通过整合微生物组与代谢组分析，研究人员鉴定出与根肿病抗性相关的关键成分。这些成分存在于一种具有根肿病抗性的甜菜突变体中

《Journal of Agriculture and Food Research》：Integrated microbiome and metabolome analysis identify putative key components associated with resistance in a rhizomania-resistant sugar beet mutant.

　　拉吉蒂拉克·马朱姆达尔 | 埃文·M·朗 | 克里斯托弗·W·罗杰斯 | 卡尔·A·斯特劳斯鲍 | 苏雷什·波克雷尔
美国农业部农业研究服务局西北灌溉与土壤研究实验室，爱达荷州金伯利，83341

**摘要**
由甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）引起并通过Polymyxa betae传播的根肿病会显著降低根系质量和糖分产量。商业品种的抗性主要依赖于Rz1和Rz2抗性基因的使用。在非Rz抗性背景下，根微生物组及其代谢产物的抗性作用尚未完全明了。通过使用抗性EMS突变体（R）系和敏感（S）系、田间自然感染、16S测序及代谢组分析，研究了细菌组和代谢产物对根肿病严重程度的影响。研究发现，在无症状阶段，R系的根际中Enterobacter、Chryseobacterium、Stenotrophomonas和Pseudomonas等细菌属的丰度较高；而在症状出现阶段，Nocardioides和Arthrobacter的丰度较高。根际代谢组分析显示，在无症状阶段，与倍半萜和三萜相关的代谢途径及代谢产物富集，而在症状出现阶段，亚油酸代谢途径更为显著，且R系的这些代谢产物含量高于S系。R系在晚期感染阶段根际中Nocardioides、Ramlibacter和Caulobacteraceae属的丰度增加，这些细菌与R系根中L-甲硫氨酸、异亮氨酸和月桂酸的含量呈正相关。结果表明，根系代谢产物可能以基因型依赖的方式重塑根际细菌组，从而影响根肿病的症状。

**1. 引言**
甜菜（Beta vulgaris L.）及其相关产业为美国贡献了230亿美元的经济价值[1]。该作物主要种植在美国中西部地区，约占国内糖产量的55%。在影响甜菜生长的多种疾病中，根肿病是一种主要的病毒性疾病，会显著降低根系质量和糖分产量[2, 3, 4, 5]。该病由RNA病毒——甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV；Benyvirus necrobetae）引起，由Plasmodiophoridae类菌Polymyxa betae传播[6]。田间对根肿病的敏感性会增加收获后的病害损失和糖分损失[7]。甜菜根部的典型根肿病症状包括主根上出现大量侧根、主根呈酒杯状、维管组织变褐以及植株生长受阻[8]。此外，在根部严重受损的情况下，叶片会出现黄色、直立且狭窄的症状，植株也会出现萎蔫[9, 10]。

商业品种的抗性主要依赖于Rz1和Rz2抗性基因[4, 11, 12, 13]。然而，全球各地的甜菜种植区均报告了Rz1抗性失效的菌株[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]。其他方法（如化学控制和管理措施）无法在商业规模上有效控制根肿病[22, 23]。鉴于基于非Rz的抗性手段有限，探索根系和根际微生物组及其生化组成与宿主植物遗传背景在根肿病抗性中的作用对于未来的病害管理策略至关重要。根与根际微生物组之间的相互作用对宿主植物抵抗土传病原体的能力具有重要意义[24, 25]。根系分泌物中的糖类、有机酸、氨基酸等物质在根际中可作为信号或底物，以有益的方式招募和重塑根际微生物组，从而在病害条件下保护植物[26]。例如，在烟草（Nicotiana benthamiana Domin和Nicotiana tabacum L.）中，Bacillus amyloliquefaciens NC6菌株产生的PeBA1蛋白诱导了对烟草花叶病毒（TMV）和真菌病原体Botrytis cinerea的系统性抗性[27]。番茄根际中Ammoniphilus、Bacillus、Bosea、Candidimonas、Flexivirga和Brevundimonas等细菌属的丰度增加可减少由番茄细菌性萎蔫病原体引起的病害症状[28]。微生物组在宿主植物抵抗病原体（包括病毒）中的作用受植物遗传背景、组织特异性代谢组成、微生物组的时空分布及其与宿主防御信号系统的相互作用等因素影响[29, 30, 31]。了解病原体感染期间微生物组的重组机制有助于开发新的防治策略，无论是通过宿主基因改造还是应用土壤改良剂、覆盖作物或其他种植策略。

当Polymyxa betae感染甜菜根部并将BNYVV传播给植物时，任何与根系和根际相关的因素（如微生物组和代谢组）都可能有助于未来开发抗根肿病品种和病害管理。根系微生物组和根际分泌物在宿主植物抵抗土传病原体（包括病毒）中的作用已被证实[32, 33, 34]，这可能通过改变根际微生物群落实现。根系和根际微生物组还与叶部微生物组相互作用，从而影响病害抗性[35, 36]。关于甜菜根肿病抗性的微生物组研究仍非常有限。本研究通过比较甜菜RNAi（针对BNYVV）系与对照植物，探讨了根系微生物组的变化是否对根际微生物组产生负面影响[37]。目前尚不清楚根系微生物组和代谢产物如何与根际微生物组及代谢产物相互作用，并在甜菜抗性中发挥作用。由于商业品种中的抗性遗传资源有限，主要依赖于Rz抗性等位基因，因此发现新的抗性来源（非Rz抗性）具有重要意义。我们最近报道了一种抗性EMS突变体KEMS12，以及来自同一遗传背景的 moderately susceptible EMS突变体KEMS09和另一种来自不同遗传背景的 highly susceptible 突变体KDH13[37]。这些突变体被用于研究微生物组和代谢产物在根肿病抗性中的作用。通过田间自然根肿病感染以及两个不同感染阶段（早期/无症状期和晚期/症状期）的代谢组分析，我们发现了根系代谢产物在重塑根际微生物群落和代谢过程中的潜在作用，这些作用可能与根肿病抗性相关。

**2. 材料与方法**
2.1. 根肿病苗圃中的植物生长、病害评估及样本采集
品种选择基于先前的研究[38, 39, 40, 41, 42, 43]。本研究使用的甜菜品系具有高度纯合性，KEMS12已在ID州金伯利的USDA-ARS根肿病苗圃中经过多个生长季节的抗性评估。研究使用了抗根肿病的EMS突变体育种系KEMS12（PI 672570）、 moderately susceptible 的EMS突变体育种系KEMS09（PI 672569）以及无关的 highly susceptible 双倍体系KDH13（PI 663862）[44]。在8月下旬的评估中，KEMS09与KDH13在病毒载量上没有显著差异，但KEMS09的生长受阻更为严重[38]。因此，KEMS09被认定为 moderately susceptible 线，KDH13被认定为 highly susceptible 线。使用[38]中的相同实验样本研究了微生物组和代谢组在根肿病抗性中的作用。该苗圃使用Portneuf粉壤土，依靠自然BNYVV感染来诱导根肿病症状。秋季使用Terrano凿式犁翻地，春季施肥（每英亩52公斤氮肥和64公斤磷酸二氢钾），然后进行耙地和平整作业。7月第一周，将温室中24个育苗盘（每个育苗盘24株，共8个育苗盘/基因型）中的两周龄甜菜幼苗移植到田间。每个基因型种植在四个地块中，每个地块包含四行，行间距为0.6米。作物管理遵循爱达荷州南部的标准栽培方法。8月第四周记录了根肿病的叶片症状（黄化、叶片直立且狭窄、生长受阻），随后手工挖掘根部以收集样本。根肿病症状的表型评估按照[11]中的方法进行。由于爱达荷州南部的甜菜种植区土壤中存在一定程度的根肿病感染，因此研究了两个病害发展阶段（早期：无症状期；晚期：症状期）以及抗性和敏感品系。在早期（8月第一周；移植后4周；无明显病害症状）和晚期（8月第四周；移植后8周；有病害症状）分别采集叶片和根部样本，样品在液氮中快速冷冻后储存在-80°C的冷冻柜中，以待DNA/RNA和代谢物提取。样品使用Geno/Grinder 2010（SPEX SamplePrep；美国新泽西州梅楚肯）在超低温条件下粉碎。

2.2. 基因组DNA提取、PCR扩增及16S rRNA测序
从甜菜叶片、根部和土壤（根际）样本中提取基因组DNA，使用Plant/Fungi DNA Isolation Kit（Norgen Biotek Corp., 加拿大索罗尔德）和Soil DNA Isolation Plus Kit（Norgen Biotek Corp., 加拿大索罗尔德）按照制造商的协议进行。样本储存在-20°C直至进一步使用。引物对341F_5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和805R_5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′用于扩增16S rRNA的V3–V4高变区[45]。引物5′端标记有样本特异性索引条形码和通用接头。PCR反应体积为25 μL，包含25 ng模板DNA、200 μM dNTP以及每条引物各0.5 μM。PCR条件为：初始变性98°C 30秒；32个循环，每次变性98°C 10秒，退火54°C 30秒，延伸72°C 45秒；最后延伸72°C 10分钟。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳验证，使用AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics, 美国丹弗斯）纯化，并通过Qubit（Invitrogen, 美国沃尔瑟姆）系统定量。扩增文库的大小和数量分别使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, 美国圣克拉拉）和Illumina的Library Quantification Kit（Kapa Biosciences, 美国沃本）进行测定。文库在NovaSeq 6000平台上进行测序，采用配对末端读取（2 × 250 bp），遵循制造商的协议（LC Sciences, 美国休斯顿）。

2.3. 数据分析
16S测序数据使用LC Sciences（美国休斯顿）的微生物组数据分析流程进行处理。包括：（1）通过最大预期误差阈值1.0去除短序列（<150 bp）和模糊碱基调用来评估读段质量；（2）去除测序/PCR错误和嵌合序列后对唯一序列进行分类；（3）去重复，将所有相同序列合并为唯一序列读段；（4）分配零半径操作分类单元（zOTU）。最终zOTU的分类使用BLASTn算法与NCBI数据库进行比对[46]。根据唯一条形码将16S测序得到的配对末端读段分配给相应样本。随后去除条形码和引物序列，并使用FLASH（v1.2.11）[47]合并读段。使用fqtrim软件（v0.94）对原始读段进行特定过滤以获得高质量数据。嵌合序列使用Vsearch软件（v2.3.4）进行过滤。去重复后得到特征序列，相似度≥97%的序列被分配到相同的OTU。通过SILVA（版本132）分类器根据相同序列对每个OTU的丰度进行归一化处理。每个样本中物种多样性的复杂性通过使用alpha多样性指数、观察到的_OTUs和Shannon指数来衡量。这些指数是使用QIIME2（v1.8.0）[50]测量的。为了估计beta多样性，使用了zOTU丰度表，并通过主坐标分析（PCoA）进行可视化。聚类分析也是用QIIME2完成的。图表是用R包（v3.5.2）构建的。BLAST算法用于序列比对，特征序列使用SILVA数据库（版本138；2019）进行注释。线性判别分析效应大小（LEfSe）被用来识别不同处理组中差异丰富的菌科，以潜在的生物标志物/识别[51]。通过greengenes 13_8数据库获得的分类特征的相对丰度被用作使用huttenhower服务器进行LEfSe分析的输入[52]。默认的LDA效应大小alpha值（p = 0.05）和LDA得分（2.0）设置被用来识别组间的显著差异。为了功能性地分配微生物群落，使用了通过重建未观察状态进行群落系统发育研究（PICRUSt）算法[53]。greengenes 13_8数据库被用来聚类封闭参考OTUs，得到的‘.biom’文件被用作PICRUSt的输入[52]。随后对输入的OTU表进行了归一化，使用京都基因组与基因组百科全书（KEGG）数据库[54, 55]进行了宏基因组功能预测。构建了一个相关网络，以找出根部和根际代谢物以及根际细菌在早期和晚期感染阶段之间的联系。计算了数据集之间的Spearman相关性，并过滤出仅包含最小相关系数为0.75的关系。网络结构和拓扑分析是使用R包igraph[56]生成的，并使用ggraph[57]进行可视化。正相关和负相关在网络中分别用正链接和负链接表示。基于网络拓扑，使用节点度、接近度和介数来识别假定的关键代谢物和微生物属。2.4. 未靶向代谢组分析从约50毫克（鲜重）的细磨甜菜叶和根组织以及土壤（根际）样本中提取了800微升80%甲醇中的代谢物。样品用涡旋混合器混合，在65赫兹下研磨180秒，然后在4摄氏度下以40千赫兹超声处理30分钟。接下来将样品在-40摄氏度下孵育1小时，涡旋30秒，再在4摄氏度下孵育30分钟，最后在4摄氏度下以13,800 x g离心15分钟。上清液转移到新的聚丙烯离心管中，并在-40摄氏度下孵育1小时。在4摄氏度下以13,800 x g离心15分钟后，从每个样本中取200微升上清液，加入5微升内标（0.14毫克/毫升2-氯苯丙氨酸），然后转移到注射小瓶中。使用LC-MS（Waters，UPLC；Thermo，Q Exactive）系统和Acquity UPLC HSS T3（2.1 × 100毫米；1.8微米）色谱柱进行代谢物分析。色谱分离条件为柱温40摄氏度，流速0.300毫升/分钟，流动相组成A：水（0.05%甲酸）和B：乙腈，进样体积5微升，自动进样器温度4摄氏度。流动相梯度洗脱程序见表S1。电喷雾离子化（ESI；正负离子模式）参数包括加热器温度300摄氏度，鞘气流量45阿巴，辅助气体流量15阿巴，扫描气体流量1阿巴，喷雾电压3.0千伏，毛细管温度350摄氏度，S-Lens RF级别30%。扫描模式参数为一级全扫描（m/z 70～1050）和数据依赖的两级质谱扫描（dd-MS2，TopN = 10）。扫描在70,000（MS1）和17,500（MS2）分辨率下进行。原始数据使用ProteoWizard转换为mzXML格式，然后使用R开发的内部程序（Lifeasible；美国纽约州Shirley）进行处理。峰值检测、提取、对齐和积分使用XCMS完成。使用内部MS2数据库（LifeasibleDB）对代谢物进行注释。截止值设定为0.3。原始文件（.raw）被导入Compound Discoverer3.1（CD）进行光谱处理和数据库搜索，以进行检测到的代谢物的定性和定量分析。进行了包括主坐标分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）在内的多变量分析，以识别不同组之间的代谢物差异。使用层次聚类（HCA）和代谢物相关性分析来识别样本和代谢物之间的关系。通过富集与特定代谢途径相关的代谢物来确定代谢物的生物学意义。使用R中的‘pheatmap’包[58]（版本1.0.12）和默认参数（除了比例 = “row”（https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap）来可视化代谢物。使用R中的Cor.test函数进行相关性分析。2.5. 宏量和微量营养素分析使用EPA方法3052[59]消化植物组织，并通过电感耦合光学发射光谱（ICP-OES）（PerkinElmer Optima 4300 DV）测定总P、K、Ca、Mg、Mn、Na、Al、Fe、S、B、Zn和Cu。3. 结果和讨论从抗根肿病和易感品系的甜菜土壤（根际）、根和叶样本中收集数据，以了解与根肿病抗性相关的细菌组和代谢组在早期和晚期感染阶段的空间和时间变化。质量控制后，平均每个样本约有83,000个原始标签和约75,000个有效标签被映射到16S rRNA数据库[49]，并得到零半径操作分类单元（zOTUs）（表S2）。从16S测序获得的稀释曲线（图S1）显示，所有样本中观察到的_OTUs在特定序列数量处达到稀释/平台期。这表明更深入的测序不会增加样本中细菌的OTU数量。3.1. 抗性品系与易感品系的根际、根和叶中的细菌门和属的相对丰度随着感染阶段的变化在根际、根和叶中，共检测到30个主要的细菌门。只有20个门在所有样本中的丰度至少为0.1%或更高（图1A；表S3）。样本中主要的细菌属总数为30个，所有细菌属的丰度都>0.1%，并且随着样本类型的不同而变化（图1B；表S4）。总体而言，在根际样本中观察到更高的细菌多样性和丰度。在早期感染阶段的根际（图S2），主要的细菌门是酸杆菌门和蓝细菌门（约7-11%），其次是浮霉菌门和Gemmatimonadota门（4-7%）。其他一些门的丰度差异≤1%，并且在R品系中通常较低，除了Bdellovibrionota门在R品系中较高（与S品系相比）。在晚期感染阶段，浮霉菌门的丰度更高（5-10%），其次是Patescibacteria门（<2%）。在早期感染阶段的根中（图S3），蓝细菌门（83-86%）和变形菌门（12-16%）占主导地位，变形菌门在R品系中的丰度更高（与S品系相比）。在晚期感染阶段，放线菌门的丰度更高（1-2%），其次是Verrucomicrobiota门和Myxococcota门（≤0.25%）。在早期感染阶段的叶中（图S4A），蓝细菌门非常丰富（98%），在MS品系中最高，其次是变形菌门（1%）。而在晚期感染阶段的叶中（图S4B），拟杆菌门占主导地位（0.1-0.3%）。其他细菌门在R品系的根际中的丰度≤0.01%。在R品系的早期感染阶段，Chryseobacterium、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Acidovorax和Enterobacter等细菌属的丰度较高（图2A）。而在R品系的根际中，Arthrobacter、Nocardiodes、Ramlibacter和Planctopirus等在R品系的根际中较高（与S品系相比），在某些情况下在MS品系的根际中也是如此（图2B）。在R品系的早期感染阶段的根中（与S品系相比），Desulfovibrio、Shinella、Akkermansia、Bacteroidota和Mitochondria等属的丰度较高（图2C）。在晚期感染阶段（图2D），R品系的根中Chloroplast（未分类）、Shinella、Bifidobacterium、Agathobacter、Methylobacillus、Collinsella、UCG-002等较高。在早期感染阶段的叶中（图S4A），R品系的叶中Mucispirillum、Quinella、Monoglobus和Treponema等细菌属的丰度较高（与S品系相比）。而在晚期感染阶段的叶中（图S5B），R品系的叶中Bifidobacterium和Mycobacterium的丰度较高（与S品系相比）。下载：下载高分辨率图像（441KB）下载：下载全尺寸图像图1. 抗根肿病的甜菜基因型在细菌门和属的相对丰度上与易感品系存在差异。图1显示了在早期和晚期感染阶段，叶片（Lf）、根（Rt）和土壤（S；根际）中细菌门（A）和细菌属（B）的平均相对丰度。KDH13（13）：高度易感；KEMS09（09）：中度易感；KEMS12（12）：高度抗性品系；每个重复样本来自8个个体；E：早期；L：晚期。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 在早期感染阶段根际（A）；晚期感染阶段根际（B）；早期感染阶段根（C）；晚期感染阶段根（D）中显著改变的细菌属的相对丰度。KDH13（13）：高度易感；KEMS09（09）：中度易感；KEMS12（12）：高度抗性品系；每个重复样本来自8个个体。数据是4个重复样本的平均值±标准误差（每个重复样本来自8个根）；P < 0.05*在特定感染阶段内高度易感（13）和抗性（12）/中度易感（09）品系之间；g：属；E：早期；L：晚期；S：土壤（根际）；Rt：根。这里呈现的微生物组数据显示，R品系（与S品系相比）的根和叶中的细菌组存在差异调节，这种调节随着早期和晚期感染阶段而变化。在R品系的根际和叶中，如Pseudomonas等细菌属在早期感染阶段的丰度较高，而Arthrobacter和Nocardiodes在晚期感染阶段的丰度较高，它们在抵抗土传病原体方面的潜在作用与其他作物的早期发现一致。根际细菌在疾病抗性中的作用因作物和目标病原体而异。对常见豆类品种的根际微生物组分析显示，如Pseudomonadaceae、Bacillaceae、Solibacteraceae等细菌科的丰度较高[60]。抗土传真菌病原体Verticillium dahliae Kleb.和Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid的草莓（Fragaria x ananassa Duchesne ex Rozier）品种显示放线菌（如Arthrobacter、Nocardioides）和未分类的酸杆菌（如Gp6、Gp16）的丰度较高[34]。此外，抗M. phaseolina的品种显示Pseudomonas的丰度较高。根际中特定细菌属的存在已被证明可以通过增强抗氧化潜力来提高宿主植物的抗病性。在番茄中，Pseudomonas、Bacillus、Azotobacter等细菌属的丰度较高，增加了过氧化物酶和多酚氧化酶的产生，从而提高了对Alternaria solani Sorauer的抗性[61]。在根际中Ramlibacter、Burkholderia和Comamonas的丰度较高与甜椒（Capsicum annuum L. var. grossum）的Phytophthora枯萎病症状呈强负相关，并改善了果实质量和土壤性质[62]。R品系根中Desulfovibrio、Shinella、Akkermansia、Bacteroidota、Bifidobacter等细菌属的丰度较高可能表明它们在根肿病抗性中的作用，尽管尚不完全清楚这些细菌如何有助于植物抵抗土传病原体。需要进一步的研究来明确它们在甜菜根肿病抗性中的作用。总体而言，这里呈现的数据表明根际和根细菌在抵抗土传病原体方面具有重叠和独特的角色，并展示了它们随着抗性甜菜品系中根肿病进展的时间调节。根际和根细菌的一些重叠作用包括对抗土传病原体的拮抗作用、促进植物生长从而增加抗性等[26]。根际细菌的独特作用包括例如塑造土壤化学和微生物网络。而根细菌的独特作用包括与植物防御网络的相互作用，占据内部生态位（例如放线菌）可以排除病原体。3.2. 根据基因型和感染阶段的不同，在样本中观察到细菌多样性的变化使用Observed_OTUs和Shannon指数分析了R品系和S品系在土壤（根际）、根和叶中的alpha多样性。总体而言，除了少数特殊情况外，各样本之间的α多样性没有显著差异。在早期感染阶段，R系和S系根部的细菌多样性存在显著差异；而在晚期感染阶段，MS系和S系根部的细菌多样性也存在显著差异（表1）。表1显示了在早期（E）和晚期（L）感染阶段，抗性（KEMS12: 12）、中等敏感性（KEMS09: 09）和敏感性（KDH13）甜菜品系在土壤（rhizosphere; S）、根部（Rt）和叶片（Lf）样本中的α多样性。数据为4次重复实验的平均值±标准误差（每次重复实验代表8株甜菜植物）；Student’s t检验：p < 0.05，表示在同一样本类型和感染阶段内，敏感性品系与其他（12, 09）品系之间存在差异。

β多样性分析用于估计细菌群落结构，考虑了它们之间的相对丰度和系统发育关系。聚类树状图和主坐标分析（PCoA）被用来比较和可视化样本间的微生物群落。图3A显示了不同样本之间的层次关系。PCoA1（92.81%）和PCoA2（2.92%）之间的变化表明不同处理组之间存在分离（图3B）。加权UniFrac距离的比较显示，在晚期感染阶段，R系和S系根部的细菌群落存在显著差异（Student’s t检验：p < 0.05）。MS系在早期感染阶段的叶片和根部以及土壤样本中也与S系存在显著差异（图3C）。

线性判别分析效应大小（LEfSe）被用来识别与本研究中使用的R系相关的潜在生物标志物。在早期感染阶段，R系土壤中富集了Flavobacteriales、Chryseobacterium、Pseudomonas等细菌类群（图S6A和B）。在晚期感染阶段的土壤中，与R系相关的细菌类群包括Planctomycetota、Pirellulaceae等（图4A, B）。在早期感染阶段，R系根部富集了Proteobacteria、Rickettsiales等细菌类群（图S7A和B）。在晚期感染阶段的根部，与R系相关的细菌类群包括Chloroplast（未分类）、Brevundimonas等（图4C, D）。总体而言，叶片的变化比土壤和根部小，且未识别出R系的特定生物标志物（图S8）。

样本中的细菌多样性分析显示，R系的α多样性变化小于β多样性（表1；图3, 4）。这表明R系和S系之间的差异不在于个体微生物组的整体复杂性，而在于这些群落的特定组成，如β多样性分析所示。进一步的生物标志物分析（LEfSe）显示，在早期和晚期感染阶段，R系的根际和根部富集了Flavobacteriales、Planctomycetota、Proteobacteria、Pseudomonas、Cyanobacteria等细菌类群（图4）。这些细菌类群及其在抗性中的潜在作用与先前的研究结果一致。一种抗土壤传播病原体Ralstonia solanacearum的番茄品系在其根际中表现出较高的Flavobacterium菌株丰度[63]。抗叶枯病的玉米植株在其根际中表现出较高的Planctomycetes和Proteobacteria类群丰度[64]。在番茄（Solanum lycopersicum L.）中，根际的抗生素处理和与斑点病原体Xanthomonas perforans的共接种减少了属于Cyanobacteria门的Cylindrospermum属的根际细菌数量，并增加了疾病严重程度，与未用抗生素处理的对照植株相比[35]。在叶片和根部（相对于土壤）中，Cyanobacteria和Proteobacteria门的相对较高丰度以及chloroplast_unclassified和mitochondria_unclassified（属水平）的相应丰度可以归因于植物叶绿体和线粒体相关基因的扩增。实际上，这两种细菌门都在根际（土壤）样本中被检测到，这表明它们在植物样本中的存在可能不仅仅是由于甜菜基因的扩增。其他研究也报告了这两种细菌门在甜菜组织中的高相对丰度及其在病原体抗性中的作用[65, 66, 67]。这里呈现的结果以及之前的研究结果可能表明这些细菌类群不仅在抗真菌病原体方面有重要作用，而且在抗BNYVV的plasmodiophorid载体P. betae方面也有重要作用。

3.3. 非靶向代谢组分析显示，R系根际中特定代谢物的富集随感染阶段而变化。由于在同一根肿病苗圃中生长的R系和S系之间存在不同的根际细菌组，因此对R系和S系的根际进行了非靶向代谢组分析，以研究不同感染阶段下与根肿病抗性和敏感性基因型相关的土壤代谢变化。图S9显示了样本的PCA分析和聚类结果。总体而言，两种基因型在早期和晚期感染阶段都表现出不同的聚类模式。图5显示了R系和S系之间差异较大的选定代谢物。在早期感染阶段，R系根际中高度富集的代谢物包括甲基反式苯乙烯酮、L-三甲酸-1,4-内酯、L-苹果酸、异佛尔酮、普雷斯帕坦、甜菜碱、6-羟基烟酸等（图5A）。仅在S系中高度富集的代谢物包括磷酸、己内酰胺等。在晚期感染阶段，R系中主要富集的代谢物包括甲基反式苯乙烯酮、茴香脑、反式-反式-2,4-庚二烯醛、壬二酸等（图5B）。与早期感染阶段相比，晚期感染阶段R系根际中代谢物的总数明显较少。一些代谢物如茴香脑、甲基反式苯乙烯酮在R系中在早期和晚期感染阶段都较高。

阴性离子模式主要识别了有机酸和其他代谢物（图S10A），这些代谢物在R系根际（相对于S系）中较高（图S10B）。在早期感染阶段，R系根际中较高的有机酸包括2-氧戊二酸、N-乙酰谷氨酸、左旋戊酸、L-苹果酸等。在晚期感染阶段，仅在R系中较高的根际代谢物包括甘草酸、(Z)-5,8,11-三羟基十八-9-烯酸、9-HpODE、13-HODE等。在早期感染阶段，根际中与倍半萜和三萜代谢途径相关的代谢物富集（图6A）。晚期感染阶段，根际中与亚油酸代谢途径相关的代谢物富集（图6B）。在负离子模式下，仅在早期感染阶段显示出与精氨酸和TCA循环相关的代谢物（图S11A）。

根际在宿主植物对抗土壤传播病原体方面起着重要作用，因为该区域是植物根系与周围土壤之间的界面[25]。植物在根际释放的代谢物如有机酸、糖类、氨基酸可以通过光合作用固定的总碳的40%左右。根际中代谢物的富集代表了根系和微生物来源代谢物的组合效应。通过根系分泌物释放到根际的代谢物可以作为信号和/或底物来吸引特定的微生物。R系和S系基因型的根际代谢组分析（图5, 6）显示了不同感染阶段下的代谢变化。R系根际中与倍半萜和三萜途径相关的代谢物（例如普雷斯帕坦）的较高富集可能表明植物在早期感染阶段针对BNYVV的土壤传播载体P. betae采取了化学防御策略。许多倍半萜和三萜已被证明通过影响细胞壁完整性和其他细胞功能而对真菌和细菌病原体具有直接抑制作用[68]。在甜菜组织中，这些细菌门的相对高丰度及其在病原体抗性中的作用已被其他研究报道[65, 66, 67]。这里呈现的结果以及之前的研究结果可能表明这些细菌类群不仅在抗真菌病原体方面有重要作用，而且在抗BNYVV的plasmodiophorid载体P. betae方面也有重要作用。

3.4. 相关性网络分析显示，特定根际细菌与根代谢物之间以及根际细菌与与抗性相关的根代谢物之间存在强烈的正相关关系。为了理解根肿病抗性中根际细菌与根代谢物之间的关系，在疾病症状最严重的晚期感染阶段进行了相关性网络分析。网络分析识别出不同的模块（表S5–S8），这些模块由细菌-根代谢物组成，并被认为与R系的抗性相关。本研究中使用的根代谢组数据没有进行深入讨论，因为我们的重点是理解根际中与根肿病抗性相关的细菌与特定根源代谢物之间的关系。图S12显示了R系和S系之间差异较大的根代谢物。在根际中观察到几种细菌属与根代谢物之间存在强烈的正相关关系，这些细菌属和代谢物仅在R品系的晚期感染阶段表现出较高的相对丰度（图7A；表S5）。在正离子模式下完全解析的根代谢物显示出强烈的相关性，例如Planctopirus与L-异苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、L-焦谷氨酸等氨基酸以及LysoPC（18:3）、甜菜碱等代谢物呈正相关（>0.80）。其他细菌属如Muribaculaceae与次黄嘌呤呈正相关（0.80），Ramlibacter与异亮氨酸和3-羟基苯乙酸呈正相关（0.77），Nocardioides与L-甲硫氨酸呈正相关（0.76）。

根代谢物在负离子模式下完全解析，显示出强烈的相关性，例如Planctopirus与甲羟戊酸、3-脲基丙酸和L-天冬氨酸呈正相关（0.80-0.87）（图7B；表S6）。Caulobacteraceae与(Z)-9,12,13-三羟基十八-15-烯酸、β-亮氨酸和月桂酸等根代谢物呈正相关（0.83-0.87）。其他属如Ramlibacter与乙基甲酸、L-天冬氨酸和月桂酸等根代谢物也呈正相关（0.81-0.86）。还进行了相关性网络分析，以了解根际代谢物与R品系中抗根肿病细菌富集之间的关系。尽管有一种代谢物（正离子模式）没有与R品系中抗根肿病细菌属表现出正相关（图S13A；表S7），但在R品系中根际细菌与根际代谢物之间存在一些特定趋势（负离子模式），与S品系相比（图S13B；表S8）。Ramlibacter与(Z)-5,8,11-三羟基十八-9-烯酸呈正相关（0.77），Planctopirus与13-HODE和(Z)-5,8,11-三羟基十八-9-烯酸等呈正相关。

在包括黄瓜、sesbania和番茄在内的多种作物中，已经显示出根来源的氨基酸（如色氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸）与有益根际细菌（如Bacillus sp.、Azorhizobium sp.和Pseudomonas sp.）之间的关联[74]。氨基酸可以作为许多有益根际细菌的主要氮源，用于合成蛋白质，或者被分解以提供能量。其他根代谢物如有机酸（富马酸、苹果酸、柠檬酸等）、糖（蔗糖、葡萄糖等）、糖醇（例如肌醇）和黄酮类化合物（山柰酚、芹菜素等）已被证明可以通过作为主要的碳源、诱导趋化反应和生物膜形成等方式促进单子叶和双子叶植物的有益细菌生长。这里的数据展示了甜菜根代谢物与根际抑制疾病细菌之间的复杂关系，并且这种关系与根肿病的发展有关。其他研究也报道了甜菜基因型依赖的根分泌物或外源处理在招募有益根际细菌方面的类似作用[75, 76]。本研究还确定了甜菜根代谢物（如L-异苏氨酸、天冬酰胺、L-甲硫氨酸、甲羟戊酸、L-天冬氨酸、月桂酸等）与已知抗根肿病细菌（如Caulobacteraceae、Planctopirus、Muribaculaceae、Nocardioides等）之间的关系，为未来研究提供了机会。未来可以测试使用覆盖作物来向土壤提供这些植物代谢物，以探讨它们在促进有益根际细菌方面的作用，这些细菌可能抑制P. betae的丰度并提高抗根肿病能力。

3.5. R品系叶片中特定矿物质元素的积累量较高，与关键根际细菌之间存在较高的正相关关系。由于根肿病会损害甜菜根的维管系统，从而影响养分吸收和运输，我们分析了R品系和S品系根部和叶片中的矿物质元素含量。目的是确定感染期间养分吸收和分配是如何受到影响的。我们还研究了植物中特定矿物质的积累是否与关键根际细菌有关。在叶片中检测到的不同矿物质元素中，含量最高的（>12,000 mg/kg DW）是Ca、Na和K，其次是（>12,000 mg/kg DW）P、S、Al和Fe（图8）。其他检测到的微量元素含量低于<500 mg/kg DW。在早期和晚期感染阶段，R品系和MS品系的叶片中Na和S的细胞浓度较高。其他检测到的元素如Al、Fe、P在R品系和MS品系的叶片中含量较低。

根中矿物质元素的相对丰度（图8）与叶片中的相对丰度不同。总体而言，K的细胞浓度最高（16,000-25,000 mg/kg DW），其次是Na、Al、Ca、Fe、Mg、P和S。其他检测到的元素在R品系（相对于S品系）在晚期感染阶段的含量较低。叶片中的Na含量与根际细菌属如Caulobacteraceae和Ramlibacter呈中度正相关（0.60-0.65），与Planctopirus呈强正相关（0.85）。K和S与Muribaculaceae、Caulobacteraceae、Arthrobacter、Nocardioides等细菌属呈中度正相关（0.36-0.69）。所有这些细菌属在R品系中的含量较高。

R品系叶片中S和Na的积累量较高（图8I，K），无论是在早期还是晚期感染阶段（图8I，K）。硫在植物生长和防御中起着重要作用[77, 78]。在番茄中，硫通过参与MAPK、激素信号传导、氨基酸生物合成等途径，在植物防御反应中发挥作用（立即响应）。一天后，谷胱甘肽代谢、生长素和类固醇生物合成等途径在施用硫的植物中得到显著增强。叶面施用硫溶液可以增加对番茄黄化曲叶病毒和干旱的抵抗力。这表明硫在植物生物和非生物胁迫耐受性中具有多重作用。我们的数据可能表明硫对甜菜中的BNYVV具有保护作用。与S不同，叶片中Na的积累量过高可能是氧化应激的来源[79]。R品系在早期和晚期感染阶段都积累了比S品系更多的叶片Na（图8I）。R品系叶片中对根肿病症状的更高抵抗力可能表明这种升高的Na水平在该品系的可耐受范围内，可能是次要效应，而不是Na对BNYVV抵抗力的直接作用。甜菜叶片中的磷浓度通常保持不变或随时间减少[80]，而在中度敏感品系（KEMS09）中，磷浓度随时间增加，尤其是在敏感品系（KDH13）中，从早期到晚期叶片阶段积累量最高，超过了该地区先前研究的最大值4600 mg/kg[80]。叶片中过量的磷积累可能表明由于根肿病敏感性，代谢途径和转运机制受到干扰，从而进一步增加敏感性。我们的观察结果与其他研究一致，这些研究表明较高的磷积累会增加疾病敏感性[81, 82]。总体而言，与R品系相比，S品系的根中Fe、K、Na、Mg、Cu、Zn等矿物质的积累量较高。这可能表明根部的矿物质平衡受到干扰，根部和叶片之间的矿物质平衡也受到影响。植物在根部积累许多这些矿物质以增强防御反应并防止病原体向地上部转移，但在疾病条件下，高量的矿物质可能会对解毒过程产生负面影响，增加敏感性[83]。这里的数据展示了根肿病抗性和/或敏感性以及不同感染阶段甜菜品系中矿物质离子平衡之间的关系。R品系叶片中S和K的较高积累为未来测试这些矿物质作为叶面施用来缓解根肿病症状提供了可能性。

4. 结论通过全面的微生物组和代谢组分析，并使用抗根肿病和敏感品系，我们确定了与R品系抗根肿病相关的根际和根相关细菌，如Pseudomonas、Stenotrophomonas、Arthrobacter、Nocardiodes和Ramlibacter。网络分析确定了根来源的代谢物，包括氨基酸（L-异苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、L-甲硫氨酸等）和其他化合物（LysoPC、甜菜碱、月桂酸、(Z)-9,12,13-三羟基十八-15-烯酸、13-HODE等），这些代谢物与某些有益根际细菌菌株之间存在强烈的正相关，可能表明它们在重组根际细菌群落中的调节作用。Muribaculaceae、Arthrobacter和Nocardioides在根际中的较高丰度以及与R品系叶片中S和K积累的正相关可能表明它们在吸收和分配这些矿物质方面的作用。本工作中鉴定出的关键根代谢物可以作为抗根肿病的潜在生物标志物，但需要进一步验证。同样，未来使用本研究中鉴定的细菌菌群将确定它们在抗根肿病中的具体作用。我们的工作为研究能够向土壤中添加重要植物代谢物的覆盖作物提供了机会，以改善抗根肿病（对抗P. betae！）细菌菌株的效果。

作者贡献声明：
Rajtilak Majumdar：撰写——原始草稿、监督、方法学、调查、正式分析、概念化。
Carl A. Strausbaugh：撰写——审阅与编辑、调查。
Suresh Pokhrel：撰写——审阅与编辑、可视化、数据管理。
Evan M. Long：撰写——审阅与编辑、方法学、正式分析、数据管理。
Christopher W. Rogers：撰写——审阅与编辑、方法学。

伦理声明：本研究未对人类或动物进行实验。

利益冲突声明：作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

数据可用性：16S微生物组数据已上传至NCBI网站（表S9）。样品使用的条形码列在表S10中。这些序列在上传到NCBI网站之前已从每个样品中去除。

资金支持：本研究部分得到了美国农业部（USDA）农业研究服务（ARS）的支持。