使用单颗粒电感耦合等离子体质谱飞行时间谱（spICP-ToF-MS）技术提取、定量并表征海豹肝脏中含汞和硒的纳米颗粒

《Environmental Science: Nano》：Extraction, quantification and characterization of mercury and selenium containing nanoparticles in seal livers using single particle inductively coupled plasma time of flight mass spectrometry (spICP-ToF-MS)

　　北极海洋哺乳动物体内的汞积累对环境和健康构成了重大威胁，尤其是对于那些依赖这些动物作为传统食物来源的土著社区而言。本研究开发了一种使用单粒子电感耦合等离子体质谱飞行时间（spICP-ToF-MS）技术来定量和表征海豹肝脏中硒化汞（HgSe）纳米颗粒的方案。最初的关键挑战是从生物组织中提取这些纳米颗粒，同时尽量减少对它们的干扰，并使用最简单的提取基质以保持HgSe纳米颗粒的完整性。研究人员比较了五种提取方法（甲酸、蛋白酶和脂肪酶、脂肪酶、四甲基氢氧化铵以及超纯水），通过从髯海豹（Erignathus barbatus）的肝脏中提取HgSe纳米颗粒来进行评估。利用spICP-ToF-MS技术测量了单个纳米颗粒中的金属和类金属元素含量。根据颗粒数量和颗粒大小分布，甲酸被确定为提取HgSe纳米颗粒的最佳介质。在甲酸提取液中，HgSe纳米颗粒在较长时间内（长达一个月）保持结构稳定，颗粒数量和颗粒大小分布的变化很小。spICP-ToF-MS技术还能够确定单个HgSe纳米颗粒的化学计量比，并且还发现了以前未报道的微量银（1%）和铋（0.5%）与这些纳米颗粒的关联。这些结果扩展了我们对硒在汞解毒过程中所起保护作用的理解，表明可能存在涉及多元素硒化物复合物的解毒机制。本研究建立了一种可靠的分析方法，用于研究纳米尺度上的金属解毒过程，为了解北极生态系统中的汞循环以及食用海洋哺乳动物的社区的暴露风险提供了重要见解。

北极海洋哺乳动物中的汞污染直接威胁到土著社区的健康，其中一些社区将这些动物作为传统食物来源。本研究利用单粒子ICP-ToF-MS技术来表征髯海豹肝脏中的硒化汞纳米颗粒，提供了关于硒在汞解毒过程中作用的纳米级见解。单粒子电感耦合等离子体质谱飞行时间技术能够同时检测多种元素，发现某些HgSe纳米颗粒中还含有微量的银和铋，这表明存在涉及多元素硒化物复合物的更广泛的解毒机制。这些发现加深了我们对生物产生的纳米材料如何调节生物体内汞含量的理解，对于评估北极生态系统中的汞生物可利用性和饮食暴露风险具有重要意义。

基于最新的全球自然档案记录评估，北极地区的大气汞（Hg）输入量相比工业化前增加了5到9倍，这引发了对其对生物可能影响的担忧。事实上，最近在多种栖息地中的研究都发现了海鸟和海洋哺乳动物（如海豹、白鲸、鲸鱼）体内高浓度的汞，尤其是在北半球。这些高浓度汞含量归因于它们位于食物链的顶端以及生物放大的重要作用。特别是海豹，作为第一民族人民的重要食物来源，其体内汞含量较高。在因纽特人中，海豹肝脏是一种具有文化意义的食物，通常在捕猎后不久就直接食用。甲基汞（MeHg）具有高度毒性，可以在生物体内积累，导致严重的健康问题。然而，硒（Se）被认为可以通过去甲基化作用减轻甲基汞的毒性。有强有力的证据表明，金属硫蛋白和硒蛋白之间存在直接相互作用，其中硒以硒半胱氨酸的形式参与生成汞硒化物（HgSe）微粒和纳米颗粒。因此，定量和表征这些HgSe纳米颗粒对于理解汞在海洋和淡水系统中的命运及其潜在毒性至关重要。以往用于HgSe纳米颗粒表征的分析方法包括透射电子显微镜（TEM）、激光烧蚀ICP-MS（LA-ICP-MS）和X射线荧光（XRF）元素映射，但这些方法各有局限性。例如，TEM需要复杂的样品制备，并且必须在高真空条件下进行，这可能会通过脱水或结构改变影响纳米颗粒。单粒子电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）是一种相对较新的技术，可以测定纳米到微米级颗粒的无机成分。它可以直接分析处于原始状态的单个纳米颗粒，具有高灵敏度，并且不需要复杂的样品制备。此外，通过快速测量大量颗粒，它可以提供统计上有用的颗粒浓度数据和颗粒大小分布。在最近的一项研究中，从海鸟中提取了HgSe纳米颗粒并使用四极杆型spICP-MS进行了分析。然而，四极杆型技术的局限性在于它一次只能分析一种元素，这意味着元素之间的关联只能是相关的。在ICP-MS上使用飞行时间（ToF）装置则可以同时测定单个颗粒中的多种元素。在开发用于分析生物组织中纳米颗粒的单粒子技术时，一个重要的挑战是首先需要开发出既能有效提取纳米颗粒又能保持其完整性的方法。提取过程必须足够强烈以溶解生物组织并最大化颗粒产量，同时避免颗粒溶解或聚集。此外，提取介质应尽可能简单，以减少质谱分析过程中的基质效应。已经有多种提取生物组织中纳米颗粒的方法被记录下来，包括基于酶的方法、四甲基氢氧化铵（TMAH）或甲酸的方法，尽管这些方法在提取效率和保持不同类型组织中纳米颗粒的完整性方面表现不一。本研究的目的是首先验证一种从生物组织（本例中为髯海豹肝脏）中有效提取硒化汞（HgSe）纳米颗粒的方案，以便与spICP-MS技术结合使用。通过验证提取方法来最大化HgSe纳米颗粒的产量同时保持其完整性。然后使用spICP-ToF-MS对颗粒进行表征，从而区分汞和HgSe纳米沉积物，为了解它们的潜在生物可利用性提供了一些见解。

虽然初步实验分析了多个个体和另一种海豹物种（Pusa hispida）的样本（见表S1），但这里仅展示了一个个体的肝脏样本，以减少样本间的变异性并确保方法的稳健性。分析对象是一只未知年龄的雄性髯海豹（Erignathus barbatus），它在Ungava Bay地区的Marralik河附近被捕获（见图S1）。该样本含有最高量的含汞纳米颗粒。肝脏被切成小块并冷冻干燥3天，然后使用玻璃研钵和杵研磨成粉末，最终产品储存在-20°C的冷冻柜中待用。

样品使用由超纯硝酸（67–70%；Plasma Pure Plus，AnalytiChem）和盐酸（34–37%；Plasma Pure，AnalytiChem）组成的混合酸进行消化，体积分别为4毫升和1毫升。消化过程在MARS 5微波系统中进行，遵循美国环境保护署（EPA）的方法3051.20。使用NexION 5000三重四极杆ICP-MS（PerkinElmer Inc.，马萨诸塞州，美国）对稀释后的消化物中的汞（Hg）和硒（Se）浓度进行定量。仪器操作条件总结在表S2中。外部校准曲线使用来自加拿大蒙特利尔的AnalytiChem公司的单元素标准品（浓度为1, 2, 5, 10, 和20 μg L?1）制备。内部标准品包括用于硒的钇和用于汞的铋（浓度为10 μg L?1；AnalytiChem，蒙特利尔，加拿大）。还分析了一个单独的质量控制标准品（AnalytiChem，蒙特利尔，加拿大）以验证ICP-MS的测量结果，并使用认证参考物质DOLT-5（狗鱼肝脏）验证了分析准确性。在正常模式下监测了202Hg和82Se同位素。

在下面描述的提取方法中，我们旨在找到对纳米颗粒干扰最小的最佳方法。这些方案借鉴了之前发表的提取协议，尽管只有El Hanafi等人的论文使用SP ICP-MS分析了HgSe颗粒。对于每种方案，将5毫升提取溶液加入20毫克冷冻干燥的海豹肝脏粉末中，置于15毫升的聚丙烯管中。

(i) 脂肪酶：向5毫升5 mM HEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）溶液中加入至少5250单位的Candida rugosa脂肪酶（Sigma-Aldrich，美国，1.5 mg mL?1），然后用NaOH调节pH至约7.5。

(ii) 蛋白酶和脂肪酶：首先将粉末样品与5毫升乙醚混合在15毫升的试管中，然后在旋转振荡器上以150 rpm的速度振荡1小时，然后离心。含有脂质的醚相转移到新的试管中，确保完全去除脂质。接着向混合物中加入20毫克Aspergillus melleus XXIII型蛋白酶（Sigma-Aldrich，美国，≥3单位mg?1）和10毫克Candida rugosa VII型脂肪酶（Sigma-Aldrich，美国），再加入5毫升50 mM碳酸氢铵（用HCl调节pH至7.4）。最后，加入12.5毫升Triton-X-100，使浓度达到0.025%（v/v）。

(iii) 四甲基氢氧化铵（TMAH）溶液：将海豹肝脏粉末加入5毫升10% TMAH（v/v）溶液中（Alfa Aesar，马萨诸塞州，美国），其中含有0.025%（v/v）Triton-X-100。

(iv) 甲酸溶液：将5毫升50% HCOOH（v/v）溶液（J.T. Baker，美国）与海豹肝脏混合；然后加入0.025%（v/v）Triton-X-100。

(v) Milli-Q水：使用含有0.025%（v/v）Triton-X-100的Milli-Q水作为对照和极简化的基质。对于所有五种提取方案，首先将混合物涡旋30秒以确保均匀悬浮。然后在冰浴中以25%的振幅进行15分钟的超声处理（50秒开启，10秒关闭；QSONICA500超声波仪，New Town，美国；500瓦）。超声处理后，以1000 × g的离心速度离心5分钟以去除较大的颗粒和未消化的组织碎片。上清液小心收集并稀释100倍，用于spICP-ToF-MS分析。程序空白样品的处理与样品相同，以监测协议不同步骤的污染情况。

据我们所知，市场上没有可购买的含有已知比例汞和硒的参考材料。因此，为了验证不同提取方法获得的Se:Hg摩尔比，将一批HgSe（PURATREM，美国）样品悬浮在含有0.05% Triton X-100的超纯水中。表面活性剂是必不可少的，因为没有它，纳米颗粒会强烈粘附在试管壁上。然后样品以1000 × g的离心速度离心5分钟以去除较大的聚集物。使用动态光散射（DLS，Wyatt Technology）技术对上清液中的颗粒进行流体动力学直径测量，该技术使用了60纳米的聚苯乙烯纳米球（Bangs Laboratories制造，测量结果为64.0 ± 0.5纳米，%PDI 3.3 ± 1.7%）。这些分散良好的HgSe颗粒随后被用作不同提取介质中颗粒摩尔比测量的参考系统。

纳米颗粒使用飞行时间ICP-MS（Vitesse，Nu Instruments，Wrexham，英国）在高速度（单粒子）模式下进行分析。该仪器的灵敏度是通过使用一系列从AnalytiChem（加拿大）购买的离子标准品确定的，这些标准品在2% v/v HNO3中制备，浓度分别为1, 2, 5, 10, 和20 μg L?1的Au。使用两种超均匀的金纳米颗粒悬浮液（50纳米和100纳米；NanoComposix，San Diego，CA，美国）来测定传输效率。通过分析银纳米颗粒（60纳米；NanoComposix，San Diego，CA，美国）的颗粒大小分布来验证测量结果。多元素标准曲线是使用商业标准品（IV-ICPMS-71A；Inorganic Ventures，Christianburg，VA，美国）制备的，并添加了Bi和Hg（AnalytiChem；加拿大），浓度分别为1、2、5、10和20 μg L?1，溶解在2% v/v HNO3 + 0.5% v/v HCl中。为了确保最大的准确性和稳定性，所有Hg标准品都是在分析当天从1000 mg L?1的储备溶液中新鲜制备的。在spICP-ToF-MS分析之前，所有样品和校准溶液都涡旋30秒，然后放入超声波浴（5510R-DTH Bransonic?，DANBURY，美国）中十分钟，以分散聚集的颗粒。根据浓度不同，通过用超纯水稀释样品进行多次稀释（50×到1000×）。样品的元素组成在60–210 amu的质量范围内确定。每个样品分析三个重复样本。数据收集时间为60秒，使用两个停留时间（80和190 μsec）。spICP-ToF-MS的完整操作条件在表S2中提供。

原始数据使用IsotopeTrack26应用程序处理，该应用程序实现了SPCal算法，该算法假设化合物遵循泊松对数正态离子分布。包含每个颗粒中每个元素的离子计数、质量和摩尔数的CSV文件使用Python 3.11.5中的自定义脚本处理，该脚本使用Streamlit app TOFVision编写。颗粒浓度根据公式（1）确定：

(1)

其中C代表颗粒浓度（mL?1），P是时间扫描中观察到的颗粒计数或峰数，η是校准的传输速率（μL s?1），t是总采集时间（s），f是稀释因子。颗粒质量分布直接由spICP-ToF-MS根据离子校准确定。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后跟Tukey的HSD事后检验（post-hoc test）对提取方法进行统计比较。

提取条件的优化

首先使用定量ICP-MS在几种海豹物种的肝脏中测定了总汞和硒的浓度，经过完全酸消化后（表S3）。在检查的不同样本中，胡须海豹的肝脏含有异常高的汞（425.9 ± 5.1 μg g?1干重）和硒（172.6 ± 2.5 μg g?1干重）浓度，其Se:Hg的摩尔比为1.03，使其成为进一步研究的理想候选者。此外，还测定了MeHg的浓度，发现其非常低（2.015 μg g?1干重）（补充信息S1）。在方法开发过程中，测试了样品质量、超声处理条件（时间、幅度、模式）、温度和后处理方法，以确定产生最多颗粒的方法（表S4），这是根据spICP-ToF-MS峰的数量确定的。实际上，时间分辨信号显示汞和硒都有明显的峰，且在单个颗粒事件中经常共定位（图1）。

图1显示了使用甲酸提取胡须海豹肝脏后，spICP-ToF-MS获得的瞬态信号中的十秒钟。插图：放大比例（3085–3088 ms）显示了一个单一峰，其中可以观察到硒（绿色）和汞（蓝色）在单个离子云中（即单个纳米颗粒）。颗粒数量被认为是提取优化的最重要标准，因为它们不仅反映了提取的效率，还反映了spICP-ToF-MS分析的检测限。实际上，在spICP-ToF-MS中，降低背景通常会导致检测到更多的颗粒，因为金属（类金属）的溶解形式可能会掩盖金属的颗粒形式，特别是对于最小的纳米颗粒。比较不同的提取协议显示出提取效率的显著差异。甲酸协议产生的含汞颗粒数量最多（（5.5 ± 0.1）× 10^6颗粒/mL），其次是基于脂肪酶的协议（（6.5 ± 0.2）× 10^5颗粒/mL），超纯水（（5.3 ± 0.1）× 10^5颗粒/mL），TMAH（（4.6 ± 0.8）× 10^5颗粒/mL），最后是蛋白酶和脂肪酶的组合（（2.2 ± 0.1）× 10^5颗粒/mL）（表S5）。这强烈表明甲酸协议是五种方法中最好的，尽管脂肪酶协议的表现也相当好。

通过spICP-ToF-MS测得的颗粒和溶解浓度的总和与每种提取协议通过定量酸消化获得的Se和Hg浓度进行了比较（表1）。纳米沉积物中的Se和Hg浓度也与酸消化样品进行了比较，以量化它们的重要性。表1显示了每种提取协议下spICP-ToF-MS相对于总酸消化测得的Se和Hg的平均回收率（±标准差）。值是从3个生物学重复样本中计算得出的，每个样本分析三次。总回收率包括颗粒Hg和Se以及来自溶解背景的贡献。通过将纳米颗粒信号除以总酸消化获得的值，还计算了Se和Hg以纳米沉积物形式存在的比例。

提取方法
Se回收率（%）
Hg回收率（%）
Se以颗粒形式存在的比例（%）
Hg以颗粒形式存在的比例（%）

HCOOH
99.7 ± 5.2
76.0 ± 6.9
6.4 ± 0.4
7.8 ± 0.7

TMAH
110.1 ± 8.2
85.7 ± 3.7
1.9 ± 0.2
1.0 ± 0.0

脂肪酶
7.9 ± 1.2
4.1 ± 0.2
(5.0 ± 1.2) × 10^-4
(6.0 ± 1.5) × 10^-4

蛋白酶 + 脂肪酶
7.0 ± 4.0
1.7 ± 0.6
(2.4 ± 0.7) × 10^-4
(3.4 ± 1.0) × 10^-4

超纯水
5.7 ± 0.6
5.0 ± 0.3
(5.2 ± 1.5) × 10^-4
(5.4 ± 1.0) × 10^-4

就Se和Hg的回收率而言，甲酸和TMAH协议对这两种元素的表现最好，Se的回收率接近100%（甲酸：99.7 ± 5.2%；TMAH：110.1 ± 8.2%），Hg的回收率约为80%（甲酸：76.0 ± 6.9%；TMAH：85.7 ± 3.7%）。虽然TMAH对Se的回收率略高于100%，但考虑到TMAH在溶解生物物质方面的高效性（即使与酸消化相比也是如此），这是合理的。然而，尽管TMAH对Hg和Se的回收率很高，但检测到的颗粒非常少，这表明它们被更强的碱性化学物质溶解了。此外，所有spICP-MS技术都存在一定的分析不确定性，因为在分析过程中样品通常不会被酸化，可能会发生吸附损失。尽管甲酸提取产生的颗粒数量最多（（5.5 ± 0.1）× 10^6颗粒/mL，表S5），但检测到的Hg和Se以纳米颗粒形式存在的比例仍然很低（Se：6.4 ± 0.4%；Hg：7.8 ± 0.7%）。诚然，如果没有用参考物质对样品进行 spiked 处理，颗粒的存在并不足以证明提取是在最佳条件下进行的。例如，提取条件可能会假设性地导致溶解的Hg和Se沉淀成纳米颗粒形式，从而导致高估。尽管如此，当离子Hg和Se在甲酸中混合并通过相同的分析流程处理时，没有检测到纳米颗粒事件，这支持了甲酸提取介质中检测到的颗粒主要是组织本身的观点。另一方面，也可能低估HgSe颗粒的数量，因为不可避免地会有部分颗粒的大小低于仪器的检测限（SDL：甲酸中的Se为110.2 nm，Hg为79.1 nm；表S5）。这意味着大小低于SDL的颗粒将贡献于总元素信号，但不会被计为独立的颗粒事件。实际上，即使酶法和水基协议的SDL略低（Se约为100 nm，Hg约为67–70 nm），检测到的颗粒数量也很少（2.2–6.5 × 10^5颗粒/mL vs. 甲酸的5.5 × 10^6颗粒/mL），这与组织基质的不完全降解一致。实际上，对于水、脂肪酶和蛋白酶/脂肪酶提取，只有5.7–7.0%的Se和1.7–5.0%的Hg被回收，表明这些较温和的协议无法释放大部分组织结合的Hg和Se。因此，即使SDL略有提高，如果提取本身未能从生物组织中释放足够的颗粒，其益处也是有限的。

基于测量的颗粒质量、颗粒含量和摩尔比来验证协议的有效性

鉴于介质对提取效率和仪器检测限的双重影响，使用颗粒质量和颗粒含量来优化颗粒提取就更加细致了。在这种情况下，将颗粒质量和颗粒含量与假设的最温和提取方法（即超纯水）进行了比较。我们的假设是，与在水中的提取相比，颗粒质量的增加表明发生了聚集，而颗粒质量的减少则表明发生了溶解。同样，Hg:HgSe NP的比例变化或Se:Hg比率的变化将表明Hg物种的选择性扰动。使用不同提取方法获得的颗粒质量分布存在显著差异（单因素方差分析，Tukey的HSD事后检验，α = 0.05）（表2）。虽然所有方法都显示出一些差异，但与水中的颗粒质量相比，脂肪酶提取的Hg单元素颗粒质量最为接近，仅相差?6.7 fg（p = 0.375），而蛋白酶协议与水协议相比有中等程度的偏差（?14.7 fg，p = 0.017）。甲酸显示出中等程度的增加（+20.3 fg，p = 0.002），而TMAH与水相比有最大的差异，观察到的颗粒数量更多（但数量少得多）（+72.5 fg，p < 0.001）。另一方面，对于HgSe颗粒质量的测定，脂肪酶协议（?5.8 fg，p = 0.803）和蛋白酶协议（?14.3 fg，p = 0.202）显示出明显的减少，但这些差异并不显著。最后，与水相比，甲酸显示出显著的增加（+33.1 fg，p < 0.001）。特别是使用TMAH提取HgSe颗粒时，观察到的最大正偏差（+96.2 fg，p < 0.001）。实际上，TMAH提取产生的分布中颗粒数量较少，但颗粒显著更大，这表明发生了聚集。这样的观察结果与最近的一项研究一致，该研究表明TMAH提取组织可以显著改变颗粒数量和颗粒质量分布，导致目标纳米材料的显著变化。

基于超纯水对照的提取介质中的颗粒质量差异（单因素方差分析，Tukey的HSD事后检验，α = 0.05）。每种方法分析了3个生物学重复样本和3个分析重复样本。对于加粗的值，质量和直径与水提取的值没有显著差异。

方法
Hg质量与水（fg）
HgSe质量与水（fg）

TMAH
+72.5 (p < 0.001)
+96.2 (p < 0.001)

甲酸（HCOOH）
+20.3 (p = 0.002)
+33.1 (p < 0.001)

脂肪酶
?6.7 (p < 0.375)
?5.8 (p = 0.803)

蛋白酶 + 脂肪酶
?14.7 (p < 0.017)
?14.3 (p = 0.202)

根据颗粒质量，使用蛋白酶的方法似乎会诱导轻微的颗粒溶解，而甲酸似乎会导致一些颗粒聚集。酶法和甲酸协议似乎都优于TMAH提取。根据之前报道的Hg纳米沉积物大小的有限数据（甲酸215 ± 90 nm；酶法148 ± 58 nm），这里发现的所有颗粒大小（甲酸：Hg 172 ± 41 nm；脂肪酶：Hg 121 ± 31 nm；蛋白酶 + 脂肪酶：Hg 100 ± 19 nm；超纯水：Hg 142 ± 28 nm）对于所有提取介质来说都是合理的。最后一个考虑因素是，观察到的偏差可能是由于ICP-ToF-MS测量（例如参考文献31中的基质效应）而不是提取过程本身造成的。通过在spICP-ToF-MS分析前将样品稀释100倍，将这种可能性降至最低。关于不同类型的颗粒，甲酸提取法回收了更多的Hg颗粒（水中为254个，甲酸中为2107个，增加了约8.3倍）以及更多的HgSe颗粒（水中为112个，甲酸中为1707个，增加了约15.2倍）。相比之下，蛋白酶/脂肪酶提取法回收的Hg颗粒数量较少（水中为50个，甲酸中为99个，减少了0.20倍），HgSe颗粒的回收量也相似（水中为112个，甲酸中为99个，减少了0.88倍）。脂肪酶提取法对这两种颗粒的回收量略有提高（Hg：甲酸中为280个，增加了1.1倍；HgSe：甲酸中为178个，增加了1.6倍）。TMAH提取的Hg颗粒数量与水中相似（甲酸中为246个，增加了0.97倍），但HgSe颗粒数量较少（甲酸中为77个，减少了0.69倍）。为了进一步验证spICP-ToF-MS技术在测定HgSe纳米颗粒方面的有效性，每种提取介质都加入了相同体积（100 μL）的HgSe参考悬浮液（不含生物组织）。然后对悬浮液进行连续15分钟的超声处理，并立即将其稀释100倍后进行分析。分析后的（稀释后的）样品在3分钟的采集时间内含有大约350到800个可检测到的颗粒。量化HgSe纳米颗粒的一个动机是确定颗粒内的Se:Hg摩尔比。对HgSe参考悬浮液的分析（图2）显示，只有在超纯水中才能获得接近1:1的Se:Hg摩尔比（1.0 ± 0.3），这与HgSe纳米颗粒的化学计量比一致。这一1:1的化学计量比通过HgSe粉末的总酸消化得到独立确认，随后使用ICP-ToF-MS（Nu Vitesse）和ICP-MS（NeXION 5000）进行了分析（文本S3，补充信息）。相比之下，所有其他提取介质都显示出不同程度的硒富集。TMAH和甲酸得到的HgSe颗粒数量相似（甲酸中为246个，增加了0.97倍），但HgSe颗粒数量较少（甲酸中为77个，减少了0.69倍）。为了进一步验证spICP-ToF-MS技术在测定HgSe纳米颗粒方面的有效性，每种提取介质都加入了相同体积（100 μL）的HgSe参考悬浮液（不含生物组织）。然后对悬浮液进行连续15分钟的超声处理，并立即将其稀释100倍后进行分析。分析后的（稀释后的）样品在3分钟的采集时间内含有大约350到800个可检测到的颗粒。量化HgSe纳米颗粒的一个动机是确定颗粒内的Se:Hg摩尔比。对HgSe参考悬浮液的分析（图2）显示，只有在超纯水中才能获得接近1:1的Se:Hg摩尔比（1.0 ± 0.3），这与HgSe纳米颗粒的化学计量比一致。这一1:1的化学计量比通过HgSe粉末的总酸消化得到独立确认，随后使用ICP-ToF-MS（Nu Vitesse）和ICP-MS（NeXION 5000）进行了分析（文本S3，补充信息）。相比之下，所有其他提取介质都显示出不同程度的硒富集。TMAH和甲酸得到的HgSe颗粒数量相似（甲酸中为246个，增加了0.97倍），但HgSe颗粒数量较少（甲酸中为77个，减少了0.69倍）。为了进一步验证spICP-ToF-MS技术在测定HgSe纳米颗粒方面的有效性，每种提取介质都加入了相同体积（100 μL）的HgSe参考悬浮液（不含生物组织）。然后对悬浮液进行连续15分钟的超声处理，并立即将其稀释100倍后进行分析。分析后的（稀释后的）样品在3分钟的采集时间内含有大约350到800个可检测到的颗粒。硒（0.3 fg）和汞（0.1 fg）的质量检测限在这里相当相似（表S6），这意味着在仅检测到汞的情况下，实际上可能存在很少的或没有硒。另一个重要的考虑因素是，这种技术并不系统地分析较轻的元素，因此含有汞的颗粒也可能与非定量元素（如硫或碳）相关联。为了优化仪器对目标元素的灵敏度和检测能力，质量范围被有意限制在60–210 amu之间。在通过调整反应池中的射频电压来优先检测较低质量元素的情况下，观察到较高质量元素（硒、银、汞和铋）的灵敏度降低。尽管如此，通过仪器优化可以检测到含有硫的颗粒（例如，一个含有硫、硒、银、汞和铋的颗粒；见补充信息中的图S3），但在分析的样本中这种多元素颗粒非常罕见。许多研究报道了海洋哺乳动物组织中总汞与其他元素（特别是硒，但也包括银和其他金属）之间的相关性，然而，这些研究仅限于批量化学分析，无法确认这些元素之间的物理关联。我们对多元素纳米颗粒的直接观察加强了这些广泛报道的元素相关性的机制解释，表明这些元素在海洋哺乳动物组织中的共存很可能是以复杂的纳米颗粒结构的形式存在的，而不是偶然的关联。硒的多元素结合能力可能代表了一种重要的适应机制，使海洋哺乳动物能够耐受汞的暴露，也许也能耐受其他亲硫元素（如银和铋），这些元素也对硒有很高的亲和力。这些复杂的多元素硒化物颗粒的形成可能是同时降低几种潜在有害元素生物可利用性的有效策略。

结论

这项工作建立了一个分析框架，用于阐明纳米尺度上的复杂金属解毒过程。这里使用的方法将能够更全面地监测北极环境健康状况，同时为评估依赖海洋哺乳动物作为传统食物来源的社区的饮食汞暴露风险提供有价值的信息。甲酸被确定为从海豹肝脏组织中分离HgSe纳米颗粒的最佳方案，因为在这些颗粒中观察到的变化很少。稳定性研究表明，HgSe纳米颗粒在甲酸提取物中保持了其结构完整性长达一个月之久，颗粒数量或颗粒质量分布的变化很小。虽然这种方案似乎最适合从研究组织中提取HgSe纳米颗粒，但脂肪酶提取也可以作为一个有用的替代方法，尽管回收率稍低。它可能对其他类型的纳米颗粒也适用。使用spICP-ToF-MS技术使我们能够对这些多元素纳米颗粒的复杂性质有新的认识，其中一些颗粒不仅含有汞和硒，还含有银。这一发现扩展了我们对硒在海洋哺乳动物中保护作用的理解，超出了汞的隔离作用，并让我们更好地了解了解毒机制。最后，未来的研究需要在至少三个关键方向上进行：（1）不同组织和海洋哺乳动物物种中这些多元素硒化物纳米颗粒的比较分析；（2）研究这些颗粒在人体消化过程中的稳定性和生物可利用性；（3）探索控制这些复杂纳米颗粒形成的分子和细胞机制。

作者贡献

Houssame-Eddine Ahabchane撰写了论文的初稿，开发并进行了实验，处理并获取了大部分数据，并将其整理成图表。Chrystelle Lessard进行了一些初步实验，设计了表S4和图形摘要，并参与了论文的起草工作。Maria Chrifi Alaoui进行了一些实验，并参与了论文的起草。Sofia Paciello协助了实验工作和数据收集。Dominic Ponton在整个研究过程中提供了宝贵的实际建议和指导。Marc Amyot和Kevin Wilkinson为实验提供了资源，参与了概念化工作，提供了实际建议，并参与了数据解释和所有论文草稿的撰写。

利益冲突

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

支持本文的大部分数据包含在补充信息（SI）中。原始数据可在https://doi.org/10.5281/zenodo.19731329获取。补充信息包括有关所研究海豹的信息、采样地点、ICP-ToF-MS/ICP-MS操作条件、CRM回收率、MeHg分析、测试的提取方案、测量的HgSe颗粒数量、测量的HgSe摩尔比、HgSe颗粒大小分布、LOD、LOQ、MDL、MQL、SDL、甲酸提取的SQL值以及显示多种元素的瞬态质谱信号。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5en01173f。

致谢

我们感谢NSERC联盟基金、NSERC Discovery资助计划和加拿大研究主席计划的财政支持。我们衷心感谢因纽特社区的协作以及提供对这项研究至关重要的肝脏样本。特别感谢Madjid Hadioui、Dominic Belanger和Aaron J. Goodman在他们的技术支持方面的帮助。我们还要感谢蒙特利尔大学MIL校区提供的机械工程研讨会对本工作的贡献。