壳聚糖包覆的钴铁氧体纳米复合物兼具双重抗菌性能和血液相容性

《RSC Pharmaceutics》：Chitosan-coated cobalt ferrite nanocomplexes with dual antimicrobial activity and hemocompatibility

　　抗生素耐药性细菌感染的日益普遍是一个严重的全球健康挑战，这迫切需要开发既有效又具有生物相容性的替代抗菌策略。纳米材料在这方面提供了一个多功能平台，因为它们的物理化学性质可以被调整以增强抗菌性能。其中，钴铁氧体纳米颗粒（CFs）表现出吸引人的磁性能、化学稳定性和多功能性，适用于生物医学应用；然而，它们的临床转化受到聚集、有限的胶体稳定性和潜在的生物相容性问题的阻碍。基于我们之前关于壳聚糖（CH）涂层CFs（CCFs）的生物相容性和成像潜力的研究，本研究调查了它们对多种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌RBW和金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（致病性大肠杆菌EPEC、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K-12、伤寒沙门氏菌AF-4500、弗莱克斯纳志贺氏菌3C和霍乱弧菌）的抗菌效果。抗菌活性通过抑菌圈（ZOI）、最低抑菌浓度（MIC）和CellTox? Green测定法进行了评估。与单独使用CH或未涂层的CFs相比，CCFs显示出显著增强的抗菌活性，突显了壳聚糖涂层的协同作用。值得注意的是，金黄色葡萄球菌表现出最高的敏感性，在500 μg的CCFs作用下，最大抑菌圈约为26.45毫米。处理后MDA-硫代巴比妥酸加合物水平的升高表明膜氧化损伤是细菌杀灭的关键机制。重要的是，使用大鼠和人红细胞进行的血液相容性评估显示了浓度依赖性的细胞毒性，表明CCFs在一定的浓度范围内保持可接受的血液相容性。总体而言，这项研究确立了CCFs作为一个有前景的双功能平台，结合了强大的广谱抗菌活性和可调的血液相容性，强调了它们在未来生物医学应用中的潜力，前提是必须仔细定义最佳治疗窗口。

1. 引言

传染病的全球性增加，加上抗生素耐药性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的出现，构成了一个重大的公共卫生挑战。过去十年中新抗生素批准的减少进一步加剧了这一威胁，使得金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、致病性大肠杆菌EPEC、伤寒沙门氏菌AF-4500、弗莱克斯纳志贺氏菌3C和霍乱弧菌等常见病原体越来越难以治疗。这些细菌对抗生素的日益增长的耐药性凸显了迫切需要安全有效的替代疗法。金属纳米颗粒因其能够破坏细菌膜并限制耐药性的发展途径而成为有前景的抗菌剂。在磁性纳米颗粒中，钴铁氧体纳米颗粒（CFs）是一类尖晶石型铁氧体，具有独特的磁性和物理化学性质，可用于磁共振成像（MRI）对比增强、热疗、靶向药物递送和抗菌治疗。然而，它们的生物医学应用常常受到颗粒聚集、水溶性差和潜在细胞毒性的限制。为了解决这些问题，表面修饰被广泛探索为提高其生物性能的有效策略。壳聚糖（CH）是一种天然的、生物相容性的聚合物，特别适用于基因递送、伤口愈合、组织工程和抗菌制剂。除了作为稳定涂层外，CH还可以改善纳米颗粒的分散性、靶向特异性和生物相互作用，同时减少网状内皮系统的清除。先前的研究还表明，CH可以增强基于CF的纳米材料的抗菌活性。此外，CFs、CH和CH涂层CFs（CCFs）均被报道具有抗菌潜力。然而，它们与市售FDA批准抗生素（如氨苄西林、四环素、环丙沙星）或消毒剂（如聚维酮碘）的抗菌性能的比较评估仍然有限。CCFs对细菌膜脂质过氧化的影响及其对人类红细胞的血液相容性也尚未得到充分研究。这样的研究对于理解CCFs的抗菌潜力及其未来的转化相关性非常重要。在本研究中，我们报道了通过共沉淀法合成CH涂层CFs，并系统地评估了它们对革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（致病性大肠杆菌EPEC、大肠杆菌DH5α、伤寒沙门氏菌AF-4500、弗莱克斯纳志贺氏菌3C、霍乱弧菌和大肠杆菌K-12）的抗菌活性。通过测量抑菌圈（ZOI）来比较它们的抗菌效果，ZOI是抗菌剂周围细菌生长被抑制的清晰圆形区域。此外，我们还通过脂质过氧化分析检查了细菌膜损伤，并评估了CFs和CCFs对人类红细胞的血液相容性。总的来说，这项研究探讨了CCFs的抗菌潜力，同时以浓度依赖的方式评估了它们的血液相容性，从而提供了对其生物医学适用性的更平衡的评价。

2. 材料与方法

2.1 化学品和材料

肽胨、酵母提取物、氯化钠和EDTA从中国UNI-CHEM购买。Mueller Hinton琼脂从德国Merk获得。粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌（EPEC）、伤寒沙门氏菌AF-4500、弗莱克斯纳志贺氏菌3C、霍乱弧菌和大肠杆菌K-12从孟加拉国达卡Savar的Jahangirnagar大学生物化学与分子生物学系获得。大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌RBW从孟加拉国达卡Savar的Jahangirnagar大学生物技术与遗传工程系获得。

2.2 方法

2.2.1 合成与表征

CFs和CCF纳米复合物的合成和表征方法如Shakil等人先前所述。简要来说，FeCl3·6H2O（Merck，印度，杂质≤0.01%）和CoCl2·6H2O（Merck，印度，杂质≤0.01%）按所需摩尔比混合，并在不断搅拌下加入6 M NaOH以维持pH值在11–13之间，从而产生沉淀。沉淀物通过离心（15,000 rpm，20分钟）分离，洗涤十次，并在90°C下退火72小时以获得CFs。反应方程为：CoCl2·6H2O + 2NaOH → Co(OH)2 + 2NaCl + 6H2O；2FeCl3·6H2O + 6NaOH → 2Fe(OH)3 + 6NaCl + 12H2O；Co(OH)2 + 2Fe(OH)3 → CoFe2O4 + 4H2O；最终反应为：CoCl2·6H2O + 8NaOH + 2FeCl3·6H2O → CoFe2O4 + 8NaCl + 22H2O。然后使用2%的CH溶液对CFs进行涂层处理以制备CCFs。2% CH（w/v）是通过将CH（Sigma-Aldrich，低分子量，质量等级100，75–85%去乙酰化）加入水（94 mL）和醋酸溶液（6 mL，Sigma-Aldrich，2 N）的混合物中制备的。搅拌48小时后，将CH溶液在13,000 rpm下离心20分钟。然后用1 mL的上清液通过反复涡旋和超声处理来涂层20 mg的CFs。

2.2.2 抗菌活性测定

CH、CFs和CCFs的抗菌活性根据Niloy等人的方法进行了测定，并进行了轻微修改。简要来说，选定的革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌RBW、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（致病性大肠杆菌EPEC、伤寒沙门氏菌AF-4500、弗莱克斯纳志贺氏菌3C、霍乱弧菌和大肠杆菌K-12）在37°C下在Luria–Bertani（LB）培养基中过夜培养，并在120 rpm下摇动。随后，将100 μL的每种细菌悬浮液均匀涂布在Mueller–Hinton琼脂（MHA）平板上。将含有300、400和500 μg测试样品的无菌滤纸圆片放置在接种的平板上，然后在37°C下培养15小时，氨苄西林、四环素、环丙沙星和聚维酮碘作为阳性对照。通过测量抑菌圈（ZOI）的直径（mm）来评估抗菌活性。最低抑菌浓度（MIC）值使用培养基稀释法确定。过夜培养的细菌（10 μL）在990 μL新鲜LB培养基中稀释，并在37°C下摇动培养4小时。然后用一系列CH、CF和CCF浓度处理细菌，并过夜培养。通过测量OD600来确定MIC值。

2.2.3 试蓝染料排除试验

试蓝染料排除试验用于确定细菌悬浮液中的活细胞数量。试蓝是一种带负电荷的染料，可选择性地染色死细胞，而具有完整膜的活细胞会排除该染料。该试验根据Sarker等人的方法进行，并进行了轻微修改。简要来说，将20 μL的样品（1 μg μL?1）与80 μL过夜培养的细菌混合，并在37°C下摇动培养1.5小时。处理后，将细菌培养物与0.4%的试蓝溶液混合，并在室温下培养15分钟。然后使用相位对比显微镜（Olympus BX50荧光显微镜，Olympus，日本）在40倍放大倍数下拍摄图像。

2.2.4 CellTox? Green测定

CellTox? Green荧光染料可以穿透膜受损的细胞，并在结合DNA时发出绿色荧光。将样品（20 μL；1 μg μL?1）分别与80 μL相应的细菌培养物混合。随后，向CH-、CF-和CCF处理的细菌悬浮液中加入900 μL新鲜培养基，并在37°C下摇动培养2小时。培养后，向每个样品中加入1 μL的CellTox? Green试剂（2×），充分混合，并在室温下黑暗中培养30分钟。使用荧光分光光度计（Shimadzu RF-6000，日本）在490 nm处测量剩余样品的荧光强度。

2.2.5 脂质过氧化（LPO）测定

LPO测定按照Sarker等人的方法进行。简要来说，将1 mL的细菌培养物与200 μL（200 μg）的CFs、CH或CCFs混合，并在室温下培养2小时。培养后，离心并加入2 mL的10%三氯乙酸。通过11,000 rpm离心35分钟去除不溶的细胞成分。收集上清液，并以相同速度再次离心20分钟以去除残留的蛋白质沉淀物和死细胞。所得上清液与4 mL新鲜制备的0.67%硫代巴比妥酸（TBA）溶液混合，并在热水浴中培养10分钟以形成MDA–TBA加合物。冷却至室温后，使用UV-vis分光光度计（Specord? 205，Analytik Jena，德国）在532 nm处测量MDA–TBA复合物的吸光度。

2.2.6 溶血活性测定

CH、CFs和CCFs的溶血活性根据Hossain等人的方法进行测定，并进行了轻微修改。从健康男性志愿者（25岁）和7周大的白化Wistar大鼠中收集全血，并将其加入含有10% EDTA的试管中，以5000 rpm离心10分钟以去除血清。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）多次洗涤红细胞（HRBCs和RRBCs），并以3000 rpm离心3分钟，并重新悬浮在10 mL PBS中。随后，将300 μL的红细胞（RBC）悬浮液与含有CH-、CF-或CCF的溶液混合。最终溶液的浓度分别为50、100、150、200、250、300和450 μg/mL。混合物在37°C下摇动培养30分钟，然后以4000 rpm离心5分钟。测量上清液的吸光度。包括阳性（RBCs与蒸馏水）和阴性（RBCs与PBS）对照，并使用以下公式计算溶血百分比：

2.2.7 统计分析

实验数据使用Prism-GraphPad 8（美国）进行分析。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。此外，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni事后检验来确定P < 0.05的统计显著差异。

3. 结果与讨论

3.1 表征

本研究使用了先前合成的CFs（直径约10 nm）。通过共沉淀法制备CFs，并随后用CH进行表面修饰以提高其生物相容性。所得CCFs通过扫描透射电子显微镜（STEM）、拉曼光谱（Raman spectroscopy）、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TGA）、动态光散射（DLS）和ζ电位测量进行了表征。碳纳米复合物（CCFs）表现出比纯钴铁氧化物（CH）或纯碳纤维（CFs）更高的正表面电荷（表S1.26）。在本研究中，我们评估了CH、CFs和CCFs对两种革兰氏阳性菌和七种革兰氏阴性菌株的抗菌活性。

3.2 抗菌活性

我们通过圆盘扩散试验来评估CH、CFs和CCFs的抗菌活性。纯CFs的抗菌活性较低（表1），而CH涂层显著增强了它们的效果。CCFs对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的活性最高（表1），甚至超过了包括氨苄西林、四环素、环丙沙星和聚维酮碘在内的市售FDA批准抗菌剂。相比之下，CCFs对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis RBW）的疗效较低。聚维酮碘对所有测试菌株的抗菌活性几乎均匀。有趣的是，CCFs也对耐氨苄西林的革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli EPEC）显示出活性。与抑制圈结果一致，MIC测量表明CCFs（0.000391–0.000781 μg）比CH或CFs更有效，而CFs和CH对大肠杆菌DH5α、粪肠球菌（E. faecalis）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌K12的MIC值相似（表S1）。此前，Kajani等人报告称CCFs对大肠杆菌的抗菌活性高于CFs或氨苄西林。CCFs增强的抗菌活性可能归因于ROS（活性氧）的产生增加，而CH涂层促进了CCFs与细菌细胞壁或膜的结合，从而促进了细胞裂解。

表1

CH、CFs和CCFs对细菌菌株的抑制圈（以毫米为单位）

药物/候选药物
细菌菌株
枯草芽孢杆菌RBW
大肠杆菌DH5α
致病性大肠杆菌（EPEC）
伤寒沙门氏菌AF-4500
弗莱克斯纳志贺菌3C
霍乱弧菌
大肠杆菌K-12
粪肠球菌
金黄色葡萄球菌

CH（300 μg）
—
7.45 ± 0.05
—
7 ± 0
7.05 ± 0
7.1 ± 0.1
7.45 ± 0.05
18.7 ± 0.2
20.5 ± 0.2

CH（400 μg）
6.9 ± 0.1
7.85 ± 0.05
—
7.45 ± 0.05
7.45 ± 0.05
8.05 ± 0.05
7.55 ± 0.05
20.55 ± 0.25
22.4 ± 0.1

CH（500 μg）
7.05 ± 0.05
8.15 ± 0.05
7.45 ± 0.05
8.05 ± 0.05
8.1 ± 0.05
9.9 ± 0.1
10.05 ± 0.05
21.7 ± 0.4
24.25 ± 0.15

CFs（300 μg）
6.9 ± 0.1
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—

CFs（400 μg）
7 ± 0
—
—
—
—
—
—
—
—

CFs（500 μg）
7.1 ± 0.1
—
—
—
—
—
7.45 ± 0.05
—
—
—
8.05 ± 0.15
—

CCFs（300 μg）
7.45 ± 0.05
15.4 ± 0.1
8.55 ± 0.05
9.05 ± 0.05
6.9 ± 0.1
9.05 ± 0.05
8.05 ± 0.05
18.15 ± 0.05
21.1 ± 0.3

CCFs（400 μg）
9.05 ± 0.05
17.1 ± 0.1
10.05 ± 0.05
10.1 ± 0.1
9.45 ± 0.05
9.95 ± 0.05
8.95 ± 0.05
19.55 ± 0.15
23.45 ± 0.65

CCFs（500 μg）
9.1 ± 0.1
20.05 ± 0.05
12.015 ± 0.015
11.1 ± 0.1
11.05 ± 0.05
11.4 ± 0.1
11.1 ± 0.1
23.55 ± 0.05
26.45 ± 0.05

氨苄西林（10 μg）
10.95 ± 0.05
12.9 ± 0.1
—
23.95 ± 0.05
23.1 ± 0.1
14.2 ± 0.1
15.9 ± 0.1
7.95 ± 0.15
8.35 ± 0.15

四环素（10 μg）
17.15 ± 0.15
17.1 ± 0.1
20.05 ± 0.05
15.1 ± 0.1
19.95 ± 0.05
8.1 ± 0.1
17.1 ± 0.1
12.3 ± 0.1
11.45 ± 0.05

环丙沙星（5 μg）
24.9 ± 0.1
34.2 ± 0.1
36.9 ± 0.1
38.9 ± 0.1
32.05 ± 0.05
22.05 ± 0.05
29.4 ± 0.05
19.35 ± 0.15

聚维酮碘（2000 μg）
10.1 ± 0.1
10.95 ± 0.05
9.55 ± 0.05
10.45 ± 0.05
10.5 ± 0
10.05 ± 0.05
12.05 ± 0.05
19.55 ± 0.15
17.4 ± 0.2

CFs：钴铁氧化物纳米颗粒，CH：壳聚糖，CCFs：壳聚糖包覆的钴铁氧化物纳米颗粒。

3.3 细菌细胞膜的损伤

CellTox? Green是一种能够穿透细胞壁受损的细菌的DNA结合染料，而完整的细菌膜会排斥这种染料。在革兰氏阳性菌中，用CCFs处理的金黄色葡萄球菌显示出最高的荧光强度，其次是粪肠球菌（图1），其荧光强度大约是未处理对照组的七倍。所有革兰氏阴性菌株的荧光强度也比其未处理对照组增加了近六倍。与抑制圈数据一致（图2），用CCFs处理的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的荧光强度也显著增加。使用荧光显微镜进一步确认了用CH、CFs和CCFs处理的死亡细菌的绿色荧光（图2），其中CCFs处理后的细胞死亡程度最高。先前的研究表明，生物金属纳米颗粒的处理会损害细菌膜，导致CellTox? Green的吸收和荧光增强。

图1

CCFs合成的示意图。将FeCl3·6H2O和CoCl2·6H2O溶解在烧杯中并不断搅拌。然后加入NaOH开始CF的合成（i）。沉淀后，通过洗涤和干燥纯化CFs（ii）。接着向CFs中加入2%的CH溶液（iii），并通过反复超声处理和涡旋作用进行包覆（iv）。CFs：钴铁氧化物纳米颗粒；CH：壳聚糖；CCFs：壳聚糖包覆的钴铁氧化物纳米颗粒。该图使用BioRender（https://www.biorender.com）生成。

CellTox? Green摄取实验确认CH或CCFs损伤了细菌膜。细菌分别用CFs、CH和CCFs处理，并在490 nm处测量荧光强度（a）。所示值为平均值±SEM（n = 3）。数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行分析。*与未处理对照组显著不同，*p < 0.05；#与CFs显著不同，#p < 0.05，▲与CH显著不同，▲ p < 0.05。CH、CFs和CCFs的明场和白场图像（b）。CFs：钴铁氧化物纳米颗粒，CH：壳聚糖，CCFs：壳聚糖包覆的钴铁氧化物纳米颗粒。TRypan blue染料排斥实验确认了细菌细胞壁的损伤。纳米颗粒与细菌细胞壁之间的疏水相互作用导致了结构破坏，使TRypan blue能够渗透到受损或死亡的细菌的细胞质中。

3.4 细菌膜的脂质过氧化

我们进行了LPO（脂质过氧化）实验来评估细菌细胞膜脂肪酸的氧化损伤。MDA–TBA加合物的形成表明治疗剂引起了细胞壁的损伤。在测试的菌株中，用CCFs处理的金黄色葡萄球菌显示出最高的MDA–TBA加合物形成（图3a）。值得注意的是，粪肠球菌也显示出显著的MDA–TBA水平，表明用CCFs处理的革兰氏阳性菌存在显著的氧化损伤（图3a）。先前的研究表明，银纳米颗粒中掺杂钴或铁会增加革兰氏阳性菌（粪肠球菌和枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（阴沟肠杆菌和假单胞菌）的MDA加合物形成。

图3

细菌膜的脂质过氧化及抗菌活性的提出机制。细菌分别用CFs、CH和CCFs处理，使用UV-vis分光光度计在532 nm处测量MDA-TBA加合物（a）。所示值为平均值±SEM（n = 3）。数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行分析。*与未处理对照组显著不同，*p < 0.05；#与CFs显著不同，#p < 0.05，▲与CH显著不同，▲ p < 0.05。提出CCFs的抗菌活性机制（b）。带正电的CCFs与带负电的细菌膜相互作用，导致膜不稳定和通透性增加。这种相互作用还促进了CFs从CCFs中的释放。CFs内化后，可以通过Fenton反应产生ROS（活性氧），并诱导膜脂质过氧化（LPO）。CFs：钴铁氧化物纳米颗粒，CH：壳聚糖，CCFs：壳聚糖包覆的钴铁氧化物纳米颗粒，MDA-TBA：丙二醛-硫代巴比妥酸。图（b）中的机制示意图使用BioRender（https://www.biorender.com）生成。不同物种的细菌细胞壁组成不同，导致与测试样品的相互作用也不同。因此，不同菌株在处理后产生的MDA–TBA加合物量也不同。LPO是由于CH、CFs或CCFs引起的细菌细胞膜脂肪酸的氧化。CH、CFs或CCFs的正表面电荷可能有助于它们与带负电的细菌膜的相互作用。CFs内化后，可以通过Fenton反应产生ROS并氧化膜中的多不饱和脂肪酸。膜脂质过氧化（LPO）会破坏细胞膜的完整性（图3b）。此外，ROS介导的氧化应激会破坏电子传输链并改变细菌的代谢过程。这些破坏可以触发凋亡基因和氧化应激相关蛋白的表达，最终导致细菌细胞凋亡。

3.5 体外溶血活性

纳米复合物的体内应用需要良好的血液相容性，包括最小的溶血活性。由于直接人体暴露存在伦理问题，且在没有动物实验的情况下，我们使用人红细胞（HRBCs）和鼠红细胞（RRBCs）评估了CH、CFs和CCFs的血液相容性，以预测它们在体内的潜在效果（图4）。Lee等人报告称，乙酰化的CH纳米颗粒表现出可忽略的溶血活性，这可能因其化学修饰而有所不同。在我们的研究中，与原始CFs相比，CCFs在HRBCs和RRBCs中诱导了更高的溶血活性，这可能是由于颗粒分布和与红细胞的相互作用不同。虽然CFs倾向于在试管底部聚集和沉淀，但CCFs保持均匀分散，且颗粒大小和表面积发生变化。随着测试样本浓度的增加，RRBC膜的完整性受到的影响与HRBC不同。这些观察结果与Thomassen等人提出的模型一致，该模型表明红细胞膜在与聚集的纳米颗粒相互作用时局部发生弯曲，表现出较低的粘附能量，从而导致与相同大小的单一分散颗粒相比溶血活性降低。此外，颗粒大小和表面积对溶血也有显著影响。有趣的是，从HC50值来看，CCFs对RRBCs的细胞毒性高于HRBCs，而这一浓度（500 μg）正是对金黄色葡萄球菌表现出最高抗菌活性的浓度（图4）。体内研究还表明，CCFs在较低浓度下也能被RRBCs良好耐受。鉴于在较高浓度下观察到的体外毒性，在考虑直接人体应用之前，确定CCFs的安全治疗窗口是必要的。

4. 结论

CCFs对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都表现出强大的抗菌活性，优于单独的CH和CFs，表现为更大的抑制圈、更低的MIC值以及在CellTox? Green实验中更高的细胞毒性。在其他细菌菌株中，金黄色葡萄球菌是最敏感的菌株，而LPO研究表明氧化膜损伤参与了杀菌机制。总体而言，CH的功能化是提高CFs抗菌性能的有效策略。然而，CCFs的溶血活性依赖于浓度，这强调了需要仔细优化剂量。因此，进一步的工作应集中在确定安全的治疗窗口、在生理相关系统中验证这些纳米复合物的行为以及验证其体内的有效性。

作者贡献

概念构思：M. S. S.、M. A. H. 和 S. R. S；纳米颗粒合成：M. S. S. 和 S. M. H.；抗菌和溶血活性：M. S. S.、S. A. P.、M. M. H. 和 M. S. N.；显微分析：M. M. H.；数据分析和图表：M. S. S.、S. A. P. 和 M. M. H.；手稿撰写：M. S. S. 和 S. A. P.；手稿修订和批准：M. S. S.、M. A. H. 和 S. R. S. 伦理声明

所有动物实验均按照Jahangirnagar大学实验室动物护理和使用指南进行，并得到了Jahangirnagar大学生物科学学院生物安全、生物安保与伦理委员会的动物伦理委员会的批准（参考编号：BBEC, JU/M 2018 (11) 1）。所有实验均按照Jahangirnagar大学的指导方针进行，并获得了该校生物科学学院生物安全、生物防护与伦理委员会的批准（参考编号：BBEC, JU/M 2019 (4) 1）。本研究的人类参与者均签署了知情同意书。利益冲突方面：

本研究中不存在需要声明的利益冲突。数据可用性：

数据包含在文章正文中或补充信息（SI）中。补充信息包括：表S1：CFs、CH和CCFs的表征参数；表S2：CCFs、CH和CFs对细菌的最低抑菌浓度（MIC）；图S1：Trypan蓝染色实验显示CH、CF和CCFs对细菌细胞壁的损伤作用。更多详情请参见DOI：https://doi.org/10.1039/d6pm00045b。致谢：

Jahangirnagar大学2019年研究基金以及孟加拉国政府大学拨款委员会（UGC）-Jahangirnagar大学联合研究基金为本研究项目提供了部分资金支持。作者感谢Jahangirnagar大学的Wazed Mia科学研究中心允许使用其显微镜设施。参考文献：