环状RNA CircMYH8通过结合miR-221来激活p27，从而调控肌肉的增殖、凋亡和分化

《Journal of Agriculture and Food Research》：Circular RNA CircMYH8 regulates muscle proliferation, apoptosis and differentiation via binding miR-221 to activate p27

　　杨淑玲|杨海燕|张晓燕|杨宇|唐佳|邱奥|董五子|王丹|黄茜霞|黄碧芝|陈红
新疆农业大学动物科学学院，830091，中国

**摘要**
许多因素影响牛骨骼肌的发育，其中非编码RNA起着非常重要的作用。虽然环状RNA（circRNA）在各种生理和病理过程中起着核心作用，但它们在肌肉发育中的潜在作用尚未得到充分了解。在本研究中，我们通过胎儿和成年骨骼肌组织的测序数据鉴定出几种差异表达的circRNA。其中包括一种源自肌球蛋白重链蛋白8基因（MYH8）外显子24环化的circRNA（circMYH8），其在成年肌肉组织中显著下调。我们通过过表达或抑制circMYH8来探讨其在骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化中的作用。具体来说，我们使用了荧光素酶报告基因测定、Western blot、实时逆转录定量PCR、细胞计数试剂盒8和5-乙炔基-2-脱氧尿苷来探索circMYH8通过竞争性结合microRNA 221激活cyclin依赖性激酶抑制剂1B对牛肌母细胞增殖、凋亡和分化的分子调控作用。随后，我们将circMYH8过表达质粒注射到肌肉损伤的小鼠体内，以研究其在促进肌肉再生中的作用。结果表明，circMYH8通过miR-221/P27轴抑制牛肌母细胞增殖并促进细胞凋亡和分化。这项研究表明，circMYH8是一个潜在的与肌肉发生相关的因子，并为阐明复杂的分子机制以及更好地理解哺乳动物circRNA在肌肉发育中的功能提供了新的证据。

**引言**
作为哺乳动物中最大的组织，骨骼肌是肉制品的主要来源。研究表明，骨骼肌功能的丧失或再生能力的减弱会导致生长迟缓和肌肉骨骼疾病（1）。骨骼肌的生长和发育是一个极其复杂的多层次调控网络，涉及许多基因及其相关通路的激活或沉默。近年来，越来越多的证据表明，包括肌肉发生在内的骨骼肌发育是一个复杂的过程，在此过程中非编码RNA起着重要作用（2）。
环状RNA（circRNA）是真核生物中多功能分子，在基因表达调控网络中充当关键枢纽（3）。除了作为分子海绵捕获miRNA的经典功能外（4），circRNA还直接与RNA结合蛋白（RBPs）相互作用，形成蛋白质复合物或调节其亚细胞定位。此外，核保留的circRNA（包括ciRNA和EIciRNA）可以通过顺式调控直接介导宿主基因的转录。新兴证据还强调了含有内部核糖体进入位点（IRES）的circRNA翻译微肽的编码潜力（5）。总的来说，这些多方面的机制使circRNA在动物器官发育、组织重塑和复杂性状的调控中不可或缺。
此外，关于circRNA对牛骨骼肌发育的调控作用已有部分报道。例如，杨等人发现circUBE3C通过与miR-191结合并上调p27的表达来调节肌母细胞的发育（6）。邱等人发现环状RNA ACTA1作为miR-199a-5p和miR-433的海绵，通过MAP3K11/MAP2K7/JNK通路调节牛肌母细胞的发育（7）。类似地，魏等人发现circRNA circLMO7可以通过捕获miRNA 378a-3p来调节牛骨骼肌细胞的分化和凋亡（8）。这些研究表明circRNA与牛骨骼肌细胞的增殖、分化和凋亡密切相关。
miRNA是长度约为22个核苷酸的小型非编码RNA，在动物中高度保守（2）。它们可以通过与靶mRNA结合、降解靶mRNA或抑制其翻译来沉默靶基因（9）。有证据表明，许多miRNA参与骨骼肌发育的各个阶段，显著影响肌肉在静止期、增殖期、分化期和再生期的代谢。一项先前的研究表明，miRNA 221在增殖的肌母细胞中高表达，在分化的肌肉细胞中低表达（2）。
作为基于肌动蛋白的马达蛋白，MYH8参与整合素介导的细胞黏附和迁移过程（10）。这一观察结果表明，通过抑制快速加速的纤维肉瘤激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路，可能治疗急性髓系白血病患者中的MYH8尾部截断突变。以往对MYH8的研究主要集中在致病的MYH8突变上。MYH8突变会导致三叉唇畸形综合征肌病（11）。然而，circMYH8在牛骨骼肌细胞中的作用仍有待确定。
本研究探讨了circMYH8、miR-221和cyclin依赖性激酶抑制剂1B（CDKN1B/P27）在牛原代肌母细胞中的生物学作用。此外，我们还确定了circMYH8/miR-221/P27轴是否参与调节牛原代肌母细胞。我们的发现有助于我们对骨骼肌分子机制的总体理解，并可能影响动物遗传发育。

**结果**
**牛体内circMYH8的特征**
我们实验室之前对胎儿和成年牛长背肌进行的circRNA测序鉴定出了一些可能与牛肌肉细胞增殖和分化相关的差异表达circRNA。其中包括circMYH8，它由19号染色体上肌球蛋白重链蛋白8（MYH8）基因的外显子24组成，长度为390个核苷酸（图1A）。我们使用收敛性和发散性引物扩增技术克隆了circMYH8（补充图S1A）。与线性RNA相比，circRNA更稳定，更难被RNase R降解。为了确认circMYH8的环状结构，我们在RNase R处理前后分别扩增了GAPDH和circMYH8。我们发现GAPDH水平显著下降，而circMYH8水平没有下降（图1B）。我们对circMYH8的反剪接接头进行了Sanger测序以确认其真实性（图1A）。

**circMYH8在牛骨骼肌细胞中的功能**
我们通过从牛原代肌母细胞中提取RNA，使用RT-qPCR检测circMYH8在细胞核和细胞质中的表达情况（图1C）。RT-qPCR结果显示circMYH8主要位于细胞质中（图1D）。我们将circMYH8克隆到pcdna2.1质粒中，构建了circMYH8过表达载体，并培养牛原代肌母细胞进行分化，分别在0天、2天和4天收集RNA（图1E）。RT-qPCR显示circMYH8的表达在整个细胞分化过程中逐渐增加（图1F）。

**circMYH8对牛原代肌母细胞增殖的影响**
为了研究circMYH8在牛原代肌母细胞中的生物学功能，我们使用pcdna2.1载体构建了稳定过表达circMYH8的质粒（pcdna2.1-circMYH8）。转染后，circMYH8在牛原代肌母细胞中显著过表达，但MYH8 mRNA的表达没有变化（图2A和补充图S1B）。牛原代肌母细胞转染后的转染效率见补充图S1C。接下来，我们使用针对circMYH8反剪接区域的短干扰RNA（siRNA）（si-circMYH8）来敲低circMYH8的表达（补充图S1D）。我们确认si-circMYH8能够成功敲低circMYH8的表达，但对MYH8 mRNA的表达没有影响（图2B和补充图S1E）。

**circMYH8对牛原代肌母细胞分化的影响**
我们检测了circMYH8对牛原代肌母细胞分化的影响。CCNE1、PCNA、CCND1和CDK2基因已被报道为增殖标志物（14）。我们在pcdna2.1-circMYH8或si-circMYH8转染后，通过RT-qPCR和Western blot检测了这些基因在牛原代肌母细胞中的mRNA和蛋白水平（图2C-2F）。circMYH8过表达显著降低了这些基因的mRNA（图2C）和蛋白（图2E及支持信息1A）水平。相反，circMYH8敲低显著促进了细胞增殖（图2D、2F及支持信息1B）。CCK-8和EdU增殖测定显示，与对照组细胞相比，circMYH8过表达显著减少了S期细胞的数量（图2G、2I），而circMYH8敲低显著增加了S期细胞的数量（图2H、2J）。流式细胞术分析进一步显示，circMYH8过表达减少了S期细胞的数量（图2K），而circMYH8敲低增加了S期细胞的数量（图2L）。

**circMYH8对牛原代肌母细胞凋亡的影响**
我们还研究了circMYH8对牛原代肌母细胞凋亡的影响。我们收集细胞进行RT-qPCR和Western blot分析，检测凋亡标志物P53、CASP9和BAX的表达。发现circMYH8过表达显著增加了P53、CASP9和BAX的mRNA和蛋白水平（图3A-B及支持信息1C）。Annexin V-PE/7-AAD染色和流式细胞术结果显示，引入circMYH8增加了凋亡细胞的数量（补充图S2A）。然而，circMYH8抑制显著降低了这些基因的mRNA和蛋白水平（图3C-D及支持信息1D）。凋亡测定还显示，si-circMYH8在牛原代肌母细胞中具有抗凋亡特性（补充图S2B）。为了确认circMYH8对牛原代肌母细胞分化的影响，我们使用RT-qPCR和Western blot检测pcdna2.1-circMYH8或si-circMYH8转染后分化标志基因（MYOD1、MYOG、MYHC和DES）的表达（图3E-F）。RT-qPCR结果显示，circMYH8过表达或敲低显著改变了分化标志基因的表达（图3E-F）。与RT-qPCR表达水平一致，circMYH8过表达的牛原代肌母细胞中分化标志基因（MYOD1、MYOG和DES）的水平显著升高（图3G及支持信息1E）。相反，circMYH8敲低后这些基因的水平显著降低（图3H及支持信息1F）。

**circMYH8作为miR-221海绵的作用**
我们进一步探讨了circMYH8调节牛原代肌母细胞的机制。先前的研究表明，circRNA可以作为miRNA海绵，消除其功能。因此，我们使用RNA-hybrid工具预测了两种可能被circMYH8捕获的miRNA（miR-221和miR-24-2）（图4A）。接下来，我们使用双荧光素酶测定法来确定circMYH8与两个预测的miRNAs之间的相互作用，发现circMYH8与miR-221的结合更强（图4B-C）。为了进一步评估circMYH8是否具有海绵状吸收miR-221的功能，我们将野生型和突变型的circMYH8克隆到psi-check2中，构建了双荧光素酶质粒载体。转染到HEK293T细胞后，我们发现miR-221能够抑制野生型circMYH8质粒转染细胞的荧光素酶活性，而突变型circMYH8质粒则没有这种抑制作用（图4B）。此外，我们还发现野生型circMYH8报告基因的荧光素酶活性在转染miR-24-2模拟物的细胞与转染对照报告基因或突变荧光素酶报告基因的细胞之间没有显著差异（图4B）。进一步的荧光素酶报告基因测定表明，miR-221生物传感器可以降低miR-221的荧光素酶活性。然而，在转染pcdna2.1-circMYH8质粒后，荧光素酶活性显著增加（补充图S3A）。虽然miR-24-2也有类似的效果，但miR-221的效果更为明显（补充图S3B）。总之，这些结果表明circMYH8与miR-221的结合比与miR-24-2的结合更强。pcdna2.1/pcdna2.1-circMYH8转染的293T细胞的示意图见补充图S3C。在研究circMYH8与miR-221的结合时，我们发现circMYH8的过表达显著降低了牛原代肌母细胞中miR-221的表达水平（补充图S4A）。而干扰circMYH8后则得到了相反的结果（补充图S4B）。CircMYH8能够竞争性结合miR-221，从而消除miR-221对靶基因P27的内源性抑制作用。circMYH8的高表达与肌肉细胞增殖和P27表达的减少相关。这些观察结果有助于阐明与肌肉发育和疾病相关的分子事件，并揭示肌肉生成的复杂分子机制。尽管我们的当前发现得到了双荧光素酶报告基因测定的支持，但我们认识到荧光原位杂交（FISH）可以提供更精确的circMYH8和miR-221之间空间共定位的证据，从而进一步证实它们的靶向关系。

骨骼肌的新陈代谢受到许多因素的影响。研究骨骼肌的分子机制对动物遗传学的发展具有潜在的意义。骨骼肌在运动、姿势支撑、呼吸和产热中起着重要作用（15）。胚胎骨骼肌的生成包括三个主要阶段：肌母细胞前体细胞增殖并分化为肌母细胞，然后肌母细胞分化并融合成肌管，最终肌管分化为肌纤维。最近的研究逐渐揭示了骨骼肌的调控机制（15）。许多相关基因在骨骼肌发育中起着重要作用，例如MYOD1和肌生成因子5在肌母细胞增殖和分化为肌母细胞的过程中发挥作用。此外，MYOG促进肌母细胞分化为肌管，而肌生成因子6则参与细胞分化和命运决定（15）。此外，miRNA-mRNA以及circRNA-miRNA-mRNA调控网络的发现和构建为深入理解骨骼肌的发育网络提供了帮助（17）。

非编码RNA通常与调节细胞发育有关。越来越多的证据表明，circRNA和miRNA在真核生物中调节基因表达方面起着重要作用。circRNA具有多种作用机制，包括作为ceRNA发挥作用、调节RNA转录、与蛋白质相互作用以及参与蛋白质翻译（16）。已经报道了许多与肌肉发育相关的miRNA功能和机制，例如经典的miRNA 1（miR-1）/组蛋白去乙酰化酶4轴和miRNA 206靶向Pax7。一些miRNA在增殖的肌母细胞中表达较低，但能促进肌母细胞分化，如miR-1（17）和miR-24（18）。研究发现miR-221在增殖的肌母细胞中高表达，但在分化的肌母细胞中表达降低，这与我们的结果一致。此外，许多经典通路与肌肉发育显著相关，例如5'-腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase）和PI3K-AKT通路（19）。

P27曾被认为仅作为周期蛋白依赖性激酶抑制剂（20）发挥作用。然而，深入研究表明，P27在细胞骨架重组和动态、细胞迁移和运动性、凋亡以及自噬中起着重要作用（21）。P27通过差异性调节磷酸化、转录、亚细胞定位和降解来发挥不同作用（22）。P27在肌肉和心肌组织中起着关键作用。miR-221通过抑制P27并激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin）来损害自噬和心脏重塑，加速心肌细胞凋亡（23）。然而，circMYH8在牛肌肉生成中的作用尚未被研究。我们实验室之前对胎儿和成年牛长背肌（longissimus dorsi）的circRNA测序显示，circMYH8在胎儿肌肉组织中高表达。它在体外抑制细胞增殖和细胞增殖周期的进展，表明circMYH8是一个潜在的与肌肉生成相关的基因。这些发现为阐明与肌肉发育和肌肉疾病相关的分子事件提供了新的证据，并揭示了肌肉生成的复杂分子机制。

总之，我们研究了circMYH8在牛骨骼肌发育中的作用和机制。我们的结果表明，circMYH8可以作为miR-221的结合蛋白，靶向P27以抑制牛肌母细胞的增殖并促进其凋亡和分化。此外，体内实验表明，circMYH8的过表达促进了骨骼肌的再生。基于ceRNA理论，我们构建了一个新的circMYH8/miR-221/P27调控网络，进一步证明了circRNA在牛肌肉发育中的ceRNA功能。此外，我们的发现表明circMYH8在细胞核中富集。总的来说，我们展示了circMYH8在牛原代肌母细胞中的作用和调控机制。然而，circMYH8在细胞核中的功能需要进一步研究，并且我们承认不能完全排除其他潜在的miRNA的作用。此外，在这项研究中，我们仅使用了秦川牛作为实验品种，这限制了对品种和年龄相关表达模式的探讨。在未来的研究中，我们还将考虑不同品种之间circMYH8功能的差异。

**实验程序**

**牛原代肌母细胞分离和培养**
从3个月大的牛的长背肌中分离出牛原代肌母细胞。首先，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次并切碎肌肉。然后，通过1500 g离心5分钟提取裂解液。接着，将肌肉样本分散在2倍体积的胰蛋白酶中并在37°C下孵育1.5小时。随后，通过40目筛网过滤混合物，再以1500 g离心5分钟并弃去上清液。将沉淀的细胞用Dulbecco改良的鹰培养基（DMEM）洗涤。最后，将细胞重新悬浮在20%胎牛血清（FBS）培养基中，并通过差速粘附法进行纯化，以便后续实验。

分离后，牛原代肌母细胞在含有DMEM/高葡萄糖、20% FBS（Gibco，美国加州）和2%青霉素-链霉素（HyClone，美国犹他州）的完全培养基中培养。HEK293T细胞系在10% FBS和1%青霉素-链霉素（12）中培养。培养基更换为添加了2%马血清和1%青霉素-链霉素的DMEM以诱导牛原代肌母细胞分化。所有细胞在37°C和5%二氧化碳条件下培养。

**转染实验**
将circMYH8克隆到pcdna2.1质粒中以构建过表达载体。si-circMYH8、miR-221模拟物、miRNA 24-2（miR-24-2）模拟物和阴性对照（NC）从General Biol（中国沈阳万雷）获得。接下来，使用lipofectamine 2000（中国上海UE）将质粒或短RNA转染到细胞中，并按照制造商的说明进行处理。siRNA、模拟物和抑制剂的序列见补充表2。

**Western印迹**
首先，用预冷的PBS洗涤细胞两次，并将其重新悬浮在含有1 mM苯甲基磺酰氟（Solarbio，中国北京）的放射免疫沉淀测定缓冲液中。然后，使用酶标仪器测定蛋白质浓度。接着，将蛋白质样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品加载缓冲液中，并在100°C下煮沸10分钟。最后，将等量的（30 μg）每种蛋白质样品分离在SDS-PAGE凝胶上，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，德国）。PVDF膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭1.5-2小时。然后，在4°C下与相应的初级抗体（补充表3）孵育过夜。用Tris缓冲液 Tween 20（TBST）冲洗三次后，PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔二级抗体（Abmart）孵育2小时。最后，再用TBST冲洗PVDF膜，然后用ECL化学发光溶液（Biosharp，中国北京）可视化蛋白质条带。蛋白质灰度分析使用GAPDH作为标准化对照。

**实时逆转录定量PCR（RT-qPCR）**
使用Trizol试剂提取总RNA，并用标准仪器（Molecular Devices，美国加州Sunnyvale）测定其浓度。使用PARIS核质分离试剂盒（Life Technologies，美国加州Carlsbad）进行核和细胞质的单独分离。RNase R处理是将1 mg总RNA与或不与5 U/μg RNase R一起在37°C下孵育15分钟，然后使用RNeasy MinElute Cleaning Kit（Qiagen，德国Hilden）进行纯化。接着，使用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II（Accurate Biology，中国湖南）将1 μg RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。然后，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国南京）进行RT-qPCR。U6基因用作miRNAs的内参，GAPDH用作circRNAs和mRNAs的内参。差异表达使用2-ΔΔct方法计算。所有RT-qPCR引物见补充表2。

**CCK-8细胞计数试剂盒**
使用CCK-8试剂盒（UE）评估细胞增殖。将细胞接种在96孔培养板中，每孔加入100 μL培养液。每个处理组进行五个独立重复实验。转染12小时后，向每个孔中加入10 μL CCK-8试剂并在37°C下孵育3小时。然后，使用标准仪器（Molecular Devices）在450nm处测量样品吸光度。

**EdU测定**
使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）测定法检测牛原代肌母细胞的增殖。转染后，将细胞加入50 μM EdU溶液中，并按照EdU DNA细胞增殖试剂盒的说明进行处理（Beyotime Biotechnology，中国上海）。每个处理组进行三个独立重复实验。

**双荧光素酶测定**
野生型和突变型circMYH8及其靶基因的3'非翻译区（UTR）通过PCR扩增，并克隆到psi-check2载体中，位于NotI和XhoI限制酶切位点之间。通过测序确认其正确插入。此外，通过将两个连续的miR-221位点插入psi-check2载体中的NotI和XhoI限制酶切位点之间构建了miR-221生物传感器。HEK293T细胞与psi-check2报告基因质粒、miRNA模拟物、pcdna2.1-circMYH8载体或psi-check2-P27共同转染。然后，在转染后24小时使用Dual-Lumi Luciferase Reporter Gene Assay Kit（UE）评估荧光素酶活性。

**免疫荧光（IF）染色**
诱导分化四天后，牛原代肌母细胞用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤三次，然后用4%甲醛固定30分钟。接下来，用含有0.5% Triton X-100的PBS渗透15分钟，再用PBS洗涤，并在4°C下与肌球蛋白重链（MYHC）初级抗体孵育过夜。然后，每次用PBS冲洗三次，每次5分钟，之后与相应的二级抗体孵育2小时。最后，用PBS冲洗三次，并在荧光显微镜（DM5000B；Leica，德国）下观察肌管区域。

**动物实验**
我们小组之前构建了一种由心脏毒素（CTX）诱导的小鼠肌肉损伤模型（19）。我们准备了50 μL转染复合物，包括6.25 μg pcdna2.1/pcdna2.1-circMYH8质粒、12.5 μL转染试剂和25 μL 10%葡萄糖溶液，加水至50 μL。随机选择三只小鼠注射pcdna2.1，另外三只注射pcdna2.1-circMYH8。分别在第三天和第六天采集肌肉组织，并制成石蜡切片进行苏木精和伊红（H&E）染色。

**统计分析**
实验数据表示为至少三次独立实验的平均值±标准误差（SEM）。使用SPSS 23.0（SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥）和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。使用学生t检验比较两组。使用单因素方差分析比较三个或更多组。

**作者贡献声明**
Jia Tang：验证。Ao Qi：验证。Xiaoyan Zhang：可视化、数据分析。Yu Yang：软件。Xixia Huang：写作-审阅与编辑、项目管理。Bizhi Huang：写作-审阅与编辑、资源管理、项目管理。Wuzi Dong：写作-审阅与编辑。Dan Wang：可视化。Shuling Yang：写作-初稿、验证、概念化。Haiyan Yang：可视化、数据分析。Hong Chen：写作-审阅与编辑、资源管理、项目管理。

**伦理声明**
所有动物研究方案均获得了西北农林大学兽医学院动物护理委员会的批准。

**利益冲突**
作者声明没有竞争利益。

**数据可用性**
所有支持本研究结果的数据可向相应作者索取。