合成含有唑基连接结构的s-三嗪-异噁唑分子结构，作为纳米级DNA靶向剂：一项结合光谱学和计算方法的研究

《Nanoscale Advances》：Synthesis of azole-linked s-triazine-isatin molecular architectures as nanoscale DNA-targeting agents: a combined spectroscopic and computational study

　　DNA是一种直径约为2纳米的生物聚合物，由于其在中复制和转录过程中的核心作用，成为抗癌治疗的基本纳米级靶点。与此同时，DNA拓扑异构酶II（topo II）作为DNA拓扑结构的关键调节因子，仍然是化学治疗干预的有效酶学靶点。本文报道了一系列含有唑环的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f的合成，这些杂化物被设计为多功能纳米级DNA靶向结构。在生理条件（pH 7.4）下，使用紫外-可见吸收光谱系统研究了这些杂化物与鲑鱼精子DNA（SS-DNA）的纳米生物相互作用。通过Benesi–Hildebrand分析测得的结合常数（Kb）范围为10^3至10^5 M^-1，其中9f显示出最高的亲和力（在298 K时为1.20 × 10^5 M^-1），与参考标准相当。吉布斯自由能变化（ΔG = ?28.9 kJ mol^-1）表明9f的结合是自发的。分子对接研究支持了这些实验结果，显示9f在富含AT的DNA沟槽内形成了稳定的疏水作用和氢键作用（对接分数：?10.3 kcal mol^-1，PDB：3EY0），并且与拓扑异构酶II的对接分数为?10.7 kcal mol^-1（PDB：3QX3）。分子动力学模拟进一步确认了DNA-配体及蛋白质-配体复合物的结构稳定性和动态行为。此外，密度泛函理论（DFT）计算和计算机模拟药物相似性评估提供了关于电子性质和药代动力学潜力的见解。总体而言，这些结果突显了含有唑环的s-三嗪-异嗪杂化物作为抗癌开发中有前景的纳米级DNA靶向支架的潜力。

1. 引言

癌症继续是一个重大的全球健康挑战，是全球发病率和死亡率的主要原因之一，这突显了迫切需要有效且具有选择性的治疗方法。在分子靶点中，DNA在抗癌药物开发中占据核心地位，因为能够结合DNA的小分子可以干扰复制、转录和其他关键细胞过程，最终导致细胞毒性效应。从结构上看，DNA是一种直径约2纳米的纳米级生物聚合物，其特征是序列依赖性的沟槽和静电表面特征，这些特征使得DNA能够进行选择性分子识别。配体与DNA的相互作用是由非共价力（如π-π堆叠、氢键、静电接触和范德华相互作用）控制的纳米级超分子识别过程。这些相互作用可以通过沟槽结合、插入或外部关联等方式发生，结合亲和力和特异性受到配体拓扑结构和电子结构的强烈影响。除了直接靶向DNA外，DNA拓扑异构酶II（topo II）在复制和转录过程中也起着调节DNA拓扑结构的关键作用。临床上使用的topo II靶向剂如依托泊苷和多柔比星可以稳定topo II-DNA切割复合物，从而导致DNA损伤和细胞凋亡。然而，它们的治疗效用受到耐药性和系统毒性的限制，这促使人们探索能够与DNA相互作用并可能调节topo II活性的新分子支架。

杂环药效团如s-三嗪和异嗪在药物化学中是公认的基元，具有多种生物活性，包括抗癌和与DNA相互作用的特性。三嗪核心存在于已批准的药物中，如阿曲替胺和吉达托利西布，而异嗪衍生物（包括苏尼替尼和尼替尼）则表现出酶抑制和核酸相互作用。含有唑环的杂环（例如苯并噻唑、苯并噁唑、四唑）是富含电子的芳香体系，能够形成氢键和π-π堆叠相互作用，使它们成为DNA识别的有吸引力的候选者。药效团杂化是将互补的结构基元整合到单一分子框架中的合理策略，以提高生物活性和结合亲和力。受到这一方法以及我们之前对s-三嗪和异嗪衍生物研究的启发，我们设计并合成了一系列含有唑环的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f。通过紫外-可见吸收光谱与SS-DNA进行了它们的DNA结合相互作用评估。为了进一步阐明纳米级识别特征和相互作用稳定性，还进行了分子对接、分子动力学模拟、密度泛函理论（DFT）计算和计算机模拟ADMET分析。这项综合的实验-计算研究旨在表征这些杂化环的DNA识别特性，并为未来开发DNA相互作用支架提供结构基础。

2. 结果与讨论

2.1 化学合成

对于含有唑环的s-三嗪-异嗪杂化物8a–f的合成（方案1），将氰尿酸1与2当量的各种取代酚类化合物在无水碳酸钾作为盐酸清除剂的情况下反应。反应在冰冷温度下开始，随后升温至室温以减少三取代副产物的形成。二苯氧基连接的s-三嗪2随后在室温下与肼一水合物反应，生成基于s-三嗪的肼3（方案1）。同样，中间体5是通过将异嗪4与二溴乙烷（4当量）在DMF中于50°C下反应，并使用K2CO3中和生成的HCl来制备的（方案1）。所得的1-(2-溴乙基)异嗪5随后与相应的唑环6a–d在二甲基亚胺（DMF）中于70–80°C下反应，高产率地获得含有唑环的异嗪7a–d（62,63）。最后一步中，中间体5和含有唑环的异嗪7a–d分别与基于s-三嗪的肼3在乙醇和少量冰醋酸的存在下回流反应，生成一系列s-三嗪-异嗪杂化物8和酰胺连接的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f（方案1）。新合成化合物8和9a–f的化学结构通过包括FTIR、NMR和MS分析在内的综合表征得到明确。在化合物8的1H NMR谱中，肼基团的–NH质子的特征单峰出现在12.86 ppm处。此外，化合物3中–NH2质子的缺失也证明了s-三嗪基肼与异嗪羰基的缩合形成了肼。芳香区域的多重峰对应于δ 6.92–7.68范围内的12个质子，验证了芳香环上的取代模式。在4.19 ppm和3.74 ppm处出现的两个三重峰分别对应于两个质子的乙烯连接（–CH2–CH2?）。此外，在化合物8的13C NMR谱中，酮羰基碳的缺失进一步支持了肼的形成。在脂肪族区域的信号位于41.2和29.8 ppm，表明存在乙烯连接（–CH2–CH2?）。同样，在含有唑环的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f的1H NMR和13C NMR谱中，芳香区域的额外质子和碳信号分别表明了相应唑环的存在。代表性化合物9e的1H NMR谱确认了合成化合物的关键结构特征。在δ 4.38和δ 5.02处观察到的两个三重峰各自对应两个质子，表明异嗪和四唑部分之间存在乙烯连接。在δ 12.74处出现的独特低场单峰归因于肼功能团的NH质子。在芳香区域（δ 6.60–8.03），记录了总计19个质子的多重峰，与提出的分子结构一致。此外，13C NMR谱进一步确认了化合物9e的结构。在脂肪族区域的δ 39.3和δ 50.1处的信号归因于亚甲基碳，证实了乙烯连接的存在。在δ 135.0处的独特共振峰对应于亚胺碳，提供了肼键形成的证据。在δ 161.0处的峰归因于四唑碳和内酰胺羰基，而在δ 165.7和δ 167.2处的最低场信号则特征性地表明了s-三嗪碳的存在。此外，FTIR光谱分析揭示了支持合成化合物结构框架的功能基团的独特吸收带。

2.2 DNA结合研究

通过紫外-可见光谱滴定评估了合成的s-三嗪-异嗪杂化物8和9a–f的DNA结合亲和力，并计算了相应的结合常数（Kb）和结合自由能（ΔG），以量化它们与SS-DNA的相互作用。结果总结在表1中。所有化合物都表现出不同程度的SS-DNA相互作用，不同的结构-活性关系反映了唑环取代和R1基团对结合行为的影响。表1总结了在室温下化合物（9a–f）-DNA复合物的结合常数（Kb）和结合自由能（ΔG）的测定结果。

在评估的化合物中，9f（R1 = 4-Ph, 含唑环 = 四唑）显示出最高的结合亲和力，其Kb值为1.20 × 10^5 M^-1（表1），这与最有利的结合自由能（ΔG = ?28.9 kJ mol^-1）相关，表明其相互作用是热力学上稳定且自发的（表1）。9f增强的SS-DNA亲和力可归因于多个能够形成氢键的氮原子，而4-苯基取代基可能促进了与核碱基对的额外π-π堆叠相互作用，从而增强了整体结合稳定性，并且没有出现增色效应（图1），这表明其结合发生在SS-DNA的沟槽中。图1显示了化合物9f在pH 7.4和室温下的紫外-可见吸收光谱，不同SS-DNA浓度（5–35 μM）下的光谱变化，表明了沟槽结合相互作用。插图显示了Ao/(A?Ao)作为1/[DNA]函数的图。同样，化合物9c（R1 = 4-Br, 含唑环 = 咁唑）也表现出最高的结合亲和力，其Kb值为1.16 × 10^5 M^-1（表1），表明其相互作用是热力学上稳定且自发的。9c的优异SS-DNA亲和力可能归因于含唑环部分的富电子平面性质，这促进了π-π堆叠和在SS-DNA螺旋内的潜在氢键相互作用。化合物9a和9e也表现出显著的结合亲和力，其Kb值分别为4.24 × 10^4 M^-1和3.92 × 10^4 M^-1，ΔG值分别为?26.4和?26.2 kJ mol^-1（表1）。9a中的苯并噻唑环可能通过硫介导的相互作用或疏水接触与SS-DNA相互作用，而尽管9e缺乏R1取代基，但其高亲和力表明四唑部分主导了其相互作用模式。相比之下，化合物8和9b的SS-DNA结合亲和力较弱，其Kb值分别为4.63 × 10^3 M^-1和3.34 × 10^3 M^-1（图S1），自由能变化较小（分别为?20.9和?20.1 kJ mol^-1）。9b较低的结合亲和力可能归因于苯并噁唑部分，这可能为其与SS-DNA的有效相互作用提供了不理想的电子和空间互补性。对于化合物8，缺乏扩展的杂环体系可能限制了与SS-DNA的π-π堆叠和氢键相互作用。s-三嗪-异嗪杂化物8和9a–f的光谱分析进一步支持了这些发现（图S1）。所有化合物在加入SS-DNA后都表现出减色现象，表明共轭系统与SS-DNA碱基对之间存在强烈的π-π堆叠或沟槽结合。值得注意的是，化合物9a–9c表现出减色现象，并伴有轻微的增色效应（红移），表明部分插入和激发态在SS-DNA结合时的显著稳定。相比之下，8、9d和9e表现出减色现象，但伴有轻微的蓝移（图S1），表明其结合模式可能是非插入性的，例如由于色素周围环境更为极性或受限。有趣的是，尽管化合物9f表现出与标准药物卡博赞替尼（CBZ）相当的最强整体结合亲和力，但它没有显示出显著的减色效应（图1），表明其结合模式为沟槽结合。这些光谱特征，结合计算出的热力学参数，突显了唑环结构和R1取代在决定结合强度和与DNA的相互作用模式中的关键作用。富含电子的平面杂环化合物，如噁二唑和四唑，通过π–π堆叠、氢键作用以及定向沟槽相互作用相结合的方式显著增强了结合能力，从而为开发针对DNA的小分子提供了有价值的设计元素。与传统的沟槽结合剂（如netropsin和Hoechst染料）相比，后者的结合常数在（10^3–10^5 M^-1）范围内，64,65 而合成的化合物也处于相似的范围内，这支持了它们被归类为中等亲和力的沟槽结合配体。例如，基于唑和异噁唑的DNA结合剂的结合常数通常在10^4–10^6 M^-1范围内，66 这取决于分子的平面性和电子特性。相比之下，传统的插层剂通常显示出更高的结合亲和力（>10^6 M^-1），这是由于它们与DNA碱基对之间有强烈的π–π堆叠相互作用。65,67 因此，化合物9a–9f观察到的中等结合亲和力支持它们通过沟槽结合而非插层的方式与DNA结合。总体而言，这些结果与报道的药物–DNA相互作用研究结果一致，其中结构平衡的杂环系统倾向于在DNA沟槽内结合，而不会引起显著的螺旋变形。

2.3 分子对接分析

为了合理解释合成化合物8和9a–f的DNA结合亲和力，对DNA双螺旋序列（5′-(ATATATATAT)-3′，PDB ID: 3EY0）进行了分子对接模拟，并分析了关键相互作用（表2）。所有化合物都表现出有利的结合能，主要与两条DNA链上的腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基发生了多种非共价接触。对接研究显示，这些化合物倾向于在富含AT的区域内的沟槽中结合，形成了多个稳定的氢键和疏水接触（图2）。表2显示了化合物8和9a–f与DNA（3EY0）的估计对接分数和相互作用概况。

化合物
R1，唑
对接分数
化合物-DNA相互作用

氢键
疏水

8
4-Br
-8.0
DA5 (A), DA7 (B)
DT2 (A) Pi-阴离子; DT4 (A), DA3 (A) Pi–Pi T形; DT6 (B), DA5 (B) Pi-供体氢键; DT4 (B) 范德华力

9a
4-Br, 苯并噻唑
-8.2
DA5 (A), DT4 (A), DA7 (B), DT4 (B)
DT2 (A)Pi-阴离子; DT6 (B), DA3 (A) Pi–Pi T形, Pi–Pi堆叠; DA5 (B) Pi-供体氢键, 范德华力

9b
4-Br, 苯并噁唑
-8.1
DA5 (A), DA5 (B), DT6 (B), DA7 (B)
DA3 (A), DT4 (A) Pi–Pi T形, Pi–Pi堆叠; DT2 (A) Pi-阴离子; DT4 (B)Pi-供体氢键, Pi-烷基, 范德华力

9c
4-Br, 噁二唑
-9.4
DA5 (A), DA7 (B)
DT6 (B), DA3 (A), DT4 (A), DT2 (B) Pi–Pi T形, Pi–Pi堆叠; DT4 (B) Pi-σ; DA3 (B), DA5 (B) Pi-供体氢键, DT6 (A), DA7 (A), 范德华力; DT2 (A) Pi-阴离子

9d
4-Br, 四唑
-11.1
DA5 (A), DA5 (B), DT6 (A)
DA9 (A), DA9 (B), DT10 (A), DT4 (B), DT6 (B) 范德华力; DT8 (A), DA7 (B) Pi-阴离子; DA7 (A) Pi–Pi堆叠; DT8 (B) 碳氢键

9e
H, 四唑
-11.4
DA5 (A), DA5 (B), DA7 (A)
DT8 (B) Pi-阴离子; DT6 (B), DT8 (A) 碳氢键; DA9 (A), DA7 (B), DT6(A), DA9 (B), DT4 (A) 范德华力

9f
4-Ph, 四唑
-11.5
DA5 (A), DA5 (B), DT6 (B), DA7 (A)
DA9 (A), DT8 (B), Pi-阴离子; DT4 (B), DA9 (B), DT4 (A), DT6(A), DA7 (B) 范德华力

图2

2D和3D显示了弱结合剂9b（黄色）和强结合剂9f（蓝色）与DNA（PDB ID: 3EY0）的结合姿态，分别代表了主要和次要沟槽结合相互作用。母体化合物8含有一个4-溴苯基基团，其对接分数为-8.0 kcal mol^-1（表2）。相互作用网络包括与DA5 (A)和DA7 (B)的氢键作用，以及与DT2 (A)的π-阴离子相互作用，与DT4 (A)和DA3 (A)的π–π T形堆叠，与DT6 (B)和DA5 (B)的π–供体氢键作用，以及与DT4 (B)的范德华力接触。适度的结合能反映了有限的杂芳香表面面积和相互作用的多样性。相比之下，在9a–f中引入唑杂环显著增强了DNA亲和力和相互作用复杂性。化合物9a（苯并噻唑）和9b（苯并噁唑）的对接分数分别提高了至-8.2和-8.1 kcal mol^-1，具有扩展的氢键网络（例如，DA5, DT4, DA7）以及多个π–π堆叠和π–阴离子相互作用（表2）。这些相互作用得益于平面芳香杂环，使得在DNA次要沟槽内形成有利的π表面互补性（图S2）。值得注意的是，含有噁二唑基团的化合物9c达到了-9.4 kcal mol^-1的对接分数。它形成了强烈的π–π堆叠（DT6, DA3），π–供体氢键（DA3, DA5）和范德华力接触，表明了电静力和形状互补性的提高。噁二唑中增加的杂原子密度也可能增强了氢键接受体的潜力。含有四唑的类似物9d–f显示出最高的对接亲和力（-11.1至-11.5 kcal mol^-1）（表2），并与DNA的次要沟槽结合（图2）。化合物9d（4-Br, 四唑）与DA5和DT6形成了关键的氢键，与DT8发生了π–阴离子相互作用，并与DA7发生了π–π堆叠。值得注意的是，化合物9e虽然缺乏卤素，但保留了四唑结构，仍显示出相当的结合能力（-11.4 kcal mol^-1），表明四唑在固定配体中的主导作用。得分最高的化合物9f（4-苯基, 四唑）参与了密集的相互作用网络，包括氢键（DA5, DA7），π–阴离子（DA9, DT8）和广泛的范德华力相互作用，强调了增加的芳香表面面积和取代体积的有益影响（图2）。此外，实验结合常数和对接分数之间观察到了定性相关性。化合物9c和9f表现出最高的Kb值（约10^5 M^-1），也显示出最有利的对接分数（-9.4至-11.5 kcal mol^-1），支持了光谱学和计算结果之间的一致性。进一步地，比较对接分析揭示了化合物8和9f与DNA（PDB ID: 3EY0）的不同结合模式。化合物8在主要沟槽内的结合较弱，形成了少量且强度较低的非共价相互作用，导致复合体稳定性有限（图2）。相比之下，化合物9f更倾向于占据次要沟槽，在那里它建立了多个氢键和疏水接触，从而增强了结合稳定性。9f的优越亲和力归因于其在受限的次要沟槽环境中的更好几何互补性和更高的相互作用密度。总的来说，对接数据强调了唑药效团对DNA结合亲和力的关键影响。在这些化合物中，四唑骨架一致地实现了更深的DNA沟槽适应，并最大化了稳定相互作用，支持其作为设计针对DNA的药物开发的优选基团的潜力。此外，还对得分最高的化合物9f与拓扑异构酶II（PDB: 3QX3）进行了分子对接分析。对接分析表明，活性位点残基如ARG729、SER 730、GLN742、TYR773、HIS775和ASN 786在配体与蛋白质结合口袋的相互作用中起着关键作用。研究发现，化合物9f除了范德华力作用外，还与拓扑异构酶II酶（A链）的活性位点发生了多种氢键相互作用（图3）。有趣的是，化合物9f的对接分数（-10.7 kcal mol^-1）高于共结晶配体依托泊苷（-9.5 kcal mol^-1）。图3

化合物9f（青色）与拓扑异构酶II（3QX3）的分子对接。（A）活性位点内的3D结合构象，显示了关键残基相互作用。（B）2D相互作用图，展示了有助于结合稳定性的氢键和疏水接触。

2.4 MD模拟分析

基于最高的实验结合常数、最有利的对接分数以及在DNA次要沟槽内最佳的芳香表面互补性，选择了化合物9f进行MD模拟。DNA-9f复合物是使用Amber ff19SB力场对DNA进行模拟的，对配体使用GAFF2参数。系统用TIP3P水模型溶剂化，用钠和氯离子中和以模拟生理条件，然后进行能量最小化，随后进行NVT和NPT平衡。接着进行了4纳秒的生产模拟以生成用于分析的轨迹。MM/GBSA结合能分解（图4）显示，范德华力是控制复合物形成的主要稳定力，而电静力和非极性溶剂化作用进一步支持了结合。正如在水系统中预期的那样，极性溶剂化由于脱溶剂化惩罚而反对结合。总体结合自由能（ΔG ≈ ?32 kcal mol^-1）表明在热力学上有利于次要沟槽的结合。结构稳定性分析进一步支持了这一观察结果。回转半径保持在约13.4 ?，表明双链完整性得以保持，没有发生展开（图5）。RMSF分析显示，灵活性主要局限于末端核苷酸，而次要沟槽内的残基表现出减少的波动，这与局部骨架稳定一致。主成分分析（PCA）表明PC1和PC2占总运动的72%，复合物相对于自由DNA采样了受限的构象空间。配体–DNA距离在整个轨迹中保持稳定，支持了持续的沟槽适应。总体而言，模拟表明9f占据了约6–8 ?的次要沟槽，而没有引起全局螺旋变形，突出了纳米级的几何和电静力互补性。图4

MM/GBSA衍生的化合物9f结合自由能剖面：（A）模拟轨迹中总结合能、电静力能和范德华力相互作用的波动，（B）各个能量项对总体结合自由能的贡献，突出了主要的稳定相互作用（kcal mol^-1）。图5

对DNA–9f复合物进行了综合MD模拟分析。为了评估潜在的蛋白质相互作用，还使用GROMACS 2021.5和AMBER99SB力场对9f–拓扑异构酶II复合物（PDB ID: 3QX3）进行了MD模拟。系统在立方盒子中用TIP3P水溶剂化，并用反离子中和，然后进行能量最小化和两阶段平衡（NVT在300 K和NPT在1 bar）。在周期性边界条件下进行了10纳秒的生产运行，使用PME电静力，并对非键合相互作用设置了1.0纳米的截止值。蛋白质–配体复合物在整个模拟过程中表现出稳定的动态。骨架RMSD在约2纳秒后稳定下来，并围绕平均约3.0 ?波动（图6A），表明了平衡和结构一致性。回转半径（3.35 ± 0.05 nm）和溶剂可及表面积（360 ± 10 nm^2）保持稳定（图6B和C），确认了蛋白质的整体紧凑性。RMSF分析显示，环区显示出更高的移动性（0.25–0.80 nm），而在配体存在下，结合口袋内的残基表现出减少的波动（图S3A），表明了局部稳定。氢键分析识别出2–3个持续的分子间氢键，其占据率超过80%（图S3B），支持了稳定的相互作用。图6

蛋白质–UNK复合物的结构稳定性。（A）随时间的骨架RMSD（B）回转半径（C）溶剂可及表面积。能量分解分析表明，范德华力相互作用（?131.9 ± 8.3 kJ mol^-1）主导了复合物的稳定，电静力相互作用提供了额外的有利贡献。MM-PBSA计算得出的结合自由能为负值（ΔG.binding = ?4.76 ± 0.81 kcal mol^-1），确认了热力学的可行性。PCA显示，配体结合限制了大范围的蛋白质运动，PC1和PC2捕获了72%的方差（图S4）。自由能景观（图S5）进一步显示，配体结合的复合物占据了比未结合状态更深且更受限的最小值，表明向能量稳定构象的转变。总体而言，这些MD模拟表明化合物9f与DNA和拓扑异构酶II形成了动态稳定的复合物，主要由疏水力和分散力相互作用稳定。光谱数据、对接结果和动态分析的收敛性支持了一种非共价的、定向沟槽的DNA结合模式，并强调了芳香表面拓扑和电子平衡在控制纳米级生物分子识别中的作用。

2.5 DFT研究

为了深入了解合成化合物的电子性质和化学反应性，对母体s-三嗪-异噁唑杂化物8和一系列含有唑的s-三嗪-异噁唑杂化物9a–f进行了DFT计算。计算的参数包括前沿分子轨道能量（EHOMO, ELUMO）、能量间隙（ΔEgap）、电离势（IP）、电子亲和力（EA）、电负性（χ）、电化学势（μ）、化学硬度（η）和亲电性指数（ω），如表3所总结。表3

新合成的s-三嗪-异嗪杂化物8以及唑连接的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f的DFT分析参数

化合物
8
9a
9b
9c
9d
9e
9f

R1（唑基）
4-Br, Br
4-Br, 苯并噻唑
4-Br, 苯并噁唑
4-Br, 咪唑
4-Br, 四唑
H, 四唑
4-Ph, 四唑

HOMO (eV)
-6.21
-5.92
-5.69
-6.00
-6.15
-6.34
-6.10

LUMO (eV)
-2.51
-2.38
-2.25
-2.29
-2.47
-2.45
-2.44

能隙 (ΔEGap)
3.71
3.53
3.41
3.71
3.68
3.90
3.65

电离势 IP (eV)
6.21
5.92
5.69
6.00
6.15
6.34
6.10

电子亲和力 EA (eV)
2.51
2.38
2.25
2.29
2.47
2.45
2.44

电负性 χ (eV)
4.36
4.15
3.97
4.14
4.31
4.40
4.27

电化学势 μ (eV)
-4.36
-4.15
-3.97
-4.14
-4.31
-4.40
-4.27

硬度 η (eV)
1.85
1.77
1.72
1.86
1.84
1.95
1.83

柔软度 S (eV)
0.54
0.57
0.58
0.54
0.54
0.51
0.55

亲电性 ω (eV)
5.13
4.87
4.68
4.53
5.05
4.96
4.98

化合物9f含有4-苯基取代的四唑基团，其电子特性在系列中独树一帜，这可能解释了其相对较强的DNA结合能力。计算得到的HOMO（-6.10 eV）和LUMO（-2.44 eV）能量表明其具有适中的能隙（ΔEgap = 3.65 eV），显示出热力学稳定性和电子适应性的平衡。这种中等的带隙表明9f具有足够的反应性参与非共价生物分子相互作用，同时保持结构稳定性。其电离势（6.10 eV）和电子亲和力（2.44 eV）进一步反映了其在DNA微环境中控制电子捐赠和接受的双重能力，有利于电荷转移相互作用和静电互补性。与更刚性的类似物（例如9e）或更活泼的衍生物（例如9b）相比，9f展现了电子优化特性，支持可逆结合而非过度反应性。全局反应性描述符进一步强化了这一解释。电负性（χ = 4.27 eV）和化学硬度（η = 1.83 eV）将9f置于中等反应性范围内，而其柔软度（S = 0.55 eV^-1）表明其具有足够的极化性以适应DNA沟槽的纳米级曲率。亲电性指数（ω = 4.98 eV）表明其具有适度的亲电性，有利于稳定的非共价结合。重要的是，苯基-四唑取代基引入的扩展π共轭增强了电子离域和芳香表面积，可能加强了富含AT区域的范德华力和π-π相互作用。总体而言，这些电子参数为9f观察到的增强结合亲和力提供了机制上的解释，支持其在合成系列中作为结构和电子上都有利的DNA识别支架的作用。如图7所示，最有效的化合物9f的LUMO轨道主要位于s-三嗪核心的π系统上，而HOMO轨道主要分布在苯环和唑基团上。这种电子密度的空间分离突出了潜在生物相互作用中的关键结构区域。图7中的视觉表示进一步解释了分子内电子定位的不同区域。

化合物9f的HOMO、LUMO和3D-MEP。观察到的HOMO → LUMO转变表明从外围取代基向电子缺乏的三嗪环发生了显著的电荷转移，这可能显著贡献于化合物的反应性和结合行为。这种分子内的电子离域增强了分子片段之间的电子通信，并可能影响化合物的生物活性。这种电荷转移动态，加上有利的电子特性，使化合物9f成为进一步药理学探索的有希望的候选者。此外，分子静电势（MEP）分析提供了关于化合物9f静电表面特性的全面见解，其苯氧环上具有4-苯基取代基。MEP图（图7）显示最负的静电势区域为-6.628 × 10^-2，最正的区域为+6.628 × 10^-2，有效地勾勒出电子丰富和电子缺乏的区域。MEP图中使用的颜色等级遵循梯度：蓝色 > 绿色 > 黄色 > 橙色 > 红色，其中蓝色对应于最吸引电子（电负性）的区域，红色表示最排斥电子（电正性）的区域。值得注意的是，化合物9f中的亲核区域主要集中在s-三嗪和四唑基团的氮原子上，表现为深蓝色区域，表明强电子密度和亲电攻击的潜力。相反，亲电区域主要与氧原子和芳香苯环相关，呈现深黄色到红色色调，表明这些区域易于发生亲核相互作用。图7中呈现的详细MEP可视化使得潜在的反应位点得以识别，并支持了化合物9f的生物活性性质。总体而言，这些计算发现突出了唑和取代基变化对s-三嗪-异嗪杂化物电子特性的影响。HOMO–LUMO能量的调节、电负性和亲电性的变化表明这些化合物具有可调的性质，适合在结构-活性关系（SAR）研究和与生物分子靶标的潜在相互作用中进行进一步探索。

2.6

在计算机模拟ADMET分析中

为了评估新合成的s-三嗪-异嗪杂化物8以及唑连接的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f的药代动力学和毒理学适宜性，进行了全面的计算机模拟ADMET分析（表4）。数据集包括没有唑基团的化合物8，以及通过在三嗪-异嗪外围引入不同杂环基团而结构多样化的化合物9a–9f。具体来说，9a含有苯并噻唑环，9b含有苯并噁唑，9c含有咪唑，而9d–9f含有四唑基团。还引入了R1取代基的变化：9a–9d含有4-溴苯氧基团，9e含有简单的苯氧基团，9f含有较大的4-苯基苯氧基团。表4

通过SwissADME和pkCSM网络服务器估算的化合物8和9a–f的计算机模拟药代动力学参数

化合物
LogPa
TPSAb (?2)
Caco-2 permc
Int. absd
VDsse
AMES毒性

8
5.55
101.83
0.601
100
-0.345
否

9a
7.13
168.26
0.722
100
-0.419
否

9b
6.58
153.16
0.641
100
-0.525
否

9c
7.00
166.05
0.412
100
-0.461
否

9d
5.51
145.43
0.089
100
-0.548
否

9e
4.34
145.43
0.16
100
-0.692
否

9f
6.84
145.43
-0.277
100
-0.265
否

CBZ
4.40
98.78
0.166
100
-1.023
否

a
辛醇-水分配系数的对数（SwissADME69）。
b
拓扑极性表面积（TPSA）（SwissADME69）。
c
作为人体肠黏膜吸收估计的Caco-2细胞通透性（pkCSM预测）。
d
通过人体小肠吸收的化合物比例（%）（pkCSM预测）。
e
稳态分布体积（VDss）（pkCSM预测）。
f
AMES毒性（pkCSM预测）。化合物9f（R1 = 4-苯基，唑 = 四唑）在系列中表现出了有希望的候选者，显示出良好的药代动力学和DNA结合特性。它显示了完全预测的肠道吸收（100%）和适中的组织分布（VDss = -0.265），logP为6.84，TPSA为145.43 ?2。尽管其预测的Caco-2通透性（-0.277）低于某些类似物，但仍处于口服生物利用度的可接受范围内。重要的是，9f没有显示出预测的AMES毒性。此外，ADMET趋势表明适度的脂溶性（logP 5–7）结合足够的TPSA（≈145–168 ?2）支持良好的肠道吸收和可控的组织分布，同时避免了整个系列9a–f的遗传毒性。总体而言，9f表现出平衡的特性，结合了强的DNA亲和力、有利的药代动力学和低毒性，突出了其作为进一步优化的先导化合物的潜力。其他衍生物显示出可变的结合和吸收，主要受唑类型和取代基电子特性的影响，这与观察到的SAR模式一致。此外，化合物9f的毒性预测表明它属于GHS V类，LD50为3500 mg kg^-1，表明如果吞咽可能会有害，但总体上表明安全性适中。此外，StopTox结果进一步确认9f在吸入、皮肤刺激、腐蚀和致敏评估中是非毒性的。

光谱数据和计算数据的收敛支持了唑连接的s-三嗪-异嗪杂化物识别DNA的连贯机制模型。在UV-vis光谱中观察到的 hypochromic 移动，没有明显的 bathochromic位移，表明这是一种非插层结合模式，与轻微的沟槽关联一致。实验确定的结合常数（103–105 M^-1）位于经典沟槽结合化学类型的报告范围内，表明在生理条件下具有中等但特定的亲和力。热力学分析表明自发复合体的形成，焓贡献可能来自色散和氢键相互作用。在系列中，化合物9f显示出最有利的结合特性，反映了芳香表面互补性和富含AT区域的杂原子定向相互作用之间的最佳平衡。计算建模在原子分辨率上证实了这些实验观察结果。对接研究显示9f在DNA小沟槽内的优先定位，而分子动力学模拟确认了这种结合方向的持久性，没有引起全局螺旋扭曲。MM/GBSA分解确定了范德华力是主要的稳定贡献，伴随着支持的静电相互作用和相反的极性溶剂化惩罚——这是沟槽结合配体的能量特征。主成分和自由能景观分析进一步证明了配体诱导的DNA构象采样限制，表明稳定了特定的构象亚状态，而不是大规模的结构扰动。光谱行为、对接方向和动态稳定性之间的强烈一致性强调了由纳米级形状互补性和疏水堆积控制的沟槽定向识别机制。

3. 结论

本研究确立了唑连接的s-三嗪-异嗪杂化物作为结构可调的纳米级支架，能够选择性地识别沟槽，为合理设计DNA靶向治疗剂提供了基础。成功合成了一系列唑连接的s-三嗪-异嗪杂化物9a–f，并通过结合实验和计算方法系统地评估了它们的DNA结合特性。光谱研究揭示了对DNA的中等到强的结合亲和力，结合常数在103–105 M^-1范围内，表明合成的配体与DNA螺旋之间的有效相互作用。在研究的化合物中，衍生物9f表现出最有利的结合行为，得到了实验和计算分析的支持。分子对接研究表明，这些化合物优先在DNA的小沟槽内相互作用，形成稳定的氢键和与核苷酸碱基的疏水相互作用。这些发现进一步得到了分子动力学模拟的支持，这些模拟确认了配体-DNA复合物的结构稳定性，并在整个模拟轨迹中显示了一致的相互作用模式。含四唑衍生物观察到的增强结合亲和力可能归因于它们富电子的杂环框架和增加的氢键能力，这促进了与核酸结构的更强相互作用。与先前报道的DNA结合小分子的比较分析表明，合成的化合物表现出典型的沟槽结合配体的结合特性，而不是经典的插层剂。总体而言，本研究表明，将具有有利电子特性的杂环支架整合在一起可以产生有前景的DNA结合剂。结合实验和计算策略为理解配体-DNA识别的分子决定因素提供了宝贵的见解。这些发现可能有助于未来设计潜在的DNA靶向治疗剂，进一步的扩展模拟和生物学评估是必要的，以探索它们的药理潜力。

4.1 计算细节

4.1.1 密度泛函理论（DFT）计算

所有分子结构都是使用Gaussian 09 Package.74进行几何优化的。优化是在标准条件下使用B3LYP泛函和3-21G基组进行的。频率计算确认所有优化结构都对应于势能表面上的真实最小值。使用GaussView 6计算了前沿分子轨道（HOMO和LUMO）以及相关的全局反应性描述符和分子静电势（MEP）。

4.1.2 分子对接研究

使用Autodock Vina 1.5.7（参考文献75）进行了分子对接模拟，以评估合成化合物与DNA（PDB ID: 3EY0）和人类拓扑异构酶II（PDB ID: 3QX3）的结合亲和力。在对接之前，通过去除水分子和共结晶配体来准备所有受体结构，然后添加极性氢并分配适当的电荷。在对接之前对配体结构进行了能量最小化。DNA靶标（3EY0）的网格盒尺寸设置为（80 × 60 × 60），网格中心坐标为（16.394, 10.415, 90.220），详尽值为4。通过将共结晶的配体重新对接在3EY0中来验证对接协议，发现RMSD小于2 ?。根据结合亲和力（kcal mol^-1）对结果对接姿势进行排名，并选择了最佳构象进行相互作用分析。分子间相互作用的可视化与分析，包括氢键、π–π堆叠和疏水接触，是使用Discovery Studio Visualizer76和PyMOL77进行的。

4.1.3 分子动力学（MD）模拟

分子动力学模拟是使用GROMACS 2021.5和云计算资源来评估配体-DNA以及配体-蛋白质复合物的稳定性和动态行为的。这些系统是通过将每个复合物放置在一个立方体模拟盒中构建的，与盒子的边缘的最小距离为10 ?，并使用TIP3P显式水模型进行溶剂化。为了中和系统并再现生理离子强度，添加了反离子（Na+/Cl?）。蛋白质模拟采用了AMBER99SB力场，而DNA则应用了兼容的AMBER参数，配体参数是通过ACPYPE使用GAFF2力场生成的。尽管OL15是为核酸优化的，但由于其在混合蛋白质-配体系统中的验证性能以及与GAFF2配体参数化的兼容性，选择了AMBER99SB。这确保了DNA-配体和蛋白质-配体模拟之间的一致性。能量最小化是使用最速下降算法进行的，随后在NVT和NPT系综下进行平衡。温度使用V-rescale恒温器维持在300 K，而压力则使用Parrinello–Rahman压强计控制在1 bar。生产模拟的时间步长为2 fs，并在所有方向上应用周期性边界条件。长程静电相互作用是使用粒子网格Ewald（PME）方法处理的，截止距离为1.0 nm。DNA-配体复合物的总模拟时间为4 ns，蛋白质-配体系统为10 ns。进行了轨迹分析，以评估系统稳定性和构象动态，包括均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）、氢键分析和主成分分析（PCA）。进一步使用MM/GBSA和MM-PBSA方法估计了结合自由能，以评估整个模拟过程中的相互作用稳定性。

4.2 通过紫外-可见光谱研究DNA相互作用

鲑鱼精子DNA（SS-DNA）溶解在蒸馏水中并搅拌24小时。SS-DNA的储备溶液在260和280 nm处的紫外吸光度（A260/A280）比为1.89，表明DNA中几乎不含蛋白质。将体积DNA溶液进一步稀释10倍，以在260 nm处显示最大吸光度。DNA储备溶液的浓度是通过在260 nm处的摩尔吸光系数（ε）值6600 M?1cm?1来测量的。化合物溶液（50 μM）在DMSO中制备，并在没有DNA的情况下记录了这些化合物的紫外-可见吸收光谱。实验重复进行，化合物的浓度保持不变，而DNA溶液的浓度则从5 μM变化到35 μM。紫外-可见吸收光谱是在Shimadzu 1700紫外-可见分光光度计上记录的。

4.3 合成s-三嗪-异靛蓝杂化物（8）

在乙醇中的1-(2-溴乙基)异靛蓝5（0.25 mmol，1.0 eq.）溶液中加入少量冰醋酸，随后加入4-溴苯氧基连接的肼基s-三嗪3（0.25 mmol，1.0 eq.）。通过薄层色谱法定期监测反应进程。在回流3-4小时后，s-三嗪-异靛蓝杂化物8从反应混合物中沉淀出来，然后过滤、干燥，并从乙醇中重新结晶以获得纯产品。黄色固体；产率：79%；熔点：246–248 °C；Rf：0.40（CHCl3: MeOH，9?:?1）；FT-IR（cm?1）：1148（C–N伸缩；内酰胺），1205（Csp2–O伸缩；醚），1343（Csp3–H弯曲；亚甲基），1482，1549（CC伸缩；芳香族），1619（CN伸缩；亚胺），1690（CO伸缩；酰胺），2980（Csp3–H伸缩），3097（Csp2–H伸缩），3187（N–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.86（s，1H，–NH），7.68–6.92（m，12H，Ar–H），4.19（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2），3.74（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.1，161.5，151.1，142.7，132.8，124.6，124.4，120.9，119.4，118.7，41.4，29.8。

4.4 合成唑连接的s-三嗪-异靛蓝杂化物（9a–f）

在乙醇中准备了相应的异靛蓝7a–d（0.25 mmol，1.0 eq.）溶液，然后加入少量冰醋酸。随后，将苯氧基连接的肼基s-三嗪3（0.25 mmol，1.0 eq.）引入反应混合物中。混合物进行回流，并通过薄层色谱法（TLC）定期监测反应进程。在回流3-4小时后，相应的三嗪基腙衍生物9a–f从反应混合物中沉淀出来。固体产物通过过滤收集，干燥后从乙醇中重新结晶以获得纯化合物。

4.4.1 1-(2-(苯并[d]噻唑-2-基硫)乙基)-3-(2-(4,6-双(4-溴苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)吲哚-2-酮（9a）

黄色固体；产率：82%；熔点：231–233 °C；Rf：0.42（CHCl3, MeOH，9?:?1）；FT-IR（cm?1）：1148（C–N伸缩；内酰胺），1281（Csp2–O伸缩；醚），1345（Csp3–H弯曲；亚甲基），1482，1560（CC伸缩；芳香族），1619（CN伸缩；亚胺），1769（CO伸缩；酰胺），2980（Csp3–H伸缩），3067（Csp2–H伸缩），3271（N–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.74（s，1H，–NH），8.02–7.13（m，16H，Ar–H），4.20（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2），3.69（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.3，166.3，164.4，159.8，156.2，151.2，149.7，143.2，136.2，135.2，132.8，126.9，125.0，124.4，121.4，118.9，116.5，113.4，110.8，43.0，33.9。

4.4.2 1-(2-(苯并[d]噁唑-2-基硫)乙基)-3-(2-(4,6-双(4-溴苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)吲哚-2-酮（9b）

黄色固体；产率：78%；熔点：221–223 °C；Rf：0.39（CHCl3, MeOH，9?:?1）；FT-IR（cm?1）：1146（C–N伸缩；内酰胺），1282（Csp2–O伸缩；醚），1340（Csp3–H弯曲；亚甲基），1480，1550（CC伸缩；芳香族），1610（CN伸缩；亚胺），1765（CO伸缩；酰胺），2980（Csp3–H伸缩），3067（Csp2–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.70（s，1H，–NH），7.69–7.11（m，16H，Ar–H），4.22（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2），3.61（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.1，164.2，161.7，161.6，151.7，151.2，142.9，141.5，136.0，132.8，125.1，124.7，124.4，123.7，120.9，119.4，118.7，110.5，56.4，29.7。

4.4.3 3-(2-(4,6-双(4-溴苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)-1-(2-((5-(4-氯苯基)-1,3,4-噁唑-2-基)硫)乙基)吲哚-2-酮（9c）

黄色固体；产率：79%；熔点：246–248 °C；Rf：0.40（CHCl3, MeOH，9?:?1）；FT-IR（cm?1）：1140（C–N伸缩；内酰胺），1278（Csp2–O伸缩；醚），1335（Csp3–H弯曲；亚甲基），1470，1550（CC伸缩；芳香族），1610（CN伸缩；亚胺），1760（CO伸缩；酰胺），2981（Csp3–H伸缩），3060（Csp2–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.65（s，1H，–NH），7.96–7.08（m，16H，Ar–H），4.21（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2），3.62（t，2H，3J = 6 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.0，164.7，161.6，153.1，151.2，144.2，135.1，131.4，132.5，131.4，130.5，128.9，126.8，124.4，122.5，118.6，112.6，110.6，49.4。

4.4.4 3-(2-(4,6-双(4-溴苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)-1-(2-(5-苯基-2H-四唑-2-基)乙基)吲哚-2-酮（9d）

黄色固体；产率：78%；熔点：209–210 °C；Rf：0.46（n-己烷: 乙酸乙酯，3?:?2）；FT-IR（cm?1）：1192（C–N伸缩；内酰胺），1205（Csp2–O伸缩；醚），1346（Csp3–H弯曲；亚甲基），1492，1571（CC伸缩；芳香族），1619（CN伸缩；亚胺），1709（CO伸缩；酰胺），2935（Csp3–H伸缩），3058（Csp2–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ（ppm）：12.71（s，1H，–NH），8.03–6.60（m，17H，Ar–H），5.02（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2），4.38（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.4，165.7，161.6，150.1，141.8，135.1，131.8，135.1，132.6，131.3，129.5，128.9，126.9，122.9，122.2，119.5，119.2，108.2，50.2；39.4。

4.4.5 3-(2-(4,6-双(4-苯氧基-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)-1-(2-(5-苯基-2H-四唑-2-基)乙基)吲哚-2-酮（9e）

黄色固体；产率：84%；熔点：236–238 °C；Rf：0.35（n-己烷: 乙酸乙酯，3?:?2）；FT-IR（cm?1）：1148（C–N伸缩；内酰胺），1205（Csp2–O伸缩；醚），1343（Csp3–H弯曲；亚甲基），1482，1549（CC伸缩；芳香族），1619（CN伸缩；亚胺），1690（CO伸缩；酰胺），2980（Csp3–H伸缩），3187（N–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ（ppm）：12.71（s，1H，–NH），8.03–6.60（m，19H，Ar–H），5.02（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2），4.38（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.4，165.6，161.5，141.7，135.1，131.4，135.1，131.4，130.5，128.9，126.8，123.8，123.3，122.2，119.4，119.2，119.2，108.2，50.2；39.4。

4.4.6 3-(2-(4,6-双([1,1′-联苯]-4-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)肼基烯)-1-(2-(5-苯基-2H-四唑-2-基)乙基)吲哚-2-酮（9f）

黄色固体；产率：78%；熔点：209–210 °C；Rf：0.46（n-己烷: 乙酸乙酯，3?:?2）；FT-IR（cm?1）：1148（C–N伸缩；内酰胺），1205（Csp2–O伸缩；醚），1343（Csp3–H弯曲；亚甲基），1482，1549（CC伸缩；芳香族），1619（CN伸缩；亚胺），1709（CO伸缩；酰胺），2935（Csp3–H伸缩），3058（Csp2–H伸缩）；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ（ppm）：12.71（s，1H，–NH），8.03–6.60（m，17H，Ar–H），5.02（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2），4.38（t，2H，3J = 8 Hz，–CH2）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：167.4，165.6，161.5，141.7，135.1，131.4，131.9，131.4，130.5，128.9，1