一种多效性的“伸展”表型与玉米的木质部导管元素长度、轴向水力传导性、根系伸长、水分利用能力以及干旱适应能力相关

《Crop Science》：A pleiotropic “stretch” phenotype is associated with metaxylem vessel element length, axial hydraulic conductance, root elongation, water utilization, and drought adaptation in maize

　　**摘要**

我们通过计算机建模和在受控环境及田间进行的水分亏缺实验，测试了木质部外壁（metaxylem）表型影响玉米（Zea mays L.）干旱适应性的假设。观察到木质部外壁导管元素长度（MVEL）存在显著的基因型变异。计算机模拟结果显示，较长的MVEL与较低的木质部穿孔板高度、较长的导管长度以及较高的轴向水力传导性相关，这一结果也得到了根段原位测量的支持。全基因组关联研究发现了两个与MVEL和穿孔板高度显著相关的单核苷酸多态性（SNP）。在mesocosms实验中，较长的MVEL与更长的根伸长、更深的根系以及更有效地利用深层水分相关。在田间干旱胁迫下，MVEL与叶片卷曲、叶片温度降低、蒸腾作用增强、光合作用提高以及籽粒产量增加有关。我们得出结论，玉米中MVEL的变异影响轴向水力传导性，并且是多效性“伸展表型”（stretch phenotype）的一部分，这种表型通过增加根伸长和加深根系来提高对水分亏缺的适应性。

**通俗语言总结**

干旱是作物生产的主要限制因素，预计由于气候变化这一情况会进一步恶化。因此，理解和管理作物的耐旱性是全球农业的紧迫任务。我们测试了木质部特征是否影响玉米的耐旱性的假设。我们观察到木质部导管元素长度存在显著的遗传变异。较长的木质部导管元素与较短的细胞间屏障、较长的导管长度相关，从而导致更大的水流。我们确定了与MVEL和屏障高度相关的遗传区域。在温室实验中，较长的木质部导管元素与更快的根生长和更深的根系相关。在田间干旱条件下，MVEL与叶片卷曲、叶片温度降低、蒸腾作用增强、光合作用提高以及籽粒产量增加有关。我们得出结论，玉米中MVEL的变异影响轴向水力传导性，并且是多效性“伸展表型”的一部分，这种表型通过增加根伸长和加深根系来提高对水分亏缺的适应性。

**1 引言**

植物通过多种机制调节从根部到叶片的水分运输，包括气孔控制（Hetherington & Woodward, 2003; Raven, 2014）、水力结构（Sperry et al., 2008）以及解剖结构的形态变异（Fan et al., 2009; Loepfe et al., 2007; Tyree et al., 1994）。轴向水分传导的效率主要取决于木质部导管的结构特征。因此，木质部导管的形态和功能与植物对水分可用性的适应能力密切相关（Carlquist, 2012; Jansen et al., 2004）。尽管木质部形态对水分利用策略的重要性显而易见，但大多数相关研究集中在多年生双子叶植物上，而关于一年生单子叶植物木质部结构和功能的研究较少（Aleman-Sancheschulz et al., 2020; Carlquist, 2012）。虽然木质部中的水分运输原理适用于所有维管植物，但不同植物类群之间木质部形态与水分利用策略之间的关系存在显著差异。与双子叶植物不同，单子叶植物缺乏次生生长和季节性的导管发育，而多年生植物在水分获取和利用方面面临不同的挑战和机会（Strock & Lynch, 2020）。关于一年生单子叶植物木质部形态的种内变异的研究尚不足，但这对于理解许多重要农作物的水力传导能力至关重要（Comas et al., 2013; Hacke et al., 2017）。成熟的、空心的木质部导管元素是水分蒸腾的主要通道，这些导管通过节间和导管网络时的路径不会被活细胞阻断（Shane et al., 2000）。因此，木质部轴向流动的水力阻力主要取决于导管元素的内径，这可以通过Hagen–Poiseuille方程来近似计算。然而，这种基于导管直径计算的水力阻力指标没有考虑穿孔板和导管末端的结构和数量，这些因素可能会影响水分在木质部导管中的轴向传输、水分亏缺条件下的空化脆弱性（WS），以及栓塞修复的动态（Hacke & Sperry, 2001）。在像玉米（Zea mays）这样的一年生单子叶植物中，成熟的木质部导管元素由简单的穿孔板界定（即具有一个大的开口；图1；Carlquist, 2012）。这些穿孔板在木质部停止伸长时形成，木质化的次生细胞壁沉积在细胞的侧壁上。成熟后，导管元素之间的共同初生壁和中间层被水解，留下由木质化边缘组成的简单穿孔板（Wang et al., 1994）。这些简单穿孔板中的木质化边缘为原本平滑的、朝向导管的壁增加了异质性（McCully et al., 2014）。图1展示了玉米（Zea mays L.）根部的纵向切片和横截面，显示了木质部导管内的穿孔板。不同类群中这些穿孔板的结构被认为与不同环境下的适应功能有关，因为穿孔板特征的差异被认为是在传导效率、机械强度和抗空化能力之间达到最佳平衡的结果。例如，穿孔板的形态已被证明会改变木质部导管直径与植物高度之间的关系（Medeiros et al., 2019）。还注意到穿孔板结构与气候之间的关系，具有简单穿孔板的类群通常来自温暖干燥的气候，这些气候下对水力效率的需求更高（Christman & Sperry, 2010; Jansen et al., 2004）。一些研究表明，简单穿孔板对轴向传输的阻力很小或没有额外阻力（Christman & Sperry, 2010; Ellerby & Ennos, 1998; Sperry et al., 2006; Zwieniecki et al., 2001）。然而，在其他研究中，Hagen–Poiseuille方程计算的水力阻力远低于原位测量的轴向传导性，这表明穿孔板或导管末端对轴向传导性有显著影响（Sperry et al., 2005）。例如，Y. Gao等人（2020）发现，使用Hagen–Poiseuille方程计算的棉花木质部导管的水力传导性估计值高出了200%以上，主要是因为该方程无法准确反映穿孔板的影响。最终，与穿孔板相关的水力阻力取决于其结构以及沿导管长度排列的穿孔板之间的距离，或者导管元素的长度（MVEL）（图1），以及导管末端的频率（Sperry et al., 2005）。在这项工作中，我们的目标是探索玉米这种一年生单子叶植物和主要全球作物中穿孔板结构的种内变异程度，并评估这种变异如何影响干旱胁迫下的水分运输和利用。具体来说，我们测试了以下假设：（1）简单穿孔板对水分传输有显著影响；（2）玉米中这些特征存在种内变异；（3）这种变异影响干旱胁迫下的水分利用策略。为了验证这些假设，我们使用了计算机建模以及在受控环境中的玉米实验和多项田间研究。

**2 材料与方法**

**2.1 种质资源选择**

我们使用了多种近交系、杂交种和不同来源的材料来评估玉米穿孔板结构的遗传变异。这项研究的核心目标不是评估特定遗传背景下的MVEL，而是通过包含这些不同的种质资源来评估玉米广泛遗传谱系中的表型变异程度（表1）。在大部分工作中，我们使用了来自B73 × Mo17（IBM）杂交群体的玉米重组近交系（RILs）。RILs来自相同的两个亲本，因此代表具有相同遗传背景的不同基因型，从而减少了遗传相互作用、上位性和多效性造成的混淆风险（Zhu et al., 2005, 2006）。当表型的遗传基础复杂或未知时，RILs是非常有用的工具，例如玉米中穿孔板的突出性和MVEL的情况，这排除了使用单基因变异体的可能性。我们还评估了威斯康星多样性小组（WiDiv）中穿孔板结构的表型多样性，该小组由多种近交系组成，这些近交系在美国中西部表现出一致的活力并在生理上达到籽粒成熟。除了近交系外，还包括16种现代杂交基因型（8种耐旱和8种不耐旱），以评估在商业相关遗传背景下是否保留了在近交系中观察到的模式。所有温室和田间实验中使用的种子由威斯康星大学麦迪逊分校的Shawn M. Kaeppler博士提供。

**2.2 解剖测量**

为了观察根和叶片的内部结构，我们按照Strock等人（2019, 2022）的方法对样本进行了保存、切片和激光消融断层扫描（LAT）。分析的根和地下根的尺寸包括横截面和纵向图像。分析叶片的尺寸包括叶片叶片和叶脉的横截面和纵向图像，位置大约在叶脉长度的中间，距离叶脉2厘米处。对于纵向切片，样本的方向使得导管的轴向尺寸与激光的消融平面平行。

**2.3 冷冻扫描电子显微镜**

冷冻扫描电子显微镜（SEM）用于更仔细地观察穿孔板。这项工作使用宾夕法尼亚州立大学Huck生命科学研究所的Zeiss Sigma VP-FESEM完成。在种植后37天（DAP），收集了距离植株基部10–14厘米的第四节根部的样本，并将其保存在75%（v/v）乙醇水中。样本被安装在样品架上并浸入液氮中。然后在真空条件下将样品架抽出到冷冻制备室中，样品在-195°C下保持。随后将样品转移到SEM室的冷台模块上。使用可变压力且不进行溅射镀膜的工艺进行观察。电压为10千伏，样品在-195°C的温度下进行成像。

2.4 玉米穿孔板变异特征分析

为了初步了解玉米穿孔板结构的特点，2011年2月至5月期间，在南非林波波省的Ukulima根生物学中心（URBC）种植了来自IBM群体的234个重组自交系（RILs），坐标为南纬24.533367°，东经28.123783°。在开花期，按照Trachsel等人（2011年）的方法提取了每个基因型两个代表性植株的根冠并进行了清洗，然后分析了每株植物第四节根节点处一段根的解剖结构。根段被切割后使用上述LAT技术进行成像。使用ImageJ软件（Schneider等人，2012年）测量了每个根段中15个代表性木质部导管元素的长度。从这234个IBM RILs中，选出了4个具有独特MVEL特征的样本，用于后续的 controlled environment 和田间研究（见图2）。这4个IBM样本包括IBM015和IBM111，它们的根具有不明显的（短的）穿孔板和较长的MVEL；而IBM177和IBM205的根具有明显的（高的）穿孔板和较短的MVEL。

2.5 计算流体动力学模型

为了直接理解穿孔板结构的变异如何影响木质部的轴向运输，基于IBM群体中观察到的导管元素和穿孔板尺寸数据，在SolidWorks（三维CAD [计算机辅助设计] 和CAE [计算机辅助工程] 软件，https://www.solidworks.com）中生成了一个木质部导管元素的三维模型。所有模型的导管长度参数设为3.0毫米，导管直径参数设为0.095毫米，这是IBM群体中观察到的中位导管直径。穿孔板之间的距离参数设为1.00毫米或0.5毫米，分别反映了具有长或短MVEL的IBM基因型的平均范围。穿孔板的高度参数被设定为限制木质部腔室的80%（直径0.095毫米的导管中板高0.005毫米）或10%（直径0.095毫米的导管中板高0.033毫米），这与IBM群体中的样本观察结果一致。穿孔板与腔室壁的角度设为垂直（90°），所有模型中穿孔板的宽度参数设为8微米。每个模型的流动阻力是通过模型进出口之间的压力差来确定的，以保持2.088×10^-11立方米每秒的流速。模拟使用了配备高性能计算系统的PowerCube-S01。

2.6 定量性状定位

为了研究穿孔板结构变异的潜在遗传控制机制，进行了定量性状位点（QTL）分析和全基因组关联研究（GWAS）。由于伸展表型的组成部分可能是多基因的，我们使用了两个不同的群体来捕获更广泛的位点。GWAS在WiDiv面板中进行，以提供更高的分辨率和更窄的候选基因识别窗口；而RIL群体中的QTL定位虽然区间较大，但置信度更高，并且能够开发出用于未来精细定位的近等基因系。穿孔板高度和MVEL的QTL定位使用了在上述URBC种植的IBM群体（B73 × Mo17）样本。用于这项工作的IBM群体中有141个基因型，我们拥有这些基因型的表型数据和1106个单核苷酸多态性（SNP）标记的基因型数据。使用复合区间定位方法，结合五个标记协变量和10厘摩（cM）的窗口大小进行了QTL定位（R/qtl，Broman等人，2003年）。通过对1000次排列的结果进行对数转换，确定了显著性阈值0.05。Haley–Knott回归方法被用来精细化显著QTL的正效应。标记的数量、长度以及遗传图谱的平均和最大间距已在先前的研究中发表（Burton等人，2014年）。标记的物理位置基于版本4的B73（AGPv4）参考序列组装（Jiao等人，2017年）。关于IBM群体和遗传图谱的更多细节可以在Burton等人（2014年）的论文中找到。

2.7 全基因组关联映射

使用LAT技术在威斯康星多样性面板（Wisconsin Diversity Panel）的469个基因型中分析了穿孔板高度和MVEL。这些植物于2016年在亚利桑那州威尔科克斯（Wilcox）的Apache根生物学中心（Apache Root Biology Center）种植（北纬32.032079°，西经109.691171°），并在开花期收集了第四节根的样本进行解剖分析。进一步分析使用了穿孔板高度和MVEL的重复测量平均值。为了选择最适合穿孔板表型和MVEL的GWAS方法，我们可视化了由一般线性模型、混合线性模型、压缩混合线性模型、固定和随机模型循环概率统一（FarmCPU）以及BLINK生成的分位数-分位数（QQ）图。BLINK（贝叶斯信息与连锁不平衡迭代嵌套关键方法；Huang等人，2019年）因其QQ图在大部分p值范围内与预期零分布最为吻合而被选中，只有在极端尾部才偏离1:1线，这与真实关联一致。此外，BLINK和FarmCPU模型的结果相当。因此，使用R包中的GAPIT实现了穿孔板高度和MVEL的BLINK方法。基于全基因组校正的Bonferroni阈值?log(p) = 7，识别了显著的SNPs。计算Bonferroni阈值时使用了α水平0.05和所有432,902个标记。在这些参数下，Bonferroni校正后的显著性阈值对应于log10(p) = –6.94。数据分析使用R软件和Bioconductor（Gentleman等人，2004年）完成。MapMan（Usadel等人，2009年）和MaizeGDB（Lawrence，2005年）被用来注释基因。为了识别潜在的候选基因，我们检查了所有位于显著SNPs ± 5000 bp范围内的注释基因，并根据B73 AGPv4参考基因组的物理坐标将这些位置转换为基因模型。

2.7 全基因组关联映射

在威斯康星多样性面板的469个基因型中，使用LAT技术分析了穿孔板高度和MVEL。这些植物于2016年在亚利桑那州威尔科克斯的Apache根生物学中心种植（北纬32.032079°，西经109.691171°），并在开花期收集了第四节根的样本进行解剖分析。为了选择最适合穿孔板表型和MVEL的GWAS方法，我们可视化了由一般线性模型、混合线性模型、压缩混合线性模型、固定和随机模型循环概率统一（FarmCPU）以及BLINK生成的QQ图。BLINK方法因其QQ图在大部分p值范围内与预期零分布最为吻合而被选中，仅在极端尾部偏离1:1线，这与真实关联一致。此外，BLINK和FarmCPU模型的结果相当。因此，使用R包中的GAPIT实现了穿孔板高度和MVEL的BLINK方法。基于全基因组校正的Bonferroni阈值?log(p) = 7，识别了显著的SNPs。为了计算Bonferroni阈值，我们使用了α水平0.05和所有432,902个标记。在这些参数下，Bonferroni校正后的显著性阈值对应于log10(p) = –6.94。数据分析使用R软件和Bioconductor（Gentleman等人，2004年）完成。MapMan（Usadel等人，2009年）和MaizeGDB（Lawrence，2005年）被用来注释基因。为了识别潜在的候选基因，我们检查了所有位于显著SNPs ± 5000 bp范围内的注释基因，并根据B73 AGPv4参考基因组的物理坐标将这些位置转换为基因模型。

2.8 根系伸长率研究

为了确定观察到的细胞长度差异与根系伸长率之间是否存在关系，将具有不同MVEL表型的IBM基因型（IBM111和IBM177）的种子在生长箱中发芽48小时，然后移至生长灯下。每个基因型种植了四个重复样本。为了测定伸长率，每天对每个幼苗的主根进行成像，持续5天。使用ImageJ（Schneider等人，2012年）测量了5天内的根长变化。

2.9 控制环境研究

为了仔细追踪MVEL变异与玉米水分利用策略之间的关系，进行了一项控制环境研究。这项研究在宾夕法尼亚州立大学位于University Park的温室中进行（北纬40.801955°，西经77.862544°）。2021年4月至6月期间，在16/8小时（光照/黑暗）的光周期、40%的相对湿度和28°C/26°C的最高/最低温度条件下，种植了来自IBM群体的四个具有不同MVEL表型的RILs。中午的光合有效辐射为900–1000微摩尔光子每平方米每秒。从早上6:00到晚上10:00，使用金属卤化物灯补充了大约500微摩尔光子每平方米每秒的自然光。种子在25%（体积比）的NaOCl水中表面消毒2分钟，然后用去离子水冲洗，并在28°C的黑暗条件下在0.5 mM CaSO4中发芽72小时。均匀的幼苗被移植到直径15厘米、高155厘米的不透明中型生态系统中，这些系统内部衬有透明6毫米高密度聚乙烯薄膜，以便于根系采样。生态系统中填充了4%（重量比）的粗级A珍珠岩（Whittemore）、50%（重量比）的中等级沙子（US Silica）、26%（重量比）的D3粗级A蛭石（Whittemore）和20%（重量比）的田间土壤（Ap2 Hagerstown粉壤土[细粒，混合，半活性，湿润型Hapludalf]的混合物，通过6毫米筛网筛选。土壤的组成旨在模拟田间条件，如有机物的存在、土壤生物群落和有助于缓冲养分可利用性的氧化层表面。生态系统中添加了5克每千克的Osmocote（15-9-12；5-6个月）肥料（The Scotts Co.），在混合时加入介质中。实验采用了随机完全区组设计，设置了两种灌溉水平：WS（正常灌溉）和WW（充分灌溉）。灌溉通过滴灌环进行，每天将盆栽植物浇至田间持水量。在17天生长天数（DAP）时，停止了对WS处理组的灌溉。实验总共进行了42天，在17天、31天和42天生长天数时对所有基因型的所有处理组进行了破坏性测量。每个基因型在每个时间点都有四个生物学重复样本。为了确定WS处理组盆栽植物的净水分损失，从17天到42天生长天数，每小时使用Adam CPWplus 75台秤称量了每个表型组的五个盆栽植物。在31天和42天生长天数时，还测量了土壤从表面到容器底部20厘米深度的重量。在41天生长天数下午4:00收集了五个2.5厘米的叶片圆盘，用于测定叶片相对含水量和特定叶片面积。

2.8 根系伸长率研究

为了确定观察到的细胞长度差异与根系伸长率之间是否存在关系，将具有不同MVEL表型的IBM基因型（IBM111和IBM177）的种子在生长箱中发芽48小时，然后移至生长灯下。每个基因型种植了四个重复样本。为了测定伸长率，每天对每个幼苗的主根进行成像，持续5天。使用ImageJ（Schneider等人，2012年）测量了5天内的根长变化。

2.9 控制环境研究

为了仔细研究MVEL变异与玉米水分利用策略之间的关系，在宾夕法尼亚州立大学位于University Park的温室中进行了一项控制环境研究（北纬40.801955°，西经77.862544°）。2021年4月至6月期间，在16/8小时（光照/黑暗）的光周期、40%的相对湿度和28°C/26°C的最高/最低温度条件下，种植了来自IBM群体的四个具有不同MVEL表型的RILs。中午的光合有效辐射为900–1000微摩尔光子每平方米每秒。从早上6:00到晚上10:00，使用金属卤化物灯补充了大约500微摩尔光子每平方米每秒的自然光。种子在25%（体积比）的NaOCl水中表面消毒2分钟，然后用去离子水冲洗，并在28°C的黑暗条件下在0.5 mM CaSO4中发芽72小时。均匀的幼苗被移植到直径15厘米、高155厘米的不透明中型生态系统中，这些系统内部衬有透明6毫米高密度聚乙烯薄膜，以便于根系采样。生态系统中填充了4%（重量比）的粗级A珍珠岩（Whittemore）、50%（重量比）的中等级沙子（US Silica）、26%（重量比）的D3粗级A蛭石（Whittemore）和20%（重量比）的田间土壤（Ap2 Hagerstown粉壤土[细粒，混合，半活性，湿润型Hapludalf]的混合物，通过6毫米筛网筛选。土壤的组成旨在模拟田间条件，如有机物的存在、土壤生物群落和有助于缓冲养分可利用性的氧化层表面。生态系统中添加了5克每千克的Osmocote（15-9-12；5-6个月）肥料（The Scotts Co.），在混合时加入介质中。随机完全区组设计使用了两种灌溉水平：WS（正常灌溉）和WW（充分灌溉）。灌溉通过滴灌环进行，每天将盆栽植物浇至田间持水量。在17天生长天数时，停止了对WS处理组的灌溉。实验总共进行了42天，在17天、31天和42天生长天数时对所有基因型的所有处理组进行了破坏性测量。每个基因型在每个时间点都有四个生物学重复样本。为了确定WS处理组盆栽植物的净水分损失，从17天到42天生长天数，每小时使用Adam CPWplus 75台秤称量了每个表型组的五个盆栽植物。在31天和42天生长天数时，还测量了土壤从表面到容器底部20厘米深度的重量。在41天生长天数下午4:00收集了五个2.5厘米的叶片圆盘，用于测定叶片相对含水量和特定叶片面积。

2.8 根系伸长率研究

为了确定观察到的细胞长度差异与根系伸长率之间是否存在关系，将具有不同MVEL表型的IBM基因型（IBM111和IBM177）的种子在生长箱中发芽48小时，然后移至生长灯下。每个基因型种植了四个重复样本。为了测定伸长率，每天对每个幼苗的主根进行成像，持续5天。使用ImageJ（Schneider等人，2012年）测量了5天内的根长变化。

2.9 控制环境研究

为了仔细研究MVEL变异与玉米水分利用策略之间的关系，在宾夕法尼亚州立大学位于University Park的温室中进行了一项控制环境研究（北纬40.801955°，西经77.862544°）。2021年4月至6月期间，在16/8小时（光照/黑暗）的光周期、40%的相对湿度和28°C/26°C的最高/最低温度条件下，种植了来自IBM群体的四个具有不同MVEL表型的RILs。中午的光合有效辐射为900–1000微摩尔光子每平方米每秒。从早上6:00到晚上10:00，使用金属卤化物灯补充了大约500微摩尔光子每平方米每秒的自然光。种子在25%（体积比）的NaOCl水中表面消毒2分钟，然后用去离子水冲洗，并在28°C的黑暗条件下在0.5 mM CaSO4中发芽72小时。均匀的幼苗被移植到直径15厘米、高155厘米的不透明中型生态系统中，这些系统内部衬有透明6毫米高密度聚乙烯薄膜，以便于根系采样。生态系统中填充了4%（重量比）的粗级A珍珠岩（Whittemore）、50%（重量比）的中等级沙子（US Silica）、26%（重量比）的D3粗级A蛭石（Whittemore）和20%（重量比）的田间土壤（Ap2 Hagerstown粉壤土[细粒，混合，半活性，湿润型Hapludalf]的混合物，通过6毫米筛网筛选。土壤的组成旨在模拟田间条件，如有机物的存在、土壤生物群落和有助于缓冲养分可利用性的氧化层表面。生态系统中添加了5克每千克的Osmocote（15-9-12；5-6个月）肥料（The Scotts Co.），在混合时加入介质中。随机完全区组设计使用了两种灌溉水平：WS（正常灌溉）和WW（充分灌溉）。灌溉通过滴灌环进行，每天将盆栽植物浇至田间持水量。在17天生长天数时，停止了对WS处理组的灌溉。实验总共进行了42天，在17天、31天和42天生长天数时对所有基因型的所有处理组进行了破坏性测量。每个基因型在每个时间点都有四个生物学重复样本。为了确定WS处理组盆栽植物的净水分损失，从17天到42天生长天数，每小时使用Adam CPWplus 75台秤称量了每个表型组的五个盆栽植物。在31天和42天生长天数时，还测量了土壤从表面到容器底部20厘米深度的重量。在41天一种脱气的20 mM KCl溶液，其水压为0.0093 MPa，被连接到根段的一端，然后在1分钟内使用Adventurer Pro AV13C分析天平（Ohaus Corporation）测量从该段另一端流出的流量。在测量了10厘米根段的轴向传导性后，随后从该段的末端切下2.5厘米长的根段，并分别用7.5厘米、5厘米和2.5厘米长的根段重复测量，以确定穿孔板对轴向流量的影响。在这些原位传导性测量之后，去除了蜡涂层，并将根段保存在75%（体积比）的乙醇水中。保存后的根段在纵向和横截面上进行了切片处理（Strock等人，2019年）。在纵向维度上测量了MVEL（木质部导水率），而在横截面上测量了每个根段两端的韧皮部导管的数量和面积。根据修正的Hagen–Poiseuille定律（公式1），从每个横截面图像中的所有木质部导管的总和计算出理论上的轴向韧皮部传导性（kh；单位：kg m MPa?1 s?1），其中d是导管的直径（单位：米），ρ是流体密度（在20°C时水的密度为1000 kg m?3），η是流体的粘度（在20°C时水的粘度为1 × 10?9 MPa s?1；Tyree & Ewers，1991年）。从每个根段末端的图像计算出的平均理论传导性估计值用于与该段的原位测量结果进行比较。

2.10 美国田间试验

为了评估具有不同MVEL值的IBM品系在现实世界条件下的干旱胁迫下的表现，分别于2019年和2020年6月至9月在宾夕法尼亚州Rock Springs的Russell E. Larson农业研究农场（坐标：40.711365° N, 77.953089° W）进行了PA19和PA20田间试验。该地点的土壤为Hagerstown粉壤土（细粒、混合、湿润型Hapludalf）。采用了分割区设计，设置了两种灌溉水平：两个0.02公顷的避雨棚被分成两个0.01公顷的区块，两个0.02公顷的灌溉田也被分成两个0.01公顷的区块。2019年随机分配了16个基因型，2020年随机分配了4个基因型。为了控制真菌病原体，在种植前用Captan 50 W杀菌剂溶液（浓度为0.2 g L?1）以每100粒种子0.5 mL的剂量处理种子。所有田地都根据季节初的土壤测试结果施用了足够的肥料以满足玉米的营养需求。每个基因型种植在一条4.6米长的单行中，行间距为76厘米，种植密度为每公顷73,300株。在降雨不足的时期，对WW处理区提供灌溉。干旱处理在播种后20天开始，此后受水分胁迫的田块在整个收获期间没有降雨或灌溉。每个基因型在每种灌溉处理下都有四个生物学重复。在开花期、叶片期、支持根期和第四节根期采集样本进行解剖分析。干重是通过将组织在60°C下干燥7天来确定的。

2.11 智利田间试验

在智利进行了一项田间试验，使用了之前已被证明在耐旱性上有差异的现代杂交基因型，以评估在自交系中观察到的模式是否在具有商业意义的遗传背景下仍然存在，并将这些观察结果扩展到新的环境中。CL20田间试验在智利Graneros附近的Tuniche研究农场（坐标：?34.108279° S, ?70.748495° W，土壤类型为Inceptisol）进行，时间从2019年11月持续到2020年5月。同样采用了分割区设计，设置了两种灌溉水平：一个灌溉受限的田地被分成两个受水分胁迫的区块，一个灌溉的田地被分成两个区块。在每个区块内随机分配了16个已知在耐旱性上有差异的杂交基因型（8个耐旱基因型和8个敏感基因型）。所有田地都施用了足够的肥料以满足玉米的营养需求。每个基因型种植在两条4.6米长的行中，行间距为76厘米。在降雨不足的时期，对WW处理区提供灌溉。每个基因型在每种灌溉处理下都有四个生物学重复。在开花期、叶片期、支持根期和第四节根期采集样本进行解剖分析。干重是通过将组织在60°C下干燥7天来确定的。

2.12 统计分析

所有统计分析都是在R v. 3.6.2（R Core Team，2019）中进行的，并使用“ggplot2”（Wickham，2016）进行图形可视化。在所有统计测试之前，分别使用Shapiro–Wilk检验和非恒定误差方差检验来确定数据的正态性和同方差性。如果数据不符合这些假设，则使用Box–Cox、对数或ln变换来帮助数据标准化。对于所有数据分析，显著性相关性和差异在α ≤ 0.05时考虑，在α ≤ 0.1时也予以考虑。根据Fehr（1987）的方法，计算了地下第四节根、地上支持根和叶片的广义遗传力（H2）和重复性（R2），其中σ2(G)是基因型方差，σ2(E)是误差方差，σ2(Eg)是与基因型重复测量相关的永久环境方差（公式2-3）。通过受限最大似然法拟合的线性混合模型生成了每个表型的基因型误差方差和永久环境方差。在确定方差成分时，每个基因型发芽的次数都被视为一次重复。

3 结果

3.1 韧皮部导管元素长度和穿孔板表型在玉米基因型之间存在差异

LAT能够快速可视化纵向切片中的MVEL以及纵向和横向切片中的穿孔板高度（图1a,b）。观察到玉米基因型在穿孔板延伸到木质部腔内的高度（突出程度）以及沿韧皮部导管元素长度分布的穿孔板频率方面存在显著差异（图2a–d）。这些表型在IBM群体中的分布接近正态或略微偏小（图2e,f）。观察到穿孔板高度与MVEL之间存在显著关系（r2 = 0.25），即MVEL较短的基因型倾向于具有较高的穿孔板，而MVEL较长的基因型倾向于具有较低、不太突出的穿孔板（图2g；N = 233，p < 0.001）。在节点根中具有不同MVEL表型的IBM基因型，在地上支持根和叶片组织的MVEL上也显示出类似的差异（图3和图S1）。WS对MVEL表型没有显著影响（图3）。在具有不同MVEL表型的基因型之间，没有观察到其他韧皮部表型的差异，如韧皮部导管的数量、韧皮部导管的总横截面积或根段的估计轴向水传导性（图S2）。

3.2 MVEL与韧皮部导管长度的关系

为了确定MVEL是否与总韧皮部导管长度相关，我们可视化了3000张长切片LAT根图像，以识别具有可见木质部导管末端的样本。我们测试了这样一个假设：具有较短MVEL的基因型也将具有较短的总韧皮部导管长度，因此在任何给定的纵向切片中更有可能呈现可见的导管末端。实际上，具有可见导管末端的基因型的MVEL显著较短（表2）。表2显示了统计测试的结果，该测试假设具有较长韧皮部导管元素长度（MVEL）的玉米基因型也具有较长的总韧皮部导管长度，这表现为根长切片中可见导管末端的频率较低。进行了Welch单侧T检验，以确定具有可见末端的基因型是否比没有可见末端的基因型具有更短的MVEL。数据经过对数变换以获得正态性。T检验得到了置换检验的支持，这是一种更稳健的检验方法，它将具有和没有可见末端的组之间的差异与10,000次随机重排进行了比较。T检验（参数检验）和置换检验（非参数检验）都支持具有可见导管末端的基因型具有较短韧皮部导管元素的假设。描述性统计：韧皮部导管元素长度（毫米）

3.3 韧皮部导管长度和穿孔板的遗传控制

遗传因素分别解释了节点根、支持根和叶片的MVEL表型变异的77.7%、61.8%和43.3%（表3）。同样，遗传因素分别解释了节点根、支持根和叶片的穿孔板高度表型变异的37.8%、49.0%和28.6%（表3）。表3显示了在南非、美国和智利的田间条件下，以及在美国和智利的干旱缺水条件和水分充足条件下，四个杂交自交系B73 × Mo17（IBM）重组系中地下第四节根、地上支持根和叶片的韧皮部导管元素长度（MVEL）和穿孔板高度（PP height）的广义遗传力（H2）和重复性（R2）。遗传力和重复性是根据Fehr（1987）的方法计算的。基因型误差方差和永久环境方差是通过受限最大似然法拟合的线性混合模型生成的。在确定方差成分时，每个基因型发芽的次数都被视为一次重复。

3.1 韧皮部导管元素长度和穿孔板表型在玉米基因型之间存在差异

3.2 MVEL与韧皮部导管长度的关系

为了确定MVEL是否与总韧皮部导管长度相关，我们可视化了3000张长切片LAT根图像，以识别具有可见木质部导管末端的样本。我们测试了这样一个假设：具有较短MVEL的基因型也将具有较短的总韧皮部导管长度，因此在任何给定的纵向切片中更有可能呈现可见的导管末端。事实上，具有可见导管末端的基因型的MVEL显著较短（表2）。表2显示了统计测试的结果，该测试假设具有较长韧皮部导管元素长度（MVEL）的玉米基因型也具有较长的总韧皮部导管长度，这表现为根长切片中可见导管末端的频率较低。Welch单侧T检验用于确定具有可见末端的基因型是否比没有可见末端的基因型具有更短的MVEL。数据经过对数变换以获得正态性。T检验得到了置换检验的支持，这是一种更稳健的检验方法，它将具有和没有可见末端的组之间的差异与10,000次随机重排进行了比较。T检验（参数检验）和置换检验（非参数检验）都支持具有可见导管末端的基因型具有较短韧皮部导管元素的假设。描述性统计：韧皮部导管元素长度（毫米）

3.3 韧皮部导管长度和穿孔板的遗传控制

遗传因素分别解释了节点根、支持根和叶片的MVEL表型变异的77.7%、61.8%和43.3%（表3）。同样，遗传因素分别解释了节点根、支持根和叶片的穿孔板高度表型变异的37.8%、49.0%和28.6%（表3）。表3显示了在南非、美国和智利的田间条件下，以及在美国和智利的干旱缺水条件和水分充足条件下，四个杂交自交系B73 × Mo17（IBM）重组系中地下第四节根、地上支持根和叶片的韧皮部导管元素长度（MVEL）和穿孔板高度（PP height）的广义遗传力（H2）和重复性（R2）。遗传力和重复性是根据Fehr（1987）的方法计算的。在南非、美国和智利的田间条件下，以及在干旱缺水条件和水分充足条件下，分别计算了第四节根、地上支持根和叶片的遗传力和重复性。采样地点

3.4 韧皮部导管元素长度（MVEL）和穿孔板高度的遗传控制

在IBM群体中，检测到了MVEL（图4a）和穿孔板高度（图4b）的QTL（数量性状位点）。对于MVEL，一个主要QTL位于染色体3上，解释了9.13%的表型变异。对于穿孔板高度，一个主要QTL位于染色体2上，解释了该表型10.29%的表型变异。图4显示了这些特征的遗传控制情况。图4中的复合区间映射显示了双亲群体（B73 × Mo17）中这些特征的遗传控制。使用Bonferroni校正后的全基因组关联分析（GWAS）阈值?log(p) = 7，识别出两个显著的SNP。为了识别潜在的候选基因，我们检查了位于这些显著SNP ± 5000 bp范围内的所有注释基因。从包含高于Bonferroni显著性阈值的SNP的基因模型中选择了候选基因。其中一个显著的SNP与染色体1上的Zm00001d030760基因模型相关，该基因被预测为一种主要在干旱胁迫下在根部表达的天冬酰胺合成酶家族蛋白（图5a）。另一个显著的SNP与染色体8上的Zm00001d012015基因模型相关，该基因被预测为一种主要在根部表达的Squamosa promoter-binding 2蛋白（图5a）。还识别出两个显著的穿孔板高度SNP，一个位于染色体1上，另一个位于染色体8上（图5b）。在染色体1上发现了四个与SNP相关的候选基因，包括Zm00001d031943（驱动蛋白重链）、Zm00001d031944（发夹诱导蛋白）、Zm00001d031945（含有N末端结构域的谷胱甘肽S-转移酶）和Zm00001d031946（功能未知）。染色体8上的SNP与Zm00001d011745相关，后者属于卵磷脂：胆固醇酰基转移酶家族。图5显示了这些特征的遗传控制情况。全基因组关联研究（GWAS）发现了与MVEL和染色体1及8上的板高度（a和b）显著相关的单核苷酸多态性（SNPs）。这些显著SNPs是基于全基因组校正的Bonferroni阈值?log(p) = 7确定的。

3.4 MVEL表型对水分运输的影响

计算流体动力学建模表明，在一个3.0毫米长的木质部导管元素中，穿孔板的高度对流动阻力的影响远大于MVEL（表4）。在实际的根段中，使用Hagen–Poiseuille定律根据导管数量和直径估算的导通性与实际测量到的根段导通性之间的差异，可以通过该根段中后木质部导管元素的长度来很好地解释（r2 = 0.35）（图6b）。此外，穿孔板对实际导通性的影响也体现在根段长度减小时导通性的增加上（图6c）。

表4. 压力差（Δp）、平均流速（q）、流动阻力（Δp/q）以及与没有穿孔板的光滑导管相比流动阻力的增加，在不同穿孔板高度和间距组合的计算流体速度模型中。

图6：在从田间收集的玉米（Zea mays L.）根段中，实际轴向导通性与Hagen–Poiseuille定律预测的导通性有很好的相关性（N = 21；p < 0.001）（a）。然而，实际测量值与预测值之间存在几个数量级的差异，这种差异可以通过这些根段的后木质部导管元素长度来解释（N = 21；p = 0.0045）（b）。在种植后42天（DAP）从温室收集的根段中，观察到长MVEL和短MVEL基因型之间的明显差异，随着根段长度的减少，穿孔板对限制导通性的影响也变得明显（N2.5 cm = 17，N5 cm = 14，N7.5 cm = 14，N10 cm = 14）。星号表示通过Welch的双样本T检验确定的长期型和短型表型之间的显著差异（α ≤ 0.05）。

3.5 MVEL与根系伸长相关

MVEL表型与不同植物器官的伸长有关。具有长MVEL表型的基因型在水分亏缺条件下42天时显示出更快的根系伸长速率（图7a,b）和更长的总根长（图7c）。尽管根系伸长速率存在这些差异，但在根尖或基部根段均未检测到长MVEL表型和短MVEL表型之间的根系呼吸速率差异（图S3）。

3.6 MVEL与植物水分状况和水分亏缺条件下的产量相关

在31天（DAP）和42天（DAP）时，观察到MVEL表型对中宇宙深度土壤含水量的显著影响（图8b；p = 0.049和图8c；p = 0.022），在42天时，短MVEL基因型在120至140厘米深度处含有更多的水分（图8c）。尽管在深层有更多的可用水分，但在水分亏缺条件下42天时，短MVEL基因型的黎明前叶水势（p = 0.07）和中午叶相对含水量（p = 0.07）低于长MVEL基因型（图9）。

4.1 更深的根系伸长导致更好的水分捕获

在大多数作物生产环境中，更深的根系伸长通过增加土壤水分的可用性来提高水分捕获（Lynch, 2013; Lynch & Wojciechowski, 2015）。这对于玉米来说尤其如此，一系列不同的根系表型通过增加根系伸长深度，这些表型在遗传控制和生理作用机制上有所不同，也能在田间干旱条件下提高水分捕获、植物水分状况和产量。这些表型包括解剖学特征，如根皮层通气组织（Chimungu et al., 2015; Zhu et al., 2010）、皮层细胞大小（Chimungu et al., 2014b）、皮层薄壁组织壁宽度（Sidhu, Lopez-Valdivia et al., 2024）、皮层细胞层数（Chimungu et al., 2014a）和多列皮层通气组织（Klein et al., 2020），以及结构特征，如节根数量（Gao & Lynch, 2016）、侧根分枝密度（Zhan et al., 2015）和更陡的生长角度（Uga et al., 2013 [水稻，Oryza sativa]；Lynch, 2022）。在这种情况下，伸展表型直接增加了根系伸长和根系深度，如在水分亏缺条件下的中宇宙实验中所观察到的，从而改善了地上部分的水分状况。我们没有在田间试验中测量根系深度，但伸展表型与田间干旱条件下改善的植物水分状况之间的关联——通过植物水势、叶温、叶蒸腾作用和叶CO2同化作用来衡量——与更深的根系伸长完全一致。可能的情况是，更深的根系伸长是更好干旱适应的结果而非原因，这一点可以通过更密集地采样根系深度、随时间变化的土壤水分含量和植物水分状况来进一步澄清。然而，根据这里提供的证据，可以合理地得出结论：更大的细胞伸长导致更长的根系伸长，从而实现更深的根系生长和更好地利用深层土壤水分，这是拉伸表型提高耐旱性的重要机制，即使不是最重要的机制。

4.2 更大的轴向水力传导性导致水分传输增加

一年生作物的耐旱性通常与降低的水力传导性有关，这有两个好处：一是为植物在生长季节后期储存土壤水分；二是通过部分气孔关闭、减少叶片扩展、叶片卷曲和叶片脱落等方式，迫使地上部分更加节约用水（Lynch等人，2014；Richards & Passioura，1989；Vadez，2014；Zaman-Allah等人，2011）。然而，在这项研究中我们看到的是相反的情况——更大的轴向水力传导性是提高耐旱性的综合表型的一部分。一种可能性是，更深的根系生长是提高耐旱性的机制，而增加的水力传导性并不重要，特别是因为人们认为厚壁导管并不是植物中水分流动的主要阻力。另一种可能性是，更大的水分传输有利于冠层冷却和地上部分的碳积累，只要深层土壤中有足够的水分，并且植物能够通过更深的根系获取这些水分。

4.3 根系深度、水分传输以及拉伸表型的其他表型之间的相互作用

环境适应性是由一系列综合表型决定的，这些表型之间可能存在协同作用、拮抗作用或中性相互作用。在一项关于玉米耐旱性的研究中就证明了这一点，该研究发现，与单个表型状态相比，多个综合的根系表型与干旱条件下的产量更高有关（Klein等人，2020）。在Klein等人的研究中，从厚壁导管直径估计出的降低的厚壁导管水力传导性与干旱条件下的更高产量相关，尤其是在后期成熟的基因型中，这些基因型更依赖于储存的土壤水分。在本研究中，拉伸表型的厚壁导管成分——即更长的MVEL（厚壁导管长度）、降低的穿孔板高度和更长的导管长度——共同作用，增加了轴向水力传导性。这些因素可能是协同的（意味着它们对耐旱性的影响大于简单加和效应），因为它们将更大的轴向传导性与更深的根系深度结合起来，从而使得更大的水分捕获能力与更强的水分传输能力相联系。在Strock等人（2021）对耐旱性差的普通豆（Phaseolus vulgaris）和耐旱性强的刺叶豆（Phaseolus acutifolius）的木质部解剖结构和根系结构的比较研究中也报告了类似的情况。在根系更深的P. acutifolius中，具有高轴向传导性的基因型能够更好地利用深层土壤水分；而在根系较浅的P. vulgaris中，具有低轴向传导性的基因型通过保持土壤水分，在生长季节后期实现了更好的水分捕获。这些结果表明，厚壁导管的形态与根系深度相互作用，决定了耐旱性，并说明了根系结构和解剖学表型在根系功能上的协同作用。拉伸表型似乎通过类似的机制发挥作用，即结合更深的根系深度和更大的轴向水力传导性，尽管在这种情况下，这些特征属于多效性综合征而非分离的表型。

4.4 除了轴向水力传导性和根系深度之外的多效性表型

另一种可能性是，拉伸表型的耐旱性改善是由于我们在本研究中未测量的机制。拉伸表型的解剖学多效性在根、茎和叶的各种组织中都有体现，因此可能通过其他机制影响耐旱性，例如由于保卫细胞尺寸改变而改变的气孔动态，或者由于叶片解剖结构改变而改变的叶肉传导性，或者由于节间长度增加而改变的冠层能量和水分预算。拉伸表型值得进一步研究。然而，由于我们观察到拉伸表型增加了根系伸长和根系深度以及轴向水力传导性，而这些因素都已知会影响耐旱性，因此未测量到的多效性表型的重要性尚不确定。在这方面，我们注意到在玉米中，较长的薄壁细胞比较短的薄壁细胞需要更少的维持呼吸作用（Sidhu & Lynch，2024），这种机制已被证明可以提高耐旱性（Lynch，2015），但在本研究中我们没有观察到拉伸表型对根系呼吸作用的影响（图S3）。

4.5 对其他分类群的相关性

在这项研究中，我们评估了719个玉米基因型，它们代表了丰富的遗传和表型多样性。这些基因型的选择基于它们适合我们进行的遗传和生理分析。我们选择它们并不是为了代表特定的育种材料、地方品种或适应任何特定生产环境的优良种质资源。在所有情况下，我们都观察到了相同的生理模式。根据所提出的生理机制以及我们在本文中的实际观察结果，我们没有理由认为我们的结果仅限于某些特定的遗传结构。未来的研究可以评估拉伸表型在其他分类群中的存在及其对耐旱性的相关性，包括优良品系以及来自不同环境的地方品种、野生玉米（teosinte）和与玉米密切相关的分类群，如高粱和小米（特别是珍珠小米，鉴于其已知的耐旱性和de la Fuente等人（2024）报告的有希望的遗传结果），还有小麦、水稻和其他谷物作物。许多根系表型的一个挑战是它们在田间难以大规模表型鉴定，尽管也有一些例外（例如，Hanlon等人，2023）。穿孔板高度的表型鉴定特别繁琐，因为其尺寸接近显微镜的分辨率极限。然而，MVEL（厚壁导管长度）更容易测量，尤其是在叶片中，可以使用便宜的便携式USB光源显微镜在田间快速进行表型鉴定。这种表型的低环境可塑性意味着可以在非胁迫条件下对其进行表型鉴定，这有助于表型分析，因为在田间施加均匀的干旱胁迫是复杂且具有挑战性的。与拉伸表型相关的QTL（数量性状位点）虽然效应大小适中，但也可以帮助在育种计划中应用这一表型。全基因组选择方法可以同时考虑基因组范围内的标记效应，可能捕获额外的加性变异并提高应用育种中的预测准确性。未来的研究旨在改进品种，可以评估基因组选择模型对这一表型的实用性。最初，我们试图验证以下假设：（1）简单的穿孔板表型对水分传输有显著影响；（2）玉米中这些表型存在种内变异；（3）这种变异影响干旱胁迫下的水分利用策略。虽然前两个假设易于解决，但穿孔板结构的变化对水分利用策略的影响很难与其他与细胞伸长率相关的多效性效应区分开来。穿孔板的高度确实可能影响轴向水力传导性，但MVEL和总导管长度以及其他我们未测量的维管表型也可能有影响。由于木质部传导性和根系深度之间的多效性，这些结果无法单独评估轴向水力传导性对玉米耐旱性的相关性。我们认为，包括根系伸长、根系深度、木质部传导性以及可能未测量的地上部分和生殖表型在内的综合拉伸表型整体负责其卓越的耐旱性，而不仅仅是构成拉伸表型的单个表型状态。尽管这些相互作用使我们的观察结果的解释变得复杂，但发现这种在相对简单的遗传控制下改善玉米耐旱性的新多效性综合征是值得注意的。需要进一步研究拉伸表型，包括验证候选基因，并通过更详细地研究水分获取和利用的动态，以及在其他谷物作物中表型分析MVEL来阐明其卓越耐旱性的生理机制。在这种情况下，计算机模拟工具可能特别有用，因为它们可以模拟和解析显示拉伸表型部分特征的表型，例如在水稻中改善氮吸收的根系结构表型（Ajmera等人，2022）和在野生玉米/玉米过渡中包含根系驯化综合征的表型（Lopez-Valdivia等人，2025）。

作者贡献

Christopher F. Strock：概念化；数据管理；正式分析；调查；方法学；可视化；初稿撰写；审稿和编辑。Cody L. DePew：正式分析；调查；方法学；审稿和编辑。Jagdeep S. Sidhu：正式分析；审稿和编辑。Tianyu Xu：正式分析；调查；审稿和编辑。Jonathan P. Lynch：概念化；正式分析；资金获取；方法学；项目管理；监督；初稿撰写；审稿和编辑。

致谢

我们感谢宾夕法尼亚州立大学Huck生命科学研究所显微镜核心设施的John Cantolina在冷冻扫描电子显微镜成像方面的帮助。这项研究得到了FFAR未来作物项目、美国农业部国家食品和农业研究所以及Hatch拨款项目#PEN04732的支持。我们感谢美国威斯康星大学麦迪逊分校的Shawn M. Kaeppler博士为这项工作提供种子。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究从田间和温室试验中生成的数据将在Zenodo上公开发布，发布后即可访问。数据集位于：https://doi.org/10.5281/zenodo.11078475