梯度分离中溶剂强度敏感性的标准化：比较反相色谱和离子交换色谱中有效柱长的差异

《Journal of Chromatography A》：Normalized Solvent-Strength Sensitivity for Gradient Separations: Comparing Effective Column Lengths Across Reversed-Phase and Ion-Exchange Chromatography

　　Szabolcs Fekete | Christine Vo | Wan-Chih Su
Waters Corporation, 日内瓦，瑞士

**摘要**
线性溶剂强度（LSS）模型为反相液相色谱（RPLC）中的保留行为提供了可靠的预测框架，但其扩展到离子交换色谱（IEX）时需要对溶剂强度坐标进行归一化处理。在本研究中，我们引入了一种无量纲的归一化方法，用于盐浓度和pH值梯度，从而能够直接比较不同色谱模式下的保留敏感性。我们定义了通用溶剂强度敏感性（SU）为斜率参数与其相应坐标中梯度范围的乘积，该参数能够捕捉保留因子在整个梯度范围内的变化。这一描述符有助于预测有效柱长（Leff），并支持超短柱的高通量分离设计。通过使用先前发表的数据以及新的实验数据，我们证明了SU在单克隆抗体（mAbs）、双链DNA片段、单链寡核苷酸和mRNA分析中的适用性。

**引言**
线性溶剂强度（LSS）模型常用于反相液相色谱（RPLC），用于描述溶质保留与流动相组成之间的关系[[1], [2], [3], [4], [5]]。在其经典形式中，该模型将保留因子（k）的对数与流动相中有机改性剂的体积分数（φ）相关联。体积分数的定义范围是从纯水洗脱液（φ = 0）到纯有机溶剂（φ = 1）。这种构建方式具有实际优势，因为它提供了一个无量纲的独立变量，使得LSS方程中的斜率参数（S）变得无量纲且可以在不同方法和溶质之间进行比较。然而，当将LSS框架扩展到其他色谱模式（如离子交换色谱IEX或疏水相互作用色谱HIC）[[6], [7], [8], [9]]时，关于溶剂强度变量的正确定义和归一化方法就会出现问题。在IEX中，洗脱通常不是由有机成分控制，而是由竞争性反离子的浓度（盐浓度梯度）或质子活性（pH值梯度）控制的；在HIC中，则通过降低流动相中的盐浓度来实现洗脱。因此，RPLC中的φ定义不能直接应用于IEX或HIC：要么使用具有单位（例如mol/L）的浓度值，这会使S变得有量纲；要么使用无量纲转换方法，但这些方法可能缺乏明确的参考状态，从而影响拟合参数的物理解释。

**本研究的目的**
本研究旨在为IEX建立溶剂强度坐标，以确保在不同实验和洗脱模式（盐浓度和pH值梯度）之间保持无量纲的可比性。需要强调的是，本研究并不试图从第一性原理热力学的角度描述离子交换过程中的保留行为，而是专注于从梯度实验中得到的半经验LSS斜率参数的归一化和解释，在这些实验中隐含地考虑了分析物电荷、配体密度和反离子性质等因素。

**盐浓度梯度IEX中的归一化**
在RPLC中，LSS方程通常表示为：
log k = log k? – Sφ
其中k是保留因子，k?是在纯水洗脱液（最弱保留）中观察到的保留因子，φ是有机改性剂的体积分数（无量纲），S是溶剂强度参数（无量纲）。由于φ被归一化在0到1之间，S具有一个与实际使用的梯度范围无关的通用尺度。

**结果与讨论**
本研究将溶剂强度敏感性参数（S）视为从梯度实验中得到的半经验描述符；因此，与缓冲液类型（例如，排除型缓冲液与交换型缓冲液离子）、反离子化学性质或特定吸附现象相关的效应会反映在S的拟合值中，但这些效应并未被明确建模。

**第3.2–3.5节研究的分析物**
第3.2–3.5节研究的分析物被选为代表当前关键和新兴应用领域的生物分子类别。

**结论**
在本研究中，我们为IEX建立了溶剂强度坐标，以确保在不同实验和洗脱模式（盐浓度和pH值梯度）之间保持无量纲的可比性。通过引入归一化的溶剂强度坐标并定义通用敏感性参数（SU），我们能够直接比较不同盐浓度和pH值梯度下的“开启-关闭”洗脱行为。SU与有效柱长之间的预测关系表明，大分子（包括单克隆抗体、双链DNA片段和单链寡核苷酸）的保留行为可以通过该参数进行预测。

**作者贡献声明**
Szabolcs Fekete：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。
Christine Vo：撰写——审阅与编辑、研究。
Wan-Chih Su：撰写——审阅与编辑、概念化。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。