在Komagataella phaffii中高效表达γ-DL-谷氨酰水解酶及其在改造Bacillus velezensis产生的聚γ-谷氨酸中的应用

《Journal of Biotechnology》：Efficient expression of γ-DL-glutamyl hydrolase in Komagataella phaffii and its application in modification of poly-γ-glutamic acid from Bacillus velezensis

　　

刘洪|严巧娟|李艳晓|王晓晓|姜正强

中国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物工程国家重点实验室，北京100083，中国

摘要

聚γ-谷氨酸（γ-PGA）的功能特性和应用性能与其分子量（MW）密切相关。然而，精确控制其分子量仍然具有挑战性，这显著阻碍了其在食品、农业、化妆品和制药领域的高价值应用。异源酶表达已成为调节γ-PGA分子量的有效且特异性策略。在本研究中，来自Bacillus velezensis CAU263的γ-DL-谷氨酰水解酶（BvPgdS45）在Komagataella phaffii中进行了异源表达，经过高密度发酵后其活性达到102.7 IU/mL。BvPgdS45在pH 7.0和温度50 ℃时表现出最佳活性。随后评估了其对γ-PGA降解性能的影响。在酶剂量从0 IU/mL到10 IU/mL的范围内，经过3小时的酶促水解后，γ-PGA的重量平均分子量（Mw）从3.3×10^6 Da降低到1.1×10^5 Da。此外，使用B. velezensis CAU263通过原位酶促水解生产了不同分子量的γ-PGA，产物Mw范围为5.1×10^5 Da至2.1×10^6 Da，γ-PGA的产率从62.6 g/L提高至73.7 g/L。总体而言，本研究表明在K. phaffii中表达的BvPgdS45在降解γ-PGA方面具有有效性，并提供了一种有效的原位水解策略，用于精确调节其分子量。

引言

聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是一种天然存在的生物聚合物，由通过γ-酰胺键连接的谷氨酸单体组成（Elbanna等人，2024年）。值得注意的是，γ-PGA的生物功能，包括其生物相容性、生物降解性和水溶性，高度依赖于其分子量（MW）（Wei等人，2024年）。通过微生物发酵生产的γ-PGA的分子量通常在大约1×10^4 Da到1×10^7 Da之间（Pal等人，2024年）。低分子量（LMW）的γ-PGA在医药、食品和化妆品领域显示出巨大潜力（Li等人，2022年）。它已被用作抗病毒生物分子（5.0×10^4 Da）（Sanchez-Leon等人，2020年）、益生菌保护剂（2.6×10^5 Da）（Bhat等人，2015年）、药物递送载体（4.0×10^5 Da）（Dorost等人，2025年）、食品冷冻保护剂（2.0×10^5 Da）（Abdelnaby等人，2024年）以及保湿护肤品（7.0×10^4 Da至8.0×10^4 Da）（Medeleanu等人，2025年）。相比之下，高分子量（HMW）的γ-PGA常被用作酸奶和饮料等食品中的增稠剂（1.0×10^6 Da）（Parati等人，2022年），以及促进人体钙（Ca^2+）吸收的营养增强剂（5.0×10^6 Da）（Lei等人，2024年）。此外，它还被证明可以作为肥料增效剂（4.0×10^6 Da）以提高作物产量（Liu等人，2026年），以及作为生物絮凝剂（5.8×10^6 Da至6.2×10^6 Da）用于去除重金属（Syeda等人，2023年）。总体而言，由于γ-PGA的分子量决定了其功能特性和应用前景，因此精确控制其分子量对于扩展其商业和工业应用至关重要。

微生物发酵是生产γ-PGA的主要方法（Manika等人，2025年）。然而，γ-PGA的产率和分子量会因Bacillus种类和培养条件而显著不同（Nair等人，2023年）。虽然已经采用了物理和化学方法来获得不同分子量的γ-PGA，但无法精确控制其分子量仍然是γ-PGA生产中的一个主要瓶颈，从而限制了其工业应用（Qiu等人，2024年）。γ-DL-谷氨酰水解酶（EC 3.4.19.9）是一种内切型水解酶，可催化γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸残基之间的γ-谷氨酰键的断裂，在调节其分子量方面具有巨大潜力（Wang等人，2022年）。迄今为止，涉及pgdS基因过表达的代谢工程策略已被证明可以有效调节γ-PGA的分子量。在Bacillus licheniformis WX-02中过表达pgdS后，γ-PGA的重量平均分子量（Mw）从1.0×10^6 Da降低到6.0×10^5 Da至8.0×10^5 Da，同时γ-PGA的产量增加了54%（Tian等人，2014年）。此外，Sha等人（2020年）利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术实现了γ-PGA分子量的动态调节，使Mw范围为5.0×10^4 Da至1.4×10^6 Da。此外，异源酶表达也成为调节γ-PGA分子量的有效策略。来自B. subtilis NX-2的γ-DL-谷氨酰水解酶在大肠杆菌中进行了异源表达，在优化的酶促水解条件下生产出Mw范围为1.0×10^6 Da至2.0×10^4 Da的γ-PGA（Yao等人，2009年）。同样，Chen等人（2022年）在E. coli中表达了来自B. subtilis KH2的γ-DL-谷氨酰水解酶，并在发酵过程中应用该酶，生产出Mw为2.1×10^5 Da至6.0×10^5 Da的γ-PGA。尽管取得了这些进展，但E. coli作为目标酶的表达宿主仍存在一些局限性。报道中的表达水平通常不足以进行大规模酶生产（Jiang等人，2024年）。E. coli中的重组蛋白经常形成不溶性的包涵体，需要耗费大量劳动力的变性及重折叠过程，这通常导致活性酶的回收率较低（Beygmoradi等人，2023年）。此外，E. coli中的整个生产过程涉及繁琐的步骤（如细胞破裂），增加了生产成本并降低了工艺的工业可行性（Zhao等人，2026年）。相比之下，Komagataella phaffii（Pichia pastoris）由于其高细胞密度（Khlebodarova等人，2024年）、强大的蛋白质分泌能力（避免了包涵体的形成并简化了下游处理）（Li等人，2025年）以及经济高效、可扩展的发酵能力（Gao等人，2025年），成为一种非常有效的表达系统。这些优势有效解决了与E. coli相关的限制，支持使用K. phaffii作为工业规模生产γ-DL-谷氨酰水解酶的优越宿主。然而，目前尚无关于在K. phaffii中表达γ-DL-谷氨酰水解酶的报道。

在本研究中，来自B. velezensis CAU263的γ-DL-谷氨酰水解酶（BvPgdS45）在K. phaffii GS115中进行了异源表达，并对其进行了生化表征。此外，我们系统地研究了其在调节γ-PGA分子量方面的应用。这项工作不仅介绍了一种具有精确调节γ-PGA分子量潜力的γ-DL-谷氨酰水解酶，还提供了一种有效生产不同分子量γ-PGA的策略。

章节片段

试剂和菌株

B. velezensis CAU263作为γ-PGA的生产菌株（CGMCC编号：20318）（Liu等人，2025年）。E. coli DH5α、K. phaffii GS115和pPIC9K载体分别来自Biomed（北京，中国）、TransGen（北京，中国）和Invitrogen（美国卡尔斯巴德）。用于B. velezensis CAU263培养和发酵的液体培养基按照Liu等人（2025年）描述的程序制备。Pichia多拷贝表达试剂盒（Invitrogen Inc.）包含缓冲液

从B. velezensis CAU263中克隆和测序BvPgdS45

为了筛选适合异源表达和后续调节γ-PGA分子量的γ-DL-谷氨酰水解酶，克隆并测序了候选基因BvPgdS45。该酶基因（BvPgdS45）来自B. velezensis CAU263的基因组。该酶具有1236 bp的开放阅读框，编码411个氨基酸，N端预测有一个30个氨基酸的信号肽（补充图S3）。成熟蛋白的预测分子量为42.07 kDa，pI值为

讨论

本研究表明，在K. phaffii中表达的BvPgdS45进行的原位水解可以作为一种实用的方法，以满足食品、农业、医疗和化妆品领域对具有定制分子量的γ-PGA的需求。这种策略可以在温和条件下精确调节γ-PGA的分子量，同时提高产量并克服传统物理和化学降解方法的局限性（Medeleanu等人，2025年）。

结论

来自B. velezensis CAU263的工程化γ-DL-谷氨酰水解酶（BvPgdS45）在K. phaffii中成功实现了异源表达。随后，该酶被用于在B. velezensis CAU263中通过原位酶促水解生产出不同分子量的γ-PGA，获得了5.1×10^5 Da至2.1×10^6 Da的广泛分子量分布，γ-PGA的产率从62.6 g/L提高到73.7 g/L。这些结果表明BvPgdS45是一种有效的γ-DL-谷氨酰水解酶。

CRediT作者贡献声明

刘洪：撰写——原始草稿、方法学、概念构思。严巧娟：研究、资金获取。李艳晓：可视化、资源管理、数据整理。王晓晓：验证、形式分析。姜正强：撰写——审阅与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22508411）和国家重点研发计划（项目编号：2022YFD2101400）的支持。