通过漆酶介导的功能化实现碱性木质素的简单绿色转化，以制备高性能的木质素基薄膜

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Facile green transformation of alkali lignin via laccase-mediated functionalization for high-performance lignin-based films

　　杨杰宇|王英杰|秦宇|范米子|杜观本|夏燕|周小建|周永辉|廖静静
中国云南省木竹生物质材料重点实验室，西南林业大学，昆明，650224

**摘要**
利用碱性木质素（AL）这一可再生制浆副产品，对于推动循环型生物经济的发展至关重要。然而，其固有的低反应性限制了其作为石油多元醇替代品的潜力。本研究开发了一种绿色生物催化策略，使用来自Trametes versicolor的漆酶在温和、对环境友好的条件下有效激活AL。结果表明，这种酶法改性方法显著提高了木质素的羟基含量和化学可及性，使其从低价值填充剂转变为功能性共聚物。分析结果还证实，活性-OH基团的增加显著提高了木质素-聚氨酯网络的均匀性和交联密度，减少了空间位阻。当木质素含量达到30%时，漆酶改性的木质素基薄膜（LMLPFs）在拉伸强度和弹性模量方面表现出更高的性能，分别达到31.49 MPa（提高了25%）和215.23 MPa（提高了60%），而未改性的木质素基薄膜（LPFs）分别为25.21 MPa和134.40 MPa。此外，LMLPFs的热稳定性也得到了改善，5%质量损失时的分解温度（T5%）从277 ℃升高到280 ℃。通过高效能源过程将化石来源的成分替换为酶法改性的生物聚合物，本研究为设计先进的木质素基生物复合材料提供了一条可行且可持续的途径。

**1. 引言**
木质素是最丰富的可再生材料之一，是造纸和生物精炼工业的副产品，年产量约为5000万至7000万吨[1] [2]。由于其苯环结构和多样的官能团，木质素已成为一种具有广泛应用前景的芳香族前体[3] [4] [5]。最近，木质素已被成功改造成具有紫外线屏蔽、抗菌和放射性碘捕获功能的多功能可降解纳米复合纤维[6]，并且进一步显示出作为高性能超级电容器材料的巨大潜力[7] [8]。这些木质素衍生的可持续材料不仅减轻了对环境的影响，还展示了广泛的应用前景。特别是，木质素在复合膜的开发中得到了广泛应用，例如将其掺入聚氨酯中[9] [10]。然而，由于木质素复杂的、异质性的和高分支结构，其许多羟基（尤其是酚类羟基）因空间位阻而难以被利用，导致其在聚氨酯反应介质中的溶解性和分散性较差，从而阻碍了均匀聚合物网络的形成[11]。因此，未经改性的木质素直接用作多元醇前体通常存在高脆性和机械性能差等根本性技术障碍[12]。

对木质素进行战略性改性对于提高其作为多元醇替代品的适用性至关重要。传统的化学改性工艺可以解决这些限制，但往往需要高温高压，并产生环境污染物，因此条件苛刻、使用挥发性有机溶剂且成本高昂[13] [14] [15] [16]。相比之下，酶法提供了一种更环保的替代方案。这种生物催化方法符合绿色化学的原则，具有反应条件温和、环境影响小以及唯一副产品为水等显著优势[17]。尽管酶法改性具有吸引力，但大多数先前的研究使用了纯化的或商业化的漆酶，虽然确保了明确的活性，但不可避免地增加了加工成本和复杂性[18] [19]。在自然界中，白腐真菌以其强大的木质素改性能力而闻名，这归因于它们分泌的细胞外酶，如木质素过氧化物酶（LiPs）、锰过氧化物酶（MnPs）和漆酶[20] [21]。虽然HBT和其他介质已被用于提高漆酶对木质素的活性，但直接使用未纯化的真菌培养液与漆酶-介质系统结合作为低成本替代方案的研究却很少。虽然已有关于漆酶改性木质素和木质素基聚氨酯的独立报道，但尚未有研究将酶法激活、结构表征以及对所得聚氨酯薄膜性能的系统评估整合在一个框架内。为了解决这些限制，本研究开发的原始漆酶（直接从白腐真菌中分泌，未经纯化）/HBT介导的改性方法能够在温和的水性条件下同时提高脂肪族和酚类羟基的含量，从而制备出综合性能更优的PU薄膜。这种方法提供了一种低成本、高效且环保的途径，用于制备高性能的木质素基PU薄膜。

**2. 材料与方法**
**2.1. 材料**
本研究中使用的白腐真菌为Trametes versicolor (L.) Lloyd (T. versicolor)，来自中国林业文化收藏中心（CFCC）。碱性木质素（AL）（97%）由山东龙利有限公司提供。1,6-二异氰酸己烷（HDI，99%）和聚乙二醇（PEG 300）为分析级，由上海麦克林生化有限公司提供。N,N-二甲基甲酰胺（DMF，99.5%）和1,4-二氧环己烷（99.5%）由广东光华科技有限公司提供。

**2.2. 木质素的改性及木质素基薄膜的制备**
**2.2.1. 木质素的改性**
T. versicolor在添加了微量元素溶液（KHPO4, MgSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, FeSO4·7H2O）的马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，于28 ℃下振荡培养（180 rpm）5天。第5天收集培养液并离心以去除菌丝和细胞碎片。所得的无细胞上清液用作原始漆酶制备液。测定原始上清液的漆酶活性，然后用醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L, pH 4.5）稀释至200 U/L的标准活性。

对于酶法改性反应，将1 g的AL和0.5 μmol的介质1-羟基苯并三唑（HBT）加入100 mL的漆酶溶液（200 U/L, pH 4.5）中。混合物在40 °C下在轨道振荡器中孵育1小时（180 rpm）。反应在冰浴中终止，收集所得的LML，用蒸馏水洗涤，并在50 °C下干燥至恒重。

**2.2.2. 漆酶驱动的木质素分解酶系统的评估**
所有光谱测定均在光程为1 cm的比色皿中进行。通过监测2,2’-偶氮双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸盐）（ABTS）的氧化来测定漆酶活性。LiP和MnP酶活性分别通过H2O2依赖性的香芹醇（310 nm）和Mn（II）（240 nm）氧化来测定，方法依据先前建立的标准[22]。1单位（U）定义为每分钟产生1 μmol产物的酶量。酶活性测定重复三次。使用变异系数评估测定的再现性和精度。

**2.2.3. 木质素基薄膜的制备**
通过将木质素与HDI反应制备木质素基薄膜。多元醇组分包括木质素（AL或LML）和聚乙二醇（PEG），其中木质素的加入量为总多元醇组分的10%、20%和30%（按重量计）[23]。多元醇组分溶解在DMF（10 mL）和1,4-二氧环己烷（5 mL）中。然后逐滴加入HDI，使NCO/OH摩尔比为1.1，在室温下连续搅拌60分钟形成预聚物。所得预聚物倒入模具中，在室温下预固化2小时，然后在80 °C下固化8小时。

**2.3. 改性木质素的结构表征**
**2.3.1. FTIR光谱**
FTIR光谱在Model 650光谱仪上记录。粉末样品（AL和LML）用KBr颗粒（1:100, w/w）制备，并在4000至500 cm-1的波数范围内以4 cm-1的分辨率扫描32次。木质素基薄膜使用衰减全反射（ATR）附件在相同的波数范围内进行分析，分辨率为2 cm-1。

**2.3.2. NMR分析**
NMR光谱用于表征木质素结构。对于2D-HSQC NMR，将10 mg干燥的木质素样品溶解在0.5 ml DMSO-d6（99.5%）中，所得光谱使用TopSpin软件进行分析。对于定量31P NMR分析，将干燥的木质素（20 mg）溶解在0.5 mL CDCl?和无水吡啶（1.6:1, v/v）中。随后加入100 μL环己醇内标（IS）和0.1 mL松弛剂溶液（5 mg/mL）。通过加入100 μL TMDP（2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊烷）进行磷酸化。混合物充分涡旋以确保反应完全后进行分析。

**2.3.3. 凝胶渗透色谱分析**
木质素样品在室温下用乙酸酐/吡啶混合物（1:1, v/v）乙酰化48小时。乙酰化样品溶解在HPLC级四氢呋喃（THF）中，浓度为2 mg/mL，然后通过0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）注射过滤器过滤。使用配备折射率（RI）检测器的GPC系统测定分子量分布，流动速率为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。

**2.3.4. X射线光电子光谱**
使用X射线光电子光谱仪（Thermo Scientific K-Alpha）分析木质素样品的表面元素组成和化学状态。进行调查扫描以确定整体元素组成。样品制备时，将木质素粉末均匀压在干净的铟箔上，然后在室温下的真空烘箱中干燥24小时。

**2.4. 木质素基薄膜的评估**
**2.4.1. 形态均匀性和界面相容性**
样品在液氮中冷冻5分钟，随后进行冷冻断裂。断裂的样品使用导电碳带垂直安装在SEM样品台上，并在真空中喷镀金90秒。使用场发射扫描电子显微镜（ZEISS Sigma 300）观察样品的横截面形态，并在二次电子（SE）检测模式下获取图像。使用ImageJ软件从SEM显微图中量化孔径。孔径边界通过ImageJ中的“Analyse Particles”功能手动识别和测量。

**2.4.2. 网络密度和膨胀行为**
通过平衡膨胀实验确定薄膜的交联密度（?c/V0）。干燥的薄膜样品（约0.2至0.25 g）称重并浸入20 ml DMF中（25 ℃）[24]。随后，将膨胀的薄膜样品从溶剂中取出，用吸水纸巾去除样品表面的多余DMF，然后称重。重复五次以检查数据的再现性。交联密度使用公式（1）计算[24]。

**2.4.3. 机械性能**
使用自动拉伸试验机评估聚氨酯薄膜的拉伸性能。根据中国国家标准GB 1302-91制备尺寸为70 mm × 10 mm × 1.3 mm（长度 × 宽度 × 厚度）的矩形样品。拉伸试验在室温下进行，十字头速度为25 mm/min。对于每种薄膜配方，样品都进行了五次测试，结果以平均值±标准差的形式报告。2.4.4 热稳定性 热稳定性是通过热重分析（TGA，TA Instruments Q5000）来评估的。分析前，样品（5-10毫克）在105°C下干燥过夜。分析在氮气气氛中进行（20毫升/分钟），样品从35°C加热到700°C，加热速率为10°C/分钟。玻璃化转变温度（Tg）是使用TA Instruments Discovery DSC 250测定的。样品（10-20毫克）被密封在铝坩埚中，并在氮气气氛下进行分析（20毫升/分钟）。为了消除热历史，样品经历了加热-冷却-加热循环：它们首先被加热到80°C并保持等温3分钟，然后冷却到-80°C，最后重新加热到200°C。Tg是从第二次加热扫描中确定的，所有升温速率均为20°C/分钟。2.4.5 动态机械分析 基于木质素的薄膜的动态机械性能是使用动态机械分析仪（DMA Q800，TA Instruments）来表征的。薄膜被切割成大约20毫米×5毫米×2毫米（长度×宽度×厚度）的矩形样品。测量在氮气气氛下进行，频率为1赫兹，加热速率为10°C/分钟，温度范围从-50°C到150°C。2.5 统计分析 所有定量实验结果都以平均值±标准差表示。统计分析是使用SPSS软件进行ANOVA分析，随后进行Tukey的事后检验。差异在p < 0.05时被认为是统计学上显著的。3. 结果与讨论 3.1 木质素的结构演变和反应性的增强 通过HSQC NMR分析阐明了木质素因漆酶修饰而发生的详细结构变化，如图1A所示。光谱显示了对照组和LML样品之间的明显差异，特别是在脂肪族区域，前者显示出清晰且强烈的特征峰，对应于β-O-4烷基芳基醚（A）、β-β树脂醇（B）和β-5苯基香豆素（C）等亚结构，而这些信号在后者中显著减弱。可以清楚地观察到Aα、Aβ（S）、Aβ（G）、Aγ、Bα、Bγ、Cα、Cβ和Cγ更容易发生断裂，表明β-O-4芳基醚键发生了显著的漆酶介导的断裂，并且部分解聚形成了分子量为大约377克/摩尔的寡聚片段。相反，LML光谱的芳香族区域没有显示出显著的信号降解，表明在漆酶修饰过程中芳香族木质素结构几乎没有断裂，苯环框架得到了有效保存。此外，对应于甲氧基（OMe）和Aγ的信号减少，表明在漆酶修饰木质素过程中发生了脱甲基化，产生了更多的OH基团，从而增强了木质素的反应性[26]、[27]。下载：下载高分辨率图像（540KB）下载：下载全尺寸图像 图1. 木质素的结构演变和反应性的增强：A. 对照组和LML的2D-HSQC NMR光谱以及木质素的主要识别亚结构，B. 对照组（上）和LML（下）的31P NMR光谱，C. 对照组和LML的羟基含量，D. 木质素和LML的FTIR光谱，E. 木质素分解酶的酶活性。F. 木质素的XPS分析：调查光谱（左），高分辨率C1s（中）和O1s（右）光谱的AL和LML。图1B和图1C使用31P NMR光谱定量分析了AL和LML的羟基，证明LML中的脂肪族羟基含量（1.52毫米摩尔/克）显著高于AL（1.21毫米摩尔/克）。这种木质素羟基值的增加导致活性-OH基团的浓度提高，因为脂肪族-OH基团是与异氰酸酯反应的关键。从机制上讲，漆酶介导的脱甲基化和β-O-4断裂有效地暴露了更高密度的活性羟基位点，减少了木质素的立体限制。这种结构激活将木质素从被动填充剂转变为活性交联剂，显著促进了脲酸酯键（-NH-COO-）的形成。因此，这导致了一个更加密集和坚固的三维交联网络，直接为LMLPFs观察到的增强机械强度和热稳定性奠定了结构基础。如表1所示，漆酶修饰木质素的分子量和多分散指数（PDI）都低于未修饰木质素，表明在所采用的条件下解聚是主导反应。漆酶主要切割木质素中的β-O-4键，使木质素大分子解聚为小分子，从而导致分子量和分子量分布（Mn）的降低。当引入介质时，氧化的介质可以进一步作用于具有更高氧化还原电位的聚合物单元，从而导致更广泛的解聚。同时，PDI的降低表明修饰后的分子量分布更窄。这是因为高分子量或松散结构的片段被降解，减少了系统中大分子的比例。更均匀的木质素原料有助于在随后的聚氨酯制备中形成均匀的交联网络，并减少了由于大分子聚集而导致的局部未反应区域或应力集中等缺陷的可能性。表1. 对照组和LML的分子量测定结果。空单元Mn/克·摩尔-1Mw/克·摩尔-1PDIAL40836739.00245LML2213771.705882FTIR分析进一步证实了漆酶对木质素官能团修饰的效果（图1D）。在3424厘米-1处增强的宽频带证实了羟基含量的显著增加[28]，这一点得到了1265厘米-1峰衰减的支持，为β-O-4键的断裂和新羟基基团的生成提供了补充证据。这一光谱观察结果直接得到了2D-HSQC NMR分析（图1）的证实。具体来说，HSQC光谱显示LML样品中对应于β-O-4芳基醚键的峰（特别是Aα、Aβ和Aγ信号）明显消失，为漆酶介导的这些键的断裂提供了明确的结构证据，与FTIR结果高度一致。LML中C-H键在2930厘米-1处的振动增强表明侧链断裂和脱甲基化，改变了产生的芳香族单体的官能团[29]。相比之下，1600-1500厘米-1（C=C伸缩）和1510厘米-1（芳香族C-H振动）的特征芳香带显示出稳定的强度。这证实了苯环框架的有效保存，这是增强修饰木质素热稳定性和抗氧化性能的结构特征[30]。FTIR分析证实，漆酶介导的修饰成功地重塑了木质素的分子结构，选择性地针对木质素的侧链，同时保留了其芳香核，其中富集的羟基含量可以增强木质素对异氰酸酯的反应性。为了进一步阐明漆酶修饰引起的表面化学变化，对未修饰和修饰后的木质素进行了XPS分析（图1F）。在C1s光谱中，C-O的相对含量从30.82%降低到30.35%，反映了在漆酶催化的自由基过程中醚键的氧化断裂。更值得注意的是，在O1s光谱中，C-OH/C-O-C氧的比例从54.82%显著增加到58.05%，同时C=O氧的比例从45.18%降低到41.95%。这些变化与β-O-4断裂事件一致，这些事件消耗了一个醚键，同时生成了新的羟基基团。这一发现与31P-NMR结果一致，后者定量证实了酚类羟基（从3.45毫米摩尔/克增加到3.61毫米摩尔/克）和脂肪族羟基（从1.21毫米摩尔/克增加到1.52毫米摩尔/克）含量的增加。FTIR、31P-NMR和XPS证据的结合支持了漆酶修饰过程中部分β-O-4键断裂的发生，导致木质素的羟基功能增强和分子量降低。为了评估酶活性对木质素结构修饰和羟基富集的影响，分析了T. versicolor的分泌谱（图1E）。经过三天的培养后，T. versicolor的漆酶酶活性达到243.63 ± 8.78 U/L（CV = 3.60%），通过多次独立实验确认了该测定的高重复性。漆酶活性大约是MnP和LiP的198倍，证实了其作为木质素修饰的主要驱动力的作用。为了克服直接酶氧化的立体限制并扩展漆酶对顽固非酚类结构的氧化能力，将HBT整合到优化的第3天上清液系统中作为介质[31]。在这个漆酶-介质系统中，漆酶首先氧化HBT生成高活性的自由基中间体。然后这些中间体扩散到空间受阻的木质素网络中，间接氧化其他非酚类底物[32]，从而最大化了后续聚氨酯合成中活性羟基位点的生成。3.2 基于木质素的薄膜的界面结构 木质素激活对形态均匀性和界面兼容性的有效性是显而易见的。使用SEM研究了LPUs冷冻断裂后的横截面形态，观察到薄膜的横截面形态存在显著差异（图2A）。在50k放大倍数下，对照薄膜（PU薄膜）显示出许多内部空隙，孔径为1585.92纳米，这是由于聚氨酯薄膜相对松散的天然网络结构。相比之下，LMLPF显示出紧凑且光滑的形态，孔径大幅减小到242.25纳米。这种显著的结构致密化进一步证实了LML有效地作为交联剂，无缝整合到PU基质中，形成了连续的网络，大大减少了宏观缺陷。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像 图2. 木质素激活对基于木质素的薄膜界面兼容性的影响：A. 冷冻断裂后PU薄膜的SEM断裂表面，B. LPFs（上）和LMLPFs（下）的FTIR光谱，C. 基于木质素的薄膜的膨胀率特性，D. 基于木质素的薄膜的交联密度，E. LPFs（上）和LMLPFs（下）的XRD图案。FTIR分析进一步证实了漆酶对木质素官能团的修饰效果（图2B），在3424厘米-1处增强的宽频带证实了羟基含量的显著增加[28]，这一点得到了1265厘米-1峰衰减的支持，为β-O-4键的断裂和新羟基基团的生成提供了补充证据。这一光谱观察结果直接得到了2D-HSQC NMR分析（图1）的证实。具体来说，HSQC光谱显示LML样品中对应于β-O-4芳基醚键的峰明显消失，为漆酶介导的这些键的断裂提供了明确的结构证据，与FTIR结果高度一致。LML中C-H键在2930厘米-1处的振动增强表明侧链断裂和脱甲基化，改变了产生的芳香族单体的官能团[29]。相比之下，1600-1500厘米-1（C=C伸缩）和1510厘米-1（芳香族C-H振动）的特征芳香带显示出稳定的强度。这证实了苯环框架的有效保存，这是增强修饰木质素热稳定性和抗氧化性能的结构特征[30]。FTIR分析证实，漆酶介导的修饰成功地重塑了木质素的分子结构，选择性地针对木质素的侧链，同时保留了其芳香核，其中富集的羟基含量可以增强修饰木质素对异氰酸酯的反应性。为了进一步阐明漆酶修饰引起的表面化学变化，对未修饰和修饰后的木质素进行了XPS分析（图1F）。在C1s光谱中，C-O的相对含量从30.82%降低到30.35%，反映了在漆酶催化的自由基过程中醚键的氧化断裂。更值得注意的是，在O1s光谱中，C-OH/C-O-C氧的比例从54.82%显著增加到58.05%，同时C=O氧的比例从45.18%降低到41.95%。这些变化与β-O-4断裂事件一致，这些事件消耗了一个醚键，同时生成了新的羟基基团。这一发现与31P-NMR结果一致，后者定量证实了酚类羟基（从3.45毫米摩尔/克增加到3.61毫米摩尔/克）和脂肪族羟基（从1.21毫米摩尔/克增加到1.52毫米摩尔/克）含量的增加。FTIR、31P-NMR和XPS证据的结合支持了漆酶修饰过程中部分β-O-4键断裂的发生，导致木质素的羟基功能增强和分子量降低。为了评估酶活性对木质素结构修饰和羟基富集的影响，分析了T. versicolor的分泌谱（图1E）。经过三天的培养后，T. versicolor的漆酶酶活性达到243.63 ± 8.78 U/L（CV = 3.60%），通过多次独立实验确认了该测定的高重复性。漆酶活性大约是MnP和LiP的198倍，证实了其作为木质素修饰的主要驱动力的作用。为了克服直接酶氧化的立体限制并扩展漆酶的氧化能力以处理顽固的非酚类结构，将HBT整合到优化的第3天上清液系统中作为介质[31]。在这个漆酶-介质系统中，漆酶首先氧化HBT生成高活性的自由基中间体。然后这些中间体扩散到空间受阻的木质素网络中，间接氧化其他非酚类底物[32]，从而最大化了后续聚氨酯合成中活性羟基位点的生成。3.2 基于木质素的薄膜的界面架构 木质素激活对形态均匀性和界面兼容性的有效性是显而易见的。使用SEM研究了LPUs冷冻断裂后的横截面形态，观察到薄膜的横截面形态存在显著差异（图2A）。在50k放大倍数下，对照薄膜（PU薄膜）显示出许多内部空隙，孔径为1585.92纳米，这是由于聚氨酯薄膜相对松散的天然网络结构。相比之下，LMLPF显示出紧凑且光滑的形态，孔径大幅减小到242.25纳米。这种显著的结构致密化进一步证实了LML有效地作为交联剂，无缝整合到PU基质中，形成了连续的网络，大大减少了宏观缺陷。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像 图2. 木质素激活对基于木质素的薄膜界面兼容性的影响：A. 冷冻断裂后PU薄膜的SEM断裂表面，B. LPFs（上）和LMLPFs（下）的FTIR光谱，C. 基于木质素的薄膜的膨胀率特性，D. 基于木质素的薄膜的交联密度，E. LPFs（上）和LMLPFs（下）的XRD图案。脲酸酯的形成在FTIR检查中得到了进一步证实（图2B），该检查旨在阐明增强界面键合的分子机制。通过出现归属于-NH基团（1536厘米-1）[33]和-CN伸缩（1258厘米-1）[34]的特征带，以及聚醚软段（1090-1080厘米-1）[35]的保存，以及-NCO基团在2270厘米-1处的完全消失[36]，证实了木质素-聚氨酯网络的成功合成。关于木质素修饰，C-H伸缩强度的增加（3000-2800厘米-1）与β-O-4键的断裂一致。解聚成较低分子量的片段减少了分子间聚集，从而增强了脂肪族C-H基团（例如-OCH3、-CH2-、-CH-）的红外吸收。这种结构破坏，加上羟基含量的增加，有助于提高修饰木质素的溶解性和均匀性。这种改善的兼容性促进了与HDI的更有效反应，这一点通过LMLPF中与脲酸酯相关带的明显更高强度得到了证实。这种光谱证据表明，漆酶修饰通过富集反应性脂肪族羟基和灵活的侧链，有效地破坏了内部氢键网络，提高了其兼容性。这促进了与HDI的更有效反应，形成了更密集、结构更坚固的交联网络，从而增强了LMLPF的刚性 and 热稳定性。进行了膨胀测试（图2C和图2D）以评估薄膜的网络结构。LMLPF-30%的膨胀率（32.38 ± 6.78%）低于LPF-30%（63.11 ± 2.23%，p < 0.001）。同时，LMLPFs的交联密度比LPFs高39%（1.78 × 10-3 摩尔/立方厘米）。这种增强归因于漆酶修饰，它通过增加羟基基团的可用性和数量来激活木质素。这些活性位点促进了与异氰酸酯的更完全反应，促进了更密集的脲酸酯网络的形成[37]。与膨胀理论一致，这种高度交联的结构限制了溶剂的吸收，导致薄膜更加紧凑和坚固。此外，图2E显示LMLPFs的结晶度显著降低，与LPFs相比，LMLPFs的结晶度为32%，而LPFs为42%，这归因于LMLPF网络中更高的交联密度。LML中更活跃的羟基位点作为更有效的宏观分子交联剂，促进了更好的整合到聚合物网络中，并增加了交联密度[38]。因此，这些额外的交联严重限制了聚氨酯软段的移动性，抑制了结晶所需的链排序，形成了更密集的无定形网络。需要强调的是，这种无缺陷的界面和高交联密度是LMLPFs表现出优异机械硬度和热阻力的直接前提条件。不同的字母（a-c）表示统计学上的显著差异（p < 0.05，单因素方差分析后使用Tukey's HSD检验）。3.3. 机械和热性能的提升LMLPFs表现出显著更好的机械性能，尤其是在30%木质素含量时。LMLPFs的拉伸强度和弹性模量分别增加到31.49 MPa和215.23 MPa，比LPFs提高了大约25%和60%（表1）。这种提升主要归因于LMLPFs中更高的交联密度。如前所述，并通过31P-NMR分析得到证实，漆酶修饰使木质素作为一种更有效的多功能交联剂，通过增加羟基含量从而形成更密集的共价网络。此外，弹性模量增加了60%也证实了这一点。尽管由于混合物内部网络刚性和交联的增加，两组的断裂伸长率都有所下降，但经过修饰的LMLPF仍保持了比LPF更好的柔韧性。这种改进归因于在修饰过程中向木质素中引入了柔性的烷基链，这些链作为柔软的间隔物来减轻芳香核的刚性。另外，LML的改进分散性防止了脆性相和应力集中区的形成，赋予了薄膜更高的延展性。重要的是，LMLPF-30%的机械性能也显著高于LPF-30%（拉伸强度：p = 0.023；弹性模量：p < 0.001），这证实了木质素修饰策略的有效性。表2. LPFs和LMLPFs的机械性能。样品名称拉伸强度 /MPa弹性模量 /MPa断裂伸长率 /%PF11.39±3.0757.81±3.96334.07±109.11LPF-10%12.89±1.2958.88±9.33288.34±94.86LPF-20%15.31±1.5382.73±8.60236.07±59.71LPF-30%25.21±3.55134.40±16.26228.20±25.19LMLPF-10%16.07±2.7478.34±10.64252.13±14.09LMLPF-20%18.24±2.19102.63±11.54216.23±17.80LMLPF-30%31.49±4.18215.23±7.64177.93±27.59PU薄膜的热稳定性通过TGA进行评估，所有样品都显示了两阶段的热分解过程（图3）。第一阶段（200-375 °C）对应于脲酸酯键和木质素侧链的降解[39]，如醚键断裂、脱水和脱羧作用，以及二氧化碳和水的释放[40]。第二阶段的热分解发生在375-500 °C之间，归因于更稳定的芳香结构的分解[41]，[42]。值得注意的是，增加木质素含量提高了分解起始温度（T5%），这种提升在LMLPFs中更为明显（从273 °C升至280 °C），而在LPFs中则为273 °C升至277 °C）。这种优异的稳定性直接归因于漆酶介导的木质素优化：丰富的反应性羟基和减少的空间阻碍促进了LML有效地共价结合到聚氨酯基质中。作为刚性的芳香交联中心，LML促进了更密集的三维网络的形成，限制了链的运动并提高了降解的活化能，从而有效地抑制了键的断裂并增强了材料的整体热稳定性。下载：下载高分辨率图像（280KB）下载：下载全尺寸图像图3. 基于木质素的薄膜的热性能：A. LPFs（左）和LMLPFs（右）的热稳定性，B. PU（左）、LPF（中）和LMLPF（右）的动态机械性能。如图3A所示，将木质素含量从10%增加到30%，LMLPFs的Tg从-13.58 ℃上升到9.30 ℃。木质素不仅可以作为交联剂，还可以作为三维聚氨酯聚合物形成中的硬质部分[41]。同时，木质素是一种无定形的、刚性的高分子，具有较高的Tg[43]。其与聚氨酯的结合提高了交联密度，并引入了强分子间力，如氢键，有效地限制了软质部分的运动[44]。这种提升归因于LML中丰富的反应性羟基，这些羟基促进了更密集的共价网络的形成，比LPFs中较弱的物理相互作用更有效地限制了链的运动。热容（ΔCp）从0.30增加到0.38 J/(g·K)。这一趋势可能由两个因素造成。正如XRD结果所证明的，LMLPF的结晶度低于LPF，无定形部分的膨胀导致热容（ΔCp）增加[45]。此外，漆酶修饰使LML富含酚基和烷基羟基，在无定形相中形成了广泛的氢键网络。研究表明，添加羟基大大增强了氢键网络并提高了宏观比热容[46]。打破这些氢键需要额外的热能，这也提高了ΔCp。DMA结果（图3B）直接证明了修饰后的木质素在聚氨酯网络中作为活性交联剂的作用。纯PU薄膜在-29 ℃时的储能模量非常低（124.19 MPa），并且缺乏明确的tan δ峰，表明网络交联不足。加入未经修饰的木质素后，储能模量增加了大约一个数量级，达到1200 MPa，表明原始木质素可以通过其羟基与异氰酸酯的反应作为交联剂。然而，相对较低的Tg和宽的tan δ峰表明交联效率有限，这可能归因于未经修饰的木质素的高分子量和羟基的可及性差。相比之下，经过修饰的基于木质素的PU薄膜的储能模量进一步增加到大约2000 MPa，伴随着更高的Tg和更尖锐的tan δ峰，表明交联密度得到增强。这种改进可以归因于分子量减少和引入了额外的可及烷基羟基的协同效应。总的来说，这些结果表明，化学修饰有效地将木质素从被动填充剂转变为活性交联剂，显著增强了聚氨酯网络。通过TGA和DSC分析证实，漆酶修饰后聚氨酯薄膜的热稳定性得到了提高，这可以归因于分子层面的关键结构变化。具体来说，LML中活性官能团的富集促进了更密集和结构更坚固的三维网络的形成。至关重要的是，这显著改善了界面兼容性，消除了通常作为热降解弱点的界面空隙和缺陷。LML与聚氨酯网络的共价结合不仅限制了软质部分的运动，从而提高了玻璃化转变温度，还增强了整体交联密度，导致网络得到了显著增强。在这种增强的结构支持下，基于LML的薄膜表现优于最近的文献基准。在30 wt%木质素含量时，其拉伸强度达到了31.49 MPa，大约是之前研究中报告的值的2-3倍，例如13.20 MPa（在37.4 wt%木质素含量时）[14]和10.60 MPa（在30 wt%木质素含量时）[47]。值得注意的是，这种高强度并没有牺牲延展性；我们的样品保持了较高的断裂伸长率（177.93%），优于142.77%[48]。此外，提高的热稳定性（T10%为298.00 °C）进一步证明了形成了坚固的交联网络。3.4. 关于木质素修饰和基于木质素的聚氨酯系统的现有研究为了进一步了解本研究的进展，表3总结了文献中报道的代表性木质素修饰策略的全面比较。与化学修饰方法和之前的酶法相比，本工作中开发的粗漆酶/HBT介导的修饰在温和的水性条件下同时增强了烷基和酚基羟基的含量，从而制备出了具有优异综合性能的PU薄膜。这种策略提供了一种低成本、节能且环保的制备高性能基于木质素的PU薄膜的方法。表3. 与本工作相比的代表性先前关于漆酶修饰木质素和基于木质素的聚氨酯（PU）系统的研究。木质素修饰方法修饰剂及反应条件木质素结构变化性能能量、成本及环境考虑共溶剂增强的木质纤维素分级预处理[14]。THF和H2SO4；条件苛刻（150, 160和180 ℃）。烷基羟基含量减少，酚基羟基含量增加。拉伸强度（13.20 MPa）和断裂伸长率（24.23%）。能耗高，成本中等，使用挥发性有机溶剂。两步酯化修饰[15]。DMF、DMAP和DCC；条件苛刻（80 ℃下持续48小时）。木质素羧基含量增加。拉伸强度（10.00 MPa）和断裂伸长率（34.00%）。化学试剂成本高，能耗中等，环保。HDI修饰[16]。HDI和THF；在氮气氛围下持续（50 ℃下持续6小时）。T5%降低。拉伸强度（12.07 MPa）。能耗低，成本中等，使用挥发性有机溶剂。在TEMPO存在下用漆酶修饰[18]。商业纯化的漆酶和TEMPO；在室温下持续（24小时）。颗粒大小减小。湿剪切强度（1.429 MPa）和粘度（7.92 Pa·s）。能耗高，成本中等。酶法修饰[19]。来自Trametes trogii的纯化漆酶；在pH 6.5下持续（24小时）。烷基羟基含量增加，酚基羟基含量略有减少。纯化的漆酶表现出热稳定性，酚基羟基和甲氧基减少。能耗中等，成本中等。玉米秸秆酶解木质素[49]。商业玉米秸秆酶解木质素。木质素的酚基羟基含量为3.64%。室温下的剪切强度（19.1 MPa）。能耗低，成本低至中等，环保。在TEMPO存在下用漆酶和HBT修饰[18]。粗T. versicolor肉汤和HBT（40 ℃下持续6小时）。烷基和酚基羟基含量增加。拉伸强度（31.49 MPa），弹性模量（215.23 MPa），断裂伸长率（177.93%）和热稳定性（T5% = 280 ℃）。能耗低，在酶法中最低，环保。4. 结论本研究提出了一种绿色的进化酶学策略，使用T. versicolor漆酶系统和HBT将AL功能化为更具反应性的LML，用于制备基于木质素的薄膜。核心创新集中在目标漆酶介导的修饰上，有效地切断了醚键并诱导了脱甲基化。这种温和的酶法修饰增加了酚基羟基（从3.45 mmol/g增加到3.61 mmol/g）和烷基羟基（从1.21 mmol/g）的含量，同时保持了必要的芳香结构。因此，LML表现出比未经修饰的AL更好的反应性，使其在交联反应中发挥了更大的作用。在30%木质素含量时，LMLPFs表现出更密集和更均匀的网络，交联密度（2.48 × 10-3 mol/cm3）高于LPFs（1.78 × 10-3 mol/cm3）。这种结构改进促进了机械性能的提升，拉伸强度和弹性模量分别达到了31.49 MPa和215.23 MPa（分别提高了大约25%和60%），同时热稳定性也得到提高（T5% = 280 ℃）。这些发现表明，漆酶介导的修饰是一种可行且环保的方法，可用于高价值利用木质素，为开发具有改进结构性能的基于木质素的生物复合材料提供了潜在途径。cRediT作者贡献声明廖静静：写作 – 审稿与编辑。周永辉：写作 – 审稿与编辑。范美子：方法学。周晓健：方法学。夏燕：监督，资金获取。王英杰：正式分析。杨杰宇：写作 – 原始草稿，概念化。杜冠本：概念化。秦宇：正式分析。