利用基于甘氨酸-甜菜碱类似物离子液体的水相双相系统，可持续地耗尽高丰度的血清蛋白，以检测被掩盖的生物标志物

《Journal of Chromatography A》：Sustainable depletion of high-abundance serum proteins using aqueous biphasic systems based on glycine-betaine analogue ionic liquids for the detection of masked biomarkers

　　马特乌斯·M·佩雷拉（Matheus M. Pereira）|索尼娅·N·佩德罗（Sónia N. Pedro）|弗朗西斯卡·A·席尔瓦（Francisca A. Silva）|阿米努·穆罕默杜（Aminou Mohamadou）|若昂·A·P·库蒂尼奥（Jo?o A.P. Coutinho）|玛拉·G·弗雷雷（Mara G. Freire）
CICECO – 阿维罗材料研究所（Aveiro Institute of Materials），阿维罗大学化学系（Department of Chemistry），葡萄牙阿维罗，邮编3810-193

**摘要**
使用更可持续的分析策略检测人血清中的蛋白质生物标志物仍受到高丰度蛋白质（尤其是人血清白蛋白（HSA）和免疫球蛋白G（IgG）主导的限制，这限制了对低丰度目标的检测。为了解决这些限制，引入了由甘氨酸-甜菜碱类似物离子液体（AGB-ILs）组成的水相双相系统（ABS）作为选择性去除高丰度血清蛋白质的绿色样品制备策略。在合成并表征了AGB-ILs（包括其热性质和生态毒性）后，将其与柠檬酸缓冲液结合，并筛选了其形成ABS的能力。通过界面沉淀，HSA和IgG在一步中得到了有效去除，从而能够使用尺寸排阻高效液相色谱法结合紫外检测（SE-HPLC-UV）检测到之前被抑制的分析物（如转铁蛋白）。这表明，有效的样品预处理可以使得与免疫测定和质谱法相比，使用更简单的分析技术成为可能。所提出方法的可持续性通过AGREE（Analytical GREEnness）、AGREEprep（样品制备的绿色分析性）和BAGI（生物分析绿色指数）等指标进行了评估，证实了其低毒性、减少的试剂消耗以及改进工作流程整合的潜力。最终，这项工作扩展了基于IL的ABS在蛋白质去除中的应用范围，确立了受生物启发的ILs作为绿色生物分析工作流程中有前景的工具。

**1. 引言**
生物医学的进步在疾病监测、诊断和管理中发挥着关键作用，蛋白质组学和基因组学的技术进步改善了现代医疗保健[1]。在人体液体中检测基因和蛋白质生物标志物可以为健康状况提供有价值的见解[1]。然而，与基因组学相比，蛋白质组学面临挑战，因为人体液体的复杂性和动态性，特别是在检测蛋白质生物标志物方面[2,3]。血浆和血清是生物分析的首选液体，它们含有高丰度的蛋白质，如人血清白蛋白（HSA）和免疫球蛋白G（IgG），这些蛋白质占总蛋白质含量的75%以上[4],[5],[6]。这些蛋白质会干扰低浓度目标蛋白质的检测，影响免疫测定和质谱等分析技术。此外，蛋白质生物标志物的固有不稳定性增加了变性和降解的风险，进一步降低了检测的准确性和重复性[7,8]。克服这些限制通常需要高度专业的技术，这些技术耗时、成本高昂且需要专家操作[7,8]。因此，有效的样品预处理（包括去除、分馏和富集策略）对于确保可靠的生物分析至关重要[9]。
本研究重点关注样品预处理的去除阶段，即去除高丰度蛋白质以增强目标分析物的检测和鉴定。使用染料、蛋白质和免疫亲和配体的固相萃取已被广泛采用，并且有用户友好的试剂盒格式可供商业使用[9]。然而，这些方法往往受到非特异性结合和无法区分异构体的限制，导致效率、产率和选择性较低[9]。此外，它们的高成本和有限的样品装载容量限制了其更广泛的应用，并影响了其可持续性[9]。使用聚合物、盐和有机溶剂进行蛋白质沉淀是一种更简单的去除策略，但通常会导致目标分析物的丢失[10]。
通过使用水相双相系统（ABS）或水相两相系统（ATPS）可以解决这些标准方法的缺点[11]。ABS是一种液-液萃取技术，通常不需要挥发性有机溶剂。相反，它们依赖于在水中混合两种组分（通常是两种聚合物或一种聚合物和一种盐）达到特定浓度[12]。ABS因其富水环境和高度可调的配方而与其他液-液萃取方法不同[12]。因此，它们为从生物液体（如蛋白质[13],[14],[15],[16]和细胞外囊泡[17],[18],[19]）中提取生物标志物提供了适当的条件。然而，聚合物ABS受到相粘度、极性范围和选择性差的限制，这阻碍了在一步中完全分离目标分析物[17,19]。因此，可能需要额外的纯化步骤和专用设备，这对聚合物系统在临床实验室分析中的广泛应用构成了重大障碍[18]。
离子液体（ILs）因其可定制的溶剂性质而成为ABS中的有价值成分，特别是在单步配置中提高了生物样品处理的性能[20]。基于IL的ABS中丰富的阳离子-阴离子组合和相形成组分对为优化蛋白质去除和改善样品预处理中的应用中的分析物回收提供了灵活的平台[21]。随着对受生物启发的ILs（如来自胆碱和氨基酸的ILs）的兴趣增加，这些系统与绿色分析化学原则更加一致，有助于减少生物分析过程中的环境影响[22],[23],[24],[25]。此外，使用受生物启发的ILs形成的ABS通常提供更温和的条件，保护了敏感生物分子（如蛋白质）的完整性，同时确保目标分析物的有效和选择性提取，并最小化降解风险[26]。
在受生物启发的替代方案中，具有甘氨酸-甜菜碱型阳离子核心的ILs（以下简称甘氨酸-甜菜碱类似物ILs（AGB-ILs）也作为ABS的可行相形成组分[27,28]。从绿色样品制备的角度来看[24]，AGB-ILs因其结构类似于天然存在的氨基酸衍生物而受益（符合绿色样品制备的原则2——使用更安全的溶剂和试剂——以及原则10——确保操作者的安全程序[27],[28],[29],[30]]。此外，与基于咪唑的同类物相比，AGB-ILs在ABS形成方面具有更高的成本效益和性能，因为它们所需的相形成组分较少（符合绿色样品制备的原则5——最小化样品、化学物质和材料的用量[27]）。AGB-ILs相对较高的疏水性同时保持水溶性，有利于界面去除干扰的生物分子，有助于将去除、分馏和富集步骤集成到一步中（符合绿色样品制备的原则7——整合步骤并促进自动化[21,27,30]）。
借助基于IL的ABS的性质，并通过受生物启发的ILs进一步改进，本研究报道了从人血清中去除高丰度蛋白质，从而检测到之前无法检测到的蛋白质。与之前使用的基于咪唑、铵或磷的ILs相比[21]，这里选择AGB-ILs以更好地符合绿色样品制备原则[24]。尽管将AGB-ILs作为相形成组分是一种渐进式的改进[21]，但这项工作的主要贡献在于基于ABS介导的去除分析策略。该策略基于使用尺寸排阻高效液相色谱法结合紫外检测（SE-HPLC-UV）进行生物分析，在这种情况下，目标蛋白质会被高丰度的血清组分掩盖。通过这种预处理策略，可以使用更简单的分析技术，减少对传统免疫测定或质谱法的依赖。通过合成、物理化学表征、毒性评估以及在盐缓冲液存在下确定ABS三元相图，设计出了AGB-ILs，从而实现了高丰度蛋白质HSA和IgG在ABS界面相中的去除。去除后，在富含AGB-IL的相中检测到了转铁蛋白，证实了所提出的分析工作流程的潜力。为了评估所提出方法的可持续性和操作性能，应用了补充指标——AGREE（Analytical GREEnness[31]）、AGREEprep（样品制备的绿色分析性[32]）和BAGI（生物分析绿色指数[33]——来评估试剂安全性、废物产生、能源使用和分析可访问性，符合绿色和分析化学的理念[34,35]。

**2. 材料与方法**
**2.1. 材料**
用于合成AGB-ILs的所有三级胺（N-甲基吡咯烷，纯度≥97 wt%，CAS 120-94-5；三乙胺，纯度≥99 wt%，CAS 121-44-8；三丙胺，纯度≥98 wt%，CAS 102-69-2；三丁胺，纯度≥98 wt%，CAS 102-82-9）、乙酸乙酯（纯度≥99.5 wt%，CAS 141-78-6）、乙醚（纯度≥99.0 wt%，CAS 60-29-7）、4-溴丁酸乙酯（纯度≥97 wt%，CAS 2969-81-5）和溴乙酸乙酯（纯度=98 wt%，CAS 105-36-2）均从Sigma-Aldrich购买。银糖酸盐（CAS 2673-17-8）、乳酸银（CAS 15768-18-0）、丙酮酸银（CAS 62163-16-0）、二氰胺银（CAS 51342-29-1）和水杨酸银（CAS 528-93-8）是由硝酸银（AgNO3，纯度≥99.0 wt%，CAS 7761-88-8）和相应的钠盐（纯度≥97 wt%，CAS 128-44-9；乳酸钠，纯度≥99.0 wt%，CAS 72-17-3；丙酮酸钠，纯度≥99 wt%，CAS 113-24-6；二氰胺钠，纯度≥97.0 wt%，CAS 1934-75-4；水杨酸钠，纯度≥99.5 wt%，CAS 54-21-7）以1:1.1的摩尔比混合制备的。用于ABS制备的缓冲液由Sigma-Aldrich提供的柠檬酸钾（K3C6H5O7·H2O，纯度≥99 wt%，CAS 6100-05-6）和Fisher Scientific提供的柠檬酸（C6H8O7·H2O，纯度=100 wt%，CAS 5949-29-1）组成。
纯IgG（纯度≥95 wt%，CAS 9007-84-5）和人转铁蛋白（纯度≥98 wt%，CAS 11096-37-0）均从Sigma-Aldrich购买，而HSA（纯度=96 wt%，CAS 70024-90-7）则从Alfa Aesar购买。人血清是从多位捐赠者处获得的混合样本，代表了典型的人血清基质。该样本允许对ABS介导的生物分析应用的工作流程进行可靠的概念验证。
用于HPLC分析的流动相由十二水合磷酸二钠（Na2HPO4·7H2O，纯度=98?102 wt%，CAS 7782-85-6）、一水合磷酸钠（NaH2PO4，纯度=99?100.5 wt%，CAS 7558-80-7）和氯化钠（NaCl，纯度=99.5 wt%，CAS 7647-14-5）组成，均来自Panreac AppliChem。SDS-PAGE分子量标准品（全范围标记分子量）从VWR购买。用于SE-HPLC分析的超纯水（CAS 7732-18-5）经过双蒸馏并用Milli-Q plus 185水纯化装置处理。人转铁蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（ab187391）来自Abcam。

**2.2. AGB-ILs的合成与表征**
AGB-ILs的合成途径（参见补充材料中的图S1）始于相应三级胺与溴代烷酸乙酯的反应，以获得基于Br的AGB-ILs，如先前报道的[27,36]。随后，对基于Br的AGB-ILs进行重排反应，以获得本研究中研究的新合成AGB-ILs。有关每种特定AGB-IL的详细合成信息，请参阅补充材料。图1显示了本研究中使用的所有AGB-IL的化学结构。

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**图1. AGB-ILs的化学结构：**
(i) [MepyrNC4]+, (ii) [Et3NC4]+, (iii) [Pr3NC4]+, (iv) [Pr3NC2]+, (v) [Bu3NC4]+, (vi) Br-, (vii) [Sac]-, (viii) [Lac]-, (ix) [Pyr] -, (x) [Dca]- 和 (xi) [Sal]-。
在将AGB-ILs真空干燥至最终水分含量低于0.06 wt%后，使用Karl Fischer滴定法（Metrohm 787 KF Titrino）和Hydranal 34805及Hydranal 37817（Fluka）进行定量。所有合成IL的元素分析（C、H、N和S含量）在PerkinElmer 2400 C、H、N和S元素分析仪上进行。1H和13C核磁共振（NMR）在室温下使用Bruker AC 30光谱仪（1H 250 MHz，13C 62.5 MHz）和DMSO-d6作为溶剂进行记录。AGB-ILs的熔点和分解温度通过具有差示扫描量热能力的热重分析仪（Mettler Toledo TGA/DSC 1 LF）测定。仪器使用纯度≥99.99 wt%的铟（CAS 7440-74-6）作为标准进行校准，所有测量均使用STAR软件进行分析。样品在铝盘中制备，并在氮气流（40 mL·min-1）下以5 K·min-1的加热速率从303.15 K加热至873.15 K。温度的标准不确定性为0.2 K。
AGB-ILs的毒性使用Standard Microtox?液相生物测定法[37]进行评估。Microtox?基于Aliivibrio fischeri（A. fischeri）（菌株NRRL B-11177）在15 °C下暴露于AGB-ILs溶液后的生物发光抑制。遵循标准81.9%测试协议，其中A. fischeri暴露于不同浓度的AGB-IL水溶液（即从0到81.9 wt%，以100%为AGB-IL储备溶液的浓度）。在暴露于每种水溶液5分钟、15分钟和30分钟后，测量A. fischeri的生物发光，并与空白对照进行比较。数据通过最小二乘法进行非线性回归拟合，从而确定了暴露5分钟、15分钟和30分钟时的EC50值。EC50（中效浓度）是指诱导生物发光抑制50%所需的估计浓度，并带有95%的置信区间。2.3. 基于AGB-IL的ABS三元相图的确定使用了大约90%重量的每种AGB-IL的水溶液以及K3C6H5O7/C6H8O7混合物的水溶液（作为pH约为7的缓冲溶液，摩尔比约为15:1，忽略K3C6H5O7·H2O和C6H8O7·H2O中的复合水），在25°C和常压下通过成熟的浊点滴定法确定共晶曲线[27]。通过连续向AGB-IL水溶液中添加K3C6H5O7/C6H8O7水溶液和纯水，并在持续搅拌下进行这一过程。这种方法可以依次获得两相区域（浑浊溶液）和单相区域（透明溶液）。每次添加滴液后，都会对溶液中所有成分进行重量定量（±10^-4克），从而确定三元系统的组成。ABS共晶曲线的实验数据使用Merchuk等人最初提出的方程式1进行拟合[38]：(1)[AGB?IL]=Aexp[(B[salt]0.5)?(C[salt]3)]其中[AGB?IL]和[salt]分别表示AGB-IL和盐的重量百分比，A、B和C是拟合常数。为了全面表征ABS相图，使用Merchuk等人最初提出的重量法确定了连接线（TLs）[38]，该方法在IL-盐基ABS领域得到了广泛的应用和验证[39]。每个三元相图制备了两个两相混合点，剧烈搅拌后离心10分钟，并在25°C下至少分离10分钟以达到平衡。分离后，分别称量顶部和底部的相。对于所有系统，顶部相主要由AGB-IL组成，而底部相主要由K3C6H5O7/C6H8O7组成。每个单独的TL是通过杠杆臂规则确定的，该规则应用了顶部AGB-IL富集相与整个系统重量之间的关系。TL的确定是通过解决以下四个方程（方程式2至5）和四个未知变量（[AGB?IL]、[salt]、[salt]AGB?IL和[salt]salt）来完成的：(2)[AGB?IL]salt=Aexp[(B[salt]AGB?IL0.5)?(C[salt]AGB?IL3)](3)[AGB?IL]salt=Aexp[(B[salt]salt0.5)?(C[salt]salt3)](4)[AGB?IL]AGB?IL=[AGB?IL]Mα?1?αα[AGB?IL]salt(5)[salt]AGB?IL=[salt]Mα?1?αα[salt]salt其中下标“AGB-IL”、“salt”和“M”分别表示顶部AGB-IL富集相、底部盐富集相和整个混合物。α表示顶部AGB-IL富集相与整个混合物之间的重量比。连接线长度（TLL）是使用方程式6计算的，表示顶部AGB-IL富集相和底部盐富集相组成之间的欧几里得距离。(6)TLL=([salt]AGB?IL?[salt]salt)2+([AGB?IL]AGB?IL?[AGB?IL]salt)2在共晶曲线的表示和TL的确定中，盐的组成仅指C6H5K3O7和C6H8O7的含量，而缓冲液中的水分被视为三元系统水分的一部分。2.4. 使用基于AGB-IL的ABS进行血清蛋白耗竭和转铁蛋白提取制备了固定组成的两相混合物，包含30%重量的AGB-IL + 60%重量的柠檬酸盐缓冲溶液（K3C6H5O7/C6H8O7，pH 7）+ 10%重量的人类血清（原样），变化仅限于AGB-IL的结构。每种混合物的最终质量均为2克，并在规定的条件下达到平衡。虽然HSA和IgG通过沉淀在ABS中间相中被耗竭，但顶部和底部相被小心分离以便通过SE-HPLC-UV进行定量。使用配备尺寸排阻柱（Shodex Protein KW-802.5；8 mm × 300 mm）的Chromaster色谱仪（VWR Hitachi）进行分析。流动相由磷酸盐缓冲液（pH 7，100 mM）和NaCl（0.3 M）水溶液组成。分析分离采用等速洗脱，流速为1 mL·min^-1，进样体积为25 μL。柱子和自动采样器保持在25°C。UV检测器设置在280 nm处。总分析时间为40分钟，发现IgG和HSA的保留时间分别约为15.7分钟和17.1分钟。每个水相在注射前按1:10的体积比（v/v）在流动相中稀释。未添加血清的ABS相的空白对照样品也进行了常规分析，以消除IL和盐对UV信号的潜在干扰，确保蛋白质定量准确。定量采用外部标准校准方法，两种蛋白质的相关系数（R2）均高于0.99，支持线性。分析性能参数的总结，包括校准浓度范围以及检测限（LOD）和定量限（LOQ），在表S1（补充材料）中提供。当SE-HPLC-UV未观察到HSA或IgG的可检测信号时，认为耗竭量在方法的LOD范围内是定量的。由于直接分析研究系统中的中间相存在分析挑战，因此通过质量平衡方法估计了在中间相沉淀的蛋白质量，计算方法为初始血清蛋白含量与水相中剩余蛋白含量之间的差值。这种方法假设了理想的相分离，并且在处理过程中分析物损失可以忽略不计，可能会受到相分离步骤中的实验限制的影响，包括相之间的潜在交叉污染。尽管如此，它提供了可靠的蛋白质耗竭量测定，并且之前已由我们验证[21]。实验至少重复进行两次，当所有重复实验中都观察到定量耗竭时，不报告标准偏差。HSA和IgG的耗竭效率DEHSA%和DEIgG%是固体中间相中蛋白质含量与总混合物中蛋白质含量之间的百分比比，根据以下公式定义：(7)DEHSA%=wHSAIntwHSAAGB?IL+wHSASalt+wHSAInt100(8)DEIgG%=wIgGIntwIgGAGB?IL+wIgGSalt+wIgGInt100其中wHSAAGB?IL、wHSASalt、wHSAInt、wIgGAGB?IL、wIgGSalt和wIgGInt分别是AGB-IL富集相、盐富集相和固体中间相中的HSA或IgG的总重量。作为一个代表性系统，分析了由30%重量的[Bu3NC4]Br + 60%重量的柠檬酸盐缓冲溶液（K3C6H5O7/C6H8O7，pH 7）+ 10%重量的人类血清组成的ABS的相，以测定人类转铁蛋白浓度。这项分析使用SE-HPLC-UV进行，并参考了之前提到的条件和预先建立的线性校准曲线（表S1，补充材料）。此外，还根据制造商的说明通过ELISA测定了原始血清样本中的转铁蛋白浓度，结果为1.8 ± 0.1 g·L^-1，与参考值[40]一致。转铁蛋白向AGB-IL富集相的回收率RYTF%按以下公式确定：(9)RYTF%=wTFAGB?ILwTFserum100其中wTFAGB?IL是AGB-IL富集相中的转铁蛋白总重量，wTFserum是原始血清样本中的转铁蛋白总重量。使用以下公式确定了SE-HPLC-UV介导的耗竭后的相对定量误差：(10)Relativeerror%=[TF]originalserum?[TF]depletedserum[TF]originalserum其中[TF]originalserum是通过ELISA测定的原始血清中的转铁蛋白浓度，[TF]depletedserum是通过SE-HPLC测定的耗竭血清样本中的转铁蛋白浓度。上述方法支持了使用SE-HPLC-UV检测血清转铁蛋白的分析工作流程的开发。如图2所示，用AGB-IL和柠檬酸盐缓冲液的水溶液处理血清可以有效地耗竭固体中间相中的高丰度蛋白质，而分离出的顶部（AGB-IL富集）相可以直接分析，从而能够定量之前被掩盖的生物标志物。下载：下载高分辨率图像（237KB）下载：下载全尺寸图像图2. 使用基于AGB-IL的ABS耗竭后，通过SE-HPLC-UV检测之前被掩盖的蛋白质生物标志物的分析设置。2.5. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质鉴定将每个ABS相的样品按2:1（v/v）稀释在解离缓冲液中，该缓冲液由2.5 mL的0.5 M Tris-HCl pH 6.8、4.0 mL的10%（w/v）SDS溶液、2.0 mL的甘油、2.0 mg的溴酚蓝和310 mg的二硫苏糖醇（DTT）组成。将整个溶液在95°C下加热5分钟，以通过还原二硫键来变性蛋白质，从而部分克服三级蛋白质折叠并破坏四级蛋白质结构。电泳在聚丙烯酰胺凝胶上进行（堆叠层：4%；分离层：20%），使用由250 mM Tris-HCl、1.92 M甘氨酸和1% SDS组成的运行缓冲液，使用GE Healthcare Life Sciences的Amersham ECLTM Gel。蛋白质用Coomassie Brilliant Blue G-250 0.1%（w/v）、甲醇50%（v/v）、乙酸7%（v/v）和水42.9%（v/v）进行染色。所有凝胶在室温下的轨道摇床中以中等速度振荡2-3小时。然后在含有7%（v/v）乙酸、20%（v/v）甲醇和73%（v/v）水的溶液中进一步染色2-3小时。分子量标准品用作蛋白质标准。所有凝胶使用Image Lab 3.0（BIO-RAD）分析工具进行分析。3. 结果与讨论3.1. 开发用于ABS形成的AGB-ILs研究的AGB-ILs由甘氨酸-甜菜碱型阳离子核心组成，即1-(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-methylpyrrolidin-1-ium ([MepyrNC4]+) 和 N,N,N-trialkyl(ω-ethoxy-ω-oxoalkyl)-1-ammonium ([X3NCm]+，其中X = ethyl, Et; propyl, Pr; 和 butyl, Bu; 以及m = 2, 4），并与六种不同的阴离子结合，分别是溴化物 ([Br]-)、糖酸盐 ([Sac]-)、乳酸盐 ([Lac]-)、丙酮酸盐 ([Pyr]-)、二氰胺 ([Dca]-) 和水杨酸盐 ([Sal]-)。研究了以下AGB-ILs：N,N,N-triethyl(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium bromide, [Et3NC4]Br; N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium bromide, [Pr3NC4]Br; N,N,N-tri(n-butyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium bromide, [Bu3NC4]Br; 1-(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-methylpyrrolidin-1-ium bromide, [MepyrNC4]Br; N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium saccharinate, [Pr3NC4][Sac]; N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium lactate, [Pr3NC4][Lac]; N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium pyruvate, [Pr3NC4][Pyr]; N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium dicyanamide, [Pr3NC4][Dca]; N,N,N-tri(n-propyl)(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1-ammonium salicylate, [Pr3NC2][Sal]; 和 N,N,N-tri(n-propyl)(4-ethoxy-4-oxobutyl)-1-ammonium salicylate, [Pr3NC4][Sal]（参见图1）。基于Br的AGB-ILs的合成、表征和生态毒性已通过1H和13C NMR、元素分析、熔点测定、热分解分析和Standard Microtox?液相生物测定等方法进行了报道[27]。在本工作中，合成了包含其他阴离子的额外AGB-ILs并进行了全面表征，以扩展这些化合物的结构谱，并更全面地了解它们的物理化学和毒理学特性。使用1H和13C NMR以及元素分析对新报告的AGB-ILs进行了结构确认和纯度评估，表明纯度大于99 wt%，且未检测到杂质。与基于Br的[27]类似，其余的AGB-ILs在100°C以下为液态，熔点从30.58°C到98.51°C不等，分解温度从151.23°C到189.64°C不等。所有确认其化学结构、纯度和热特性的数据在表S2-S7（补充材料）中提供。为了评估AGB-ILs在更环保的样品制备方法中的潜力，特别强调了遵守原则2（使用更安全的溶剂和试剂）[24]，对其对A. fischeri的生态毒性进行了评估。5分钟、15分钟和30分钟后的完整EC50数据在表S8（补充材料）中呈现，确认了随时间变化的一致毒性趋势，使用30分钟的数据进行讨论以提供保守的评估。新报告的AGB-ILs的EC50值（mg.L^-1）按以下顺序降低，其中较低的EC50表示更高的毒性：[Pr3NC4][Lac]（1713.5）> [Pr3NC4][Dca]（672.3）> [Pr3NC4][Pyr]（646.5）> [Pr3NC4][Sal]（304.7）> [Pr3NC4][Sal]（137.5）> [Pr3NC4][Sac]（38.6）。尽管具有共同的阳离子骨架，AGB-ILs在碳链长度和阴离子结构上有所不同，从而可以区分它们在毒性中的作用。较长的碳链（[Pr3NC2][Sal] vs. [Pr3NC4][Sal]）由于其增强的疏水性，能够增加干扰甚至破坏细胞膜的能力，导致A. fischeri的生物发光降低，这与公认的“侧链效应”[41]一致。考虑到具有共同阳离子([Pr3NC4]+)但不同阴离子的AGB-ILs，将羟基替换为羰基([Lac]- vs. [Pyr]-)以及引入芳香环([Lac]- vs. [Sal]- 和 [Sac]-)增强了这些化合物的毒性，这与一些文献发现一致[41,42]。具有线性结构的[Dca]-，带有-CN基团，表现出较低的毒性。相比之下，简单的卤化物阴离子溴化物([Pr3NC4]Br [27])的EC50值为2018.7 mg.L^-1，是毒性最低的阴离子。除了[Pr3NC4][Sac]外，所有AGB-ILs对A. fischeri均无毒性，因为它们在30分钟时的EC50值符合欧洲法规标准（EC50 > 100 mg·L^-1）[43]。与市售的ILs（如1-butyl-3-methylimidazolium bromide（735.9 mg.L^-1 [44]）、tetrabutylammonium bromide（128.6 mg.L^-1 [28]）和tetrabutylphosphonium bromide（172.8 mg.L^-1 [44]）相比，AGB-ILs可以在结构上进行调整，以显示与这些参考化合物相当甚至更低的毒性水平。这些结果表明，AGB-ILs是可行的蛋白质去除方法工具。为了确定可用于进一步蛋白质去除研究的液-液萃取系统的混合物组成，我们在25°C和常压下测定了含有AGB-ILs和柠檬酸盐缓冲液的ABS的三相图。图3展示了25°C和pH≈7时AGB-ILs + K3C6H5O7/C6H8O7 + 水系统的双相曲线。相关数据，包括三相图组成（以重量分数表示）、Merchuk方程回归参数和TL数据，见补充材料中的表S9-S12。关于基于Br的AGB-ILs的数据在其他地方有报道[27]。下载：下载高分辨率图像（222KB）下载：下载全尺寸图像图3. 由AGB-IL + K3C6H5O7/C6H8O7 + H2O在25°C和pH 7时形成的ABS的双相曲线：(A) [Pr3NC2][Sal]（蓝色方块）；[Pr3NC4][Sal]（红色三角形）；(B) [Pr3NC4][Pyr]（黄色三角形）；[Pr3NC4][Lac]（蓝色圆圈）；[Pr3NC4]Br（绿色方块）[27]；[Pr3NC4][Sal]（红色三角形）；[Pr3NC4][Sac]（紫色圆圈）；[Pr3NC4][Dca]（橙色菱形）。在所有基于AGB-IL的ABS中，双相区位于溶解度曲线上方，而单相区位于下方。较大的双相区域表明更强的液-液分离能力，即AGB-IL更容易被柠檬酸盐盐析出。图3A通过比较[Pr3NC2][Sal]和[Pr3NC4][Sal]系统展示了阳离子烷基链长度的影响。与基于IL的ABS形成的通用规则以及之前对基于Br的AGB-ILs的观察结果一致[27]，较长链的[Pr3NC4][Sal]由于其更高的疏水性，更容易发生相分离，从而促进盐析。图3B展示了阴离子性质对ABS形成的影响，其排序如下：[Pr3NC4][Pyr] < [Pr3NC4][Lac] < [Pr3NC4]Br < [Pr3NC4][Sal] ≈ [Pr3NC4][Sac] < [Pr3NC4][Dca]。芳香族（[Sal]-和[Sac]-）和氰基（[Dca]-）阴离子有助于ABS的形成，而来自单羧酸的阴离子（[Lac]-和[Pyr]-）则限制了液-液分离。为了进一步评估相分离效率，我们在固定混合物组成（30/30 wt% AGB-IL/盐，见补充材料中的表S12）下测定了所有研究的基于AGB-IL的ABS的TLL（最低液-固分离长度）。较长的TLL表明AGB-IL富集相和盐富集相之间的组成差异较大，通常与更好的相分离相关。在阳离子系列中，TLL的顺序为[Pr3NC4][Lac]（77.73）< [Pr3NC4][Pyr]（85.89）< [Pr3NC4]Br（87.96）< [Pr3NC4][Sal]（91.79）< [Pr3NC4][Sac]（91.92）< [Pr3NC4][Dca]（92.51），而对于固定的阴离子，[Pr3NC2][Sal]（88.92）的TLL比[Pr3NC4][Sal]（91.92）短。这些结果与AGB-IL的疏水性特征一致，因为亲水性较低的IL需要更少的柠檬酸盐盐来形成ABS，从而产生更长的TLL和更有效的相分离。总体而言，结构和物理化学特性的综合分析、良好的生态毒性和相行为表明，更具疏水性的AGB-ILs能有效地形成ABS，为蛋白质去除提供了潜在途径，并指导了后续去除工作流程的设计。

3.2. 使用基于AGB-IL的ABS去除高丰度血清蛋白
在评估了创建基于AGB-IL的ABS所需的混合物组成后，研究了它们作为血清蛋白去除策略的能力。使用双相区域内的常见混合物组成，评估了所有基于AGB-IL的ABS对HSA和IgG的去除效率。该组成包括30 wt%的AGB-IL、60 wt%的柠檬酸盐缓冲液（K3C6H5O7/C6H8O7，浓度为50 wt%在水中的溶液，pH 7）以及直接加入系统的10 wt%的人血清。为了平衡高效的蛋白质沉淀与减少样品和化学物质的使用，如绿色样品制备原则5（最小化样品、化学物质和材料的量）所倡导的，使用了含有10 wt%血清的2 g ABS [24]。
在所有系统中，上层相富含AGB-IL，而大部分盐则存在于下层相中。HSA和IgG在任一水相中均未检测到，至少在SE-HPLC-UV的LOD（检测限）以上浓度下未检测到，这符合材料和方法中定义的定量去除要求。高丰度血清蛋白去除后，构成了大部分固体中间相。所得结果总结在补充材料中的表S13中。
所有基于AGB-IL的ABS都能在一步中高效去除高丰度血清蛋白。这与基于增强疏水性和水混溶性的合理设计一致，这是ABS形成的关键要求。固有的疏水性可能促使HSA和IgG在中间相中沉淀，促进蛋白质-蛋白质相互作用和聚集，正如在其他ABS中观察到的[21]。尽管HSA和IgG的定量沉淀可能是由于变性或结构状态的变化，但这种现象不影响下游生物标志物的检测。
还应注意，所有系统都是在固定的双相组成下研究的，并且都呈现出明确的AGB-IL富集相和盐富集相。然而，[Pr3NC4][Sac]和[Pr3NC4][Dca]的行为有所不同，导致形成了较大的固体中间相，并且AGB-IL富集相出现了凝胶化现象。这种凝胶化取决于所研究条件下的AGB-IL化学结构。[Pr3NC4][Sac]和[Pr3NC4][Dca]是研究过的最疏水的AGB-IL之一，这体现在它们形成ABS的能力（图3）以及相对较长的TLL（见补充材料中的表S12）。这些系统中AGB-IL富集相的水含量相对较低（<20 wt%），这可能是导致该相凝胶化的原因。因此，这些系统在技术上不适合生物分析应用。
基于AGB-IL的ABS所实现的去除效率超过了大多数商业去除柱和试剂盒的效率，包括基于染料亲和力、蛋白质配体和/或免疫亲和力的试剂盒，以及化学沉淀和其他类型的ABS（例如，聚合物、胶束和商业IL基系统），如表1所示。染料配体亲和力和蛋白质配体亲和力柱被认为是去除HSA和IgG的金标准[45,46]；然而，如果需要去除其他高丰度蛋白，则需要开发混合技术[9]。大多数商业试剂盒可以使用不同类型的亲和树脂和柱同时去除多种蛋白质。然而，这些试剂盒受到以下限制：(i) 多次且耗时的平衡、吸附和/或解吸步骤（40分钟 - >2小时）；(ii) 蛋白质和免疫亲和配体价格过高；(iii) 样品装载量低（10-50 μL）；(iv) 产率低[47]。通过使用受天然化合物启发的IL和可生物降解的盐，基于AGB-IL的ABS可以在快速工作流程中每克系统使用0.1克血清高效去除HSA和IgG。

表1. 常见人类血清蛋白去除方法的评估
去除技术 商标名称 描述 去除的蛋白质 样品装载量 处理时间 检测方法兼容性 去除效率 制造商/参考文献
染料配体亲和力 HiTrap? Blue柱 Affi-gel blue柱，其中cibacron blue与Sepharose连接 HSA 50-200 mL 未指定 电泳和离子交换色谱 98% (HSA) GE Healthcare Life Sciences/[45]
蛋白质配体亲和力 HiTrap? Protein G柱 Protein G Sepharose IgG ≈2 mL 未指定 未指定 100% (IgG) GE Healthcare Life Sciences/[46]
免疫亲和力 Pierce? Top 2 Abundant Protein Depletion Spin Columns 抗HSA和抗IgG抗体固定在旋转柱上 HSA, IgG 10 μL ≈40 min 1-D或2-D凝胶电泳和质谱 > 95% (HSA); > 90% (IgG) Thermo Fisher Scientific/[47]
免疫亲和力 Pierce? Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns 高特异性抗体固定在旋转柱上 HSA, IgG + 10种高丰度蛋白 10 μL ≈60 min 1-D或2-D凝胶电泳和质谱 > 95% (所有蛋白质) Thermo Fisher Scientific/[47]
免疫亲和力 Albumin and IgG Depletion SpinTrap TMM 由两种珠状介质组成的混合物，含有重组表达的小单链抗体配体 HSA, IgG 25 μL 未指定 1-D或2-D凝胶电泳和质谱 > 95% (HSA); > 90% (IgG) GE Healthcare/[47]
ProteoPrep? Immunoaffinity Albumin & IgG Depletion Kit 由两种珠状介质组成的混合物，含有重组表达的小单链抗体配体 HSA, IgG 25-50 μL 未指定 二维电泳或液相色谱 > 95% (HSA); 85% (IgG) Sigma-Aldrich/[47]
染料和蛋白质配体亲和力 Pierce? Albumin/IgG Removal Kit Cibacron Blue染料和蛋白质A琼脂糖亲和树脂 HSA, IgG 10 μL ≈40 min 西班牙印迹、2D电泳或2D-LC质谱 ≈100% (HSA); ≈100% (IgG) Thermo Fisher Scientific/[47]
组合六肽配体亲和力库 ProteoMiner protein enrichment kit 珠子具有针对特定蛋白质的六肽配体 高丰度蛋白 40 μL >2小时 质谱 几乎所有蛋白质 Bio-Rad/[47]
化学沉淀 不适用 有机溶剂或其混合物 血清蛋白（未指定） 100 μL。（300-900 μL有机溶剂）-1 未指定 质谱 < 90%（基于未沉淀的10% HSA） 未适用/[48]
胶束ABS 不适用 Triton X-114 + SDS HSA 0.1 mL。（10 mL ABS）-1 15 min SDS-PAGE 95% (HSA) 未适用/[11]
聚合物ABS 不适用 聚乙二醇 + 戊二糖 总蛋白质 1 mg。（500 μg ABS）-1 15 min PCR 77.5%（基于总蛋白质） 未适用/[19]
商业IL基ABS 不适用 基于咪唑鎓、四烷基铵和四丁基膦的IL + K2HPO4/KH2PO4（pH = 7） HSA; IgG 0.1 g。（g ABS）-1 20 min SE-HPLC-UV 0 – 99% (HSA); 0 – 100% (IgG) 未适用/[21]
基于AGB-IL的ABS 不适用 AGB-IL + K3C6H5O7/C6H8O7（pH = 7） HSA; IgG 0.1 g。（g ABS）-1 20 min SE-HPLC-UV; SDS-PAGE 定量去除 未适用/
由于其技术简单性，化学沉淀高丰度蛋白的方法被广泛单独使用或与免疫亲和方法结合使用[48]；然而，共沉淀事件、低产率和漫长的协议较为常见[9]。基于AGB-IL的ABS能够在一步中实现更高的去除效率，同时用水、可生物降解的有机盐和无毒的IL替代挥发性有机溶剂或其混合物（例如甲醇、丙酮、氯仿、乙腈）[48]。
与常用的ABS（例如基于聚乙二醇和戊二糖或表面活性剂的ABS）相比，加入AGB-IL可以同时更大幅度地去除HSA和IgG[11,19]。与属于咪唑鎓、四烷基铵和膦家族的商业IL相比，AGB-IL在性能和毒性之间表现出更令人满意的平衡。在参考IL中，只有四丁基溴化物显示出类似的蛋白质去除能力，但毒性限制更高[21]。四丁基溴化物不仅比大多数AGB-IL更具毒性，而且在蛋白质去除效率上也较低[21]。此外，1-丁基-3-甲基咪唑鎓溴化物是最广泛研究的商业IL之一，由于其亲水性较高，无法通过界面沉淀去除血清蛋白[21]。

3.3. 基于ABS的目标蛋白生物标志物的检测
如上所述，基于AGB-IL的ABS在去除人类血清中的HSA和IgG方面表现出高性能，优于传统方法和其他测试的ABS配方。这反过来提高了SE-HPLC-UV检测血清中目标蛋白的能力，如图4所示。
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图4. 使用基于AGB-IL的ABS去除血清蛋白的性能表征：(A) 代表性的SE-HPLC-UV色谱图，显示了PBS [1:10 (v/v)]中的人类血清，ABS相由30 wt% [Bu3NC4]Br + 60 wt%柠檬酸盐缓冲液（K3C6H5O7/C6H8O7，浓度为50 wt%，pH 7）+ 10 wt%人类血清、转铁蛋白标准溶液（1 g·L?1）、HSA标准溶液（1 g·L?1）和IgG标准溶液（0.5 g·L?1）组成；(B) 在AGB-IL富集相上对蛋白质进行SDS-PAGE。
尽管SE-HPLC-UV可能无法检测到AGB-IL富集相中的微量残留HSA和IgG，但观察到的定量去除消除了这些高丰度血清蛋白的干扰。这使得可以检测到一个新的峰，该峰在样品预处理前是不可见的，从而能够检测到较低浓度下的目标蛋白（参见图4A）。为了验证这一假设，通过SDS-PAGE分析了AGB-IL富集相，以识别去除步骤后新暴露的蛋白质。根据分子量和血清蛋白质组学谱型，图4B中的SDS-PAGE结果表明该未知蛋白质是转铁蛋白，它也是一种有前景的生物标志物。此外，虽然AGB-IL富集相中检测到的转铁蛋白浓度低于估计的LOQ，但使用[Bu3NC4]Br基ABS从血清中回收了78%的转铁蛋白，相当于1.42 g·L?1，而原始样品中为1.8 g·L?1。这种基质效应的减少支持了SE-HPLC-UV的兼容性，表明AGB-IL富集相在稀释后仍适合分析。通常应考虑与下游分析技术的兼容性，因为富含IL的相可能需要稀释或额外的清洁步骤以确保最佳的分析性能，这取决于所选平台。
转铁蛋白是一种在贫血和酒精中毒评估中具有临床相关性的铁结合糖蛋白，在癌症早期诊断中也显示出潜力[50]。尽管它不是低丰度蛋白，且在典型的ng·L?1到pg·L?1范围内的生物标志物在未经预浓缩的情况下低于SE-HPLC-UV的LOD，但该方法仍可作为有效的样品清洁步骤。这使得能够选择性地分析原本无法检测的目标蛋白，突显了SE-HPLC-UV在分析复杂生物样本中的实际用途。
关于通过质谱检测血清转铁蛋白的报道使用了商业去除试剂盒（例如ProteoPrep?）[51]，而基于ELISA的定量也已被广泛使用[52]。在这个背景下，基于AGB-IL的ABS能够高效地去除血清中的蛋白质，同时简化血清预处理策略。它们能够揭示人转铁蛋白的存在，使其能够通过SE-HPLC-UV方法进行后续检测，从而减少了对质谱或免疫测定的依赖。SE-HPLC-UV提供了一个更简单且更具成本效益的分析平台，这对于需要快速和便捷地进行蛋白质定量分析的临床应用来说非常有利。3.4 对基于AGB-IL的ABS在SE-HPLC-UV中用于揭示目标蛋白的绿色评估除了分析性能和相对于已报道工作流程的结果外，还需要对其低毒性进行全面的绿色评估，以验证该方法的可持续性。为此，采用了三个互补的指标来定量考察样品通量、试剂使用量、能耗和废物产生等方面：AGREE指标（Analytical GREEnness），用于全面评估是否符合绿色分析化学的原则[31]；AGREEprep指标，源自AGREE，专门针对样品制备阶段[32]；以及Blue Applicability Grade Index (BAGI)，这是一个补充工具，侧重于白色分析化学的实际应用方面[33]。图5总结了这些评估的得分。下载：下载高分辨率图像（219KB）下载：下载全尺寸图像图5. 使用AGREE [31]、AGREEprep [32]和BAGI [33]指标工具对基于AGB-IL的ABS在SE-HPLC-UV中用于揭示目标蛋白的绿色评估。圆形图表表示AGREE和AGREEprep的得分，其中绿色阴影区域表示符合绿色分析化学[31]或绿色样品制备[24]的原则，得分范围从0（不符合）到1（完全符合）。对于BAGI，使用小行星形状的图标，蓝色的深浅程度表示得分强度（蓝色越深，适用性越高），同时显示相应的数值得分，反映符合白色分析化学原则的程度[33]。根据AGREE（得分0.64）、AGREEprep（得分0.68）和BAGI（得分45）的评估，所提出的基于AGB-IL的ABS工作流程在目标蛋白分析方面显示出绿色和操作方面的合理平衡。根据AGREE [31]，预期在样品量减少（标准2）、试剂和步骤的最小化（标准4）、避免衍生化（标准6）、废物产生的限制（标准7）以及操作员安全（标准10-12）方面会有高分。中等得分出现在样品预处理和批量操作（标准1）以及自动化和微型化程度有限（标准5）方面。较低的得分与离心、混合和HPLC分析过程中的能耗有关（标准9）。这些得分还表明由于单分析物工作流程和40分钟的SE-HPLC-UV运行时间，分析是离线的（标准3和8）。使用AGREEprep对样品制备步骤进行更详细的评估，突出了基于AGB-IL的ABS的环境性能，在试剂选择（标准2和3）、低废物产生（标准4）、小样品量（标准5）、能源效率（标准8）和操作员安全（标准10）方面有高分[32]。中等得分反映了通量有限（标准6）、手动操作（标准7）和预处理后的HPLC分析（标准9），主要扣分来自离体样品制备的标准1。BAGI得分进一步表明了分析的便捷性和生物学相关性，使得使用现成的仪器即可实现转铁蛋白的单分析物定量[33]。与AGREE和AGREEprep的评估结果一致，这些限制包括通量低和自动化程度有限，导致整体适用性中等。总体而言，AGB-IL的低毒性（第3.1节）支持绿色样品制备原则（使用更安全的溶剂和试剂）[24]，并与绿色分析化学的目标[31]相一致，增强了操作员的安全性和使用环境友好的试剂。BAGI评估也显示了这一点，其中试剂安全性和环境影响有助于评估该方法的生物分析可持续性。改进的机会包括自动化、工作流程整合和试剂/材料的再利用，这可以进一步提高操作效率和分析适用性。4. 结论本研究表明，基于AGB-IL的ABS可以通过选择性去除高丰度蛋白质来成功应用于高效的血清蛋白去除策略。这一过程创造了使用快速分析技术进行生物标志物检测所需的分析条件。AGB-ILs经过合成和表征后，与柠檬酸盐缓冲液结合形成了符合绿色样品制备原则的ABS。AGB-ILs对水的亲和力较低，这使得它们能够高效地从人血清中去除HSA和IgG，从而检测到原本被掩盖的目标蛋白。由于HSA和IgG的丰度较高，直接通过SE-HPLC-UV分析未经处理的血清中的转铁蛋白是不可行的，因为它们会主导色谱信号并掩盖其峰。通过将目标蛋白提取到富含AGB-IL的相中，可以快速实现SE-HPLC-UV检测。这些结果表明，适当的样品预处理使得可以使用更简单的分析技术进行血清蛋白检测，为免疫测定或质谱等现有方法提供了一种补充策略。结合AGREE、AGREEprep和BAGI的评估进一步表明，ABS介导的样品预处理符合绿色和安全的实践，同时显示出中等程度的实际适用性，并指出了通过自动化、工作流程整合和材料再利用进行改进的机会。总体而言，研究结果强调了基于AGB-IL的ABS作为可持续生物分析工具的潜力，它结合了绿色分析化学和白色分析化学的原则，改善了样品预处理和生物标志物检测。数据可用性数据将按需提供。作者贡献声明M.M.P.：方法学、验证、正式分析、调查、数据管理、可视化、初稿撰写；S.N.P.：正式分析、调查、数据管理；F.A.eS.：方法学、可视化、撰写-审阅与编辑、资金获取；A.M.：方法学、资源管理、监督；J.A.P.C.：概念化、撰写-审阅与编辑、监督；M.G.F.：概念化、撰写-审阅与编辑、监督、资金获取、项目管理。CRediT作者贡献声明Matheus M. Pereira：撰写-初稿、可视化、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理。Sónia N. Pedro：调查、正式分析、数据管理。Francisca A. e Silva：撰写-审阅与编辑、可视化、方法学、资金获取。Aminou Mohamadou：监督、资源管理、方法学。Jo?o A.P. Coutinho：撰写-审阅与编辑、监督、概念化。Mara G. Freire：撰写-审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。