A functional SNP rs12718466 in APOA1 promoter modulates gene expression via interaction with SOX7

《Journal of Biological Chemistry》：A functional SNP rs12718466 in APOA1 promoter modulates gene expression via interaction with SOX7

　　

血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）浓度是冠状动脉疾病最重要的风险因素之一，载脂蛋白A1（APOA1）是构成HDL的关键载脂蛋白。然而，目前针对APOA1基因周围非编码功能SNP（单核苷酸多态性）的全面筛选工作甚少。本研究报道了一个影响肝细胞特异性APOA1基因表达的功能性SNP——rs12718466。此外，研究人员利用一种新型筛选方法——转录因子表达文库（Transcription Factor Expression Library, TFEL）扫描技术（该技术采用涵盖小鼠转录因子的综合性文库），鉴定出与该SNP相互作用的转录因子SOX7。SOX7的结合具有等位基因依赖性，其对正常等位基因的结合力更强，从而导致APOA1转录水平升高。在肝细胞的体外实验和小鼠的体内实验中证实，过表达SOX7可增加APOA1的表达，而敲低该因子则会降低APOA1基因表达及血浆HDL?C水平。本研究证明，rs12718466是一个功能性SNP，它通过与其相互作用的SOX7调节APOA1基因表达，进而影响血浆HDL?C浓度。

该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。研究背景源于血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL?C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）及甘油三酯（TG）浓度是冠状动脉疾病的主要风险因素，其中HDL?C的致动脉粥样硬化保护作用尤为受到关注。尽管既往的全基因组关联研究（GWAS）已识别出大量脂质相关位点，但在APOA1基因周围的非编码区域中，功能性SNP的系统性验证仍相对匮乏。现有的系统评价表明，仅有极少数GWAS文章成功验证了非编码功能性变异，这凸显了从众多SNP中识别真正具有调控功能的候选位点所面临的巨大挑战。为了填补这一空白，研究人员旨在利用自主开发的TFEL扫描技术，寻找位于APOA1基因转录调控区的功能性SNP及其上游作用的转录因子。

为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，利用HaploReg数据库筛选了位于APOA1启动子区域约3.3?kb范围内的35个常见及罕见SNP，并通过荧光素酶报告基因检测（Luciferase assay）在多种细胞系（HepG2、Hep3B、HEK293及AML12）中进行功能性筛选；其次，应用自研的TFEL扫描技术，通过共转染包含1588个转录因子的文库克隆，筛选出与特定SNP结合的转录因子；随后，利用电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白与DNA的等位基因依赖性结合；最后，通过在HepG2细胞、原代肝细胞及ICR小鼠模型中分别进行过表达和shRNA介导的基因敲低实验，并结合定量逆转录PCR（Q?RT?PCR）及血液生化检测，从体内外层面验证了靶基因及表型的变化。

研究结果具体如下：

在“Selection of potential functional SNPs in APOA1 promoter region”部分，研究人员依据染色质构象捕获（Hi?C）数据界定了拓扑关联域（TAD），并在CTCF结合位点与转录起始位点（TSS）之间锁定了35个候选SNP。

在“Functional screen of SNPs in APOA1 promoter region shows a hot spot at rs12718466 in hepatocytes”部分，通过报告基因分析发现，rs12718466在HepG2肝细胞中表现出显著的等位基因效应，即携带正常等位基因（腺嘌呤）的载体显示出更强的转录活性，且该现象在原代小鼠肝细胞系AML12中也得到了验证，确立了其肝细胞特异性调控特征。

在“TFEL genome?wide screen of trans?acting factors for rs12718466 identifies SOX7”部分，利用TFEL扫描技术对1588个转录因子进行筛选，最终将目标锁定在SOX家族成员上，并进一步通过系统发育树分析及荧光素酶实验确认SOX7是能够特异性激活含rs12718466顺式元件的转录因子。

在“SOX7 directly binds to the functional SNP”部分，EMSA实验直观显示，GST融合蛋白（无论是小鼠还是人源的SOX7）均对正常等位基因探针表现出更强的结合力，而对风险等位基因（胞嘧啶）探针结合较弱；同时，将SOX7结合位点突变为共识序列后，报告基因活性丧失，证实了SOX7与rs12718466的直接物理互作及功能性依赖。

在“Knockdown of SOX7 decreases APOA1 gene expression and plasma HDL?C levels”部分，体内外功能获得与缺失实验表明，在HepG2细胞和原代肝细胞中过表达SOX7可显著上调APOA1 mRNA水平，而使用shRNA敲低SOX7则产生相反效果；在ICR小鼠模型中，敲低Sox7导致肝脏Apoa1基因表达下降，并伴随血浆HDL?C及总胆固醇水平的显著降低。

讨论部分总结指出，本研究首次鉴定了位于APOA1基因转录调控区的功能性非编码SNP——rs12718466，并阐明其通过与转录因子SOX7相互作用来调节APOA1基因表达及血浆HDL?C水平。GTEx数据库的人类肝脏表达数量性状位点（eQTL）数据与本研究结果一致，显示该位点的替代等位基因会降低肝脏中APOA1的表达。尽管SOX7在胚胎发育早期的心血管系统中扮演关键角色，但其纯合缺失会导致胚胎致死，因而成年肝脏中的功能长期被忽视。本研究表明，SOX7在维持正常肝功能及脂质代谢中可能发挥重要作用，并且与人群中观察到的SOX7上游SNP与APOA1水平降低的关联相呼应。尽管CRISPR介导的精确单碱基编辑仍是未来验证等位基因特异性的金标准，但当前的EMSA及基因操作实验已充分支持了SOX7在rs12718466处的等位基因依赖性调控作用。综上所述，该研究利用TFEL扫描技术揭示了rs12718466?SOX7?APOA1这一新的调控轴，为理解HDL?C的遗传调控机制提供了重要的分子基础。