏条形码的某些技术方面可能会影响RRA分析和与生物量的相关性（例如PCR过程中的引物不匹配和物种间eDNA释放率的差异），但Di Muri等人（2020年）报告称，鱼类物种的读数与生物量和丰度显著相关。尽管有这些有希望的相关性，但从eDNA数据中准确推导出生物量或丰度的绝对估计仍然是一个主要挑战（Yates等人，2021年）。所有生态和环境因素——包括物种特定的释放率、体型、代谢状态、水温、降解过程和传输动态——都会引入显著的噪声，可能掩盖鱼类总数与检测到的eDNA之间的直接关系。此外，在使用eDNA宏条形码监测新热带水库中的鱼类生物多样性变化时，还必须考虑水位对eDNA浓度和分布的影响。

结论
IL水库的环境DNA（eDNA）宏条形码调查显示，低水位与鱼类物种的检测效率提高相关。我们观察到低水位条件导致α-多样性增加和β-多样性降低，表明群落更加均匀且可检测性更高。此外，物种积累曲线显示，分别考虑高水位和低水位时期的采样工作并未达到饱和，但结合两个水文时期的数据得到了一个近乎渐近的曲线，这强调了在动态水文周期内进行时间重复采样对于最大化这些系统中eDNA检测效率的重要性。这些模式支持了我们的假设，即eDNA的可检测性显著受到水文变化的影响。然而，这些变化并非仅由水量减少和eDNA浓度驱动，而是由多种未测量的干旱诱导因素共同作用的结果，如水温升高、栖息地收缩和鱼类密度增加等，这些因素需要进一步研究。此外，低水位条件促进了多个物种的更广泛分布，使得五个物种在所有采样地点都能被一致检测到。虽然水位是新热带水库中eDNA监测设计的关键因素，但未来的研究必须整合物理和化学变量，以全面揭示驱动检测变异性的机制。