天王补心汤通过腺苷积累介导的AMPK/SIRT1通路缓解失眠患者的神经炎症

《Journal of Ethnopharmacology》：Tianwang Buxin Decoction Ameliorates Neuroinflammation in Insomnia via Adenosine Accumulation-mediated AMPK/SIRT1 Pathway

　　李亚琪|季世宇|江杰成|李珠江|张卓|吴一轩|张泽峰|乔佩佩|余明宇|黄盼盼
湖北中医药大学基础医学院，武汉，湖北，430070，中国

**摘要**
**民族药理学相关性**
腺苷（Ado）是中枢神经系统中的关键信号分子。在细胞应激下，细胞外腺苷的积累会引发神经炎症，导致神经元损伤和睡眠功能障碍。天王补心汤（TWBXD）对失眠具有长期的治疗效果。然而，相关的药理机制仍需进一步研究。

**研究目的**
阐明天王补心汤治疗失眠的作用及其缓解腺苷诱导的神经炎症的机制。

**材料与方法**
使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了天王补心汤的成分。通过在前脑基底区域诱导腺苷A2A受体（A2aR）的过表达，建立了体内失眠模型。通过24小时多导睡眠图监测睡眠结构，并分析组织病理学、腺苷水平、A2aR表达、炎症介质以及AMPK/SIRT1活性。在体外实验中，使用过表达A2aR的质粒在神经元-星形胶质细胞共培养系统中模拟神经炎症。评估了含天王补心汤的血清对细胞活力、腺苷动态和炎症反应的影响。

**结果**
腺苷的积累引发了神经炎症并破坏了睡眠。与其他剂量相比，17.6 g/kg的天王补心汤表现出最佳疗效。它逆转了腺苷介导的AMP-激活蛋白激酶（AMPK）/Sirtuin 1（SIRT1）轴的抑制，改善了睡眠结构，抑制了核因子-κB、干扰素-γ和白细胞介素-1β等促炎介质的表达，同时促进了白细胞介素-10的表达。体外实验和分子对接验证了天王补心汤的抗神经炎症作用是通过功能性A2aR拮抗机制实现的。

**结论**
失眠中的神经炎症是由腺苷驱动的AMPK/SIRT1信号通路抑制引起的。天王补心汤通过恢复这一通路来缓解失眠，为管理与神经炎症相关的睡眠障碍提供了一种新的治疗策略。

**引言**
失眠的特点是入睡困难、睡眠时间缩短和睡眠质量差（Ferini-Strambi, 2025）。这种障碍会显著降低生活质量，增加内分泌-免疫失调、心血管疾病和精神疾病的风险（Perlis et al., 2022）。由于社会压力的增加，全球失眠的患病率正在上升，目前约有30%的人口受到影响（Roach et al., 2021）。目前的药物治疗主要依赖于镇静催眠药（如巴比妥类药物、苯二氮卓类和非苯二氮卓类）、抗组胺药和抗抑郁药（Howard et al., 2012）。然而，这些药物的临床应用常常受到依赖性、耐受性和戒断症状等不良反应的限制。中医作为一种具有良好安全性的替代疗法，其分子机制的阐明可能为现代临床实践提供新的策略和药物发现途径。
当代研究表明，失眠与持续的神经炎症有关，表现为炎症负担增加和神经元凋亡（Opp and Krueger, 2015; Krueger et al., 2016; Zielinski et al., 2016）。这种慢性炎症环境会促进前脑神经元的过度兴奋（Shi et al., 2023），从而导致严重的睡眠障碍。这种炎症引起的失眠的潜在神经生物学机制值得进一步研究。
腺苷（Ado）在中枢神经系统中既作为稳态神经调节剂，也作为强效的炎症介质（CNS）。然而，其病理积累会引发异常的神经炎症级联反应，从而异常增强神经元兴奋性（Dai and Zhou, 2011; Zhang et al., 2015）。在失眠期间，腺苷会在关键的睡眠调节区域（特别是前脑基底区域）病理积累（Sharma et al., 2010）。这种超生理积累会触发星形胶质细胞的过度激活，而星形胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫效应细胞（Huang et al., 2024）。一旦激活，星形胶质细胞会加剧局部炎症并破坏神经微环境（Guo et al., 2024）。重要的是，腺苷过载转化为神经炎症损伤的主要媒介是腺苷A2A受体（A2aR）。因此，A2aR被确定为本研究的关键靶点。我们假设异常的A2aR激活驱动了从腺苷积累到睡眠-觉醒障碍的转变。
新兴证据表明，AMP-激活蛋白激酶（AMPK）和Sirtuin 1（SIRT1）是一个关键的抗炎信号通路（Cantó and Auwerx, 2009）。然而，在病理腺苷积累的情况下，这一通路的神经保护能力会受损。这种失调会放大促炎级联反应，导致核因子κB（NF-κB）的激活和炎症细胞因子的过度产生（Kauppinen et al., 2013）。持续的炎症和氧化应激会创造一个神经毒性环境，最终导致神经元凋亡（Velagapudi et al., 2017; Yang et al., 2024）。与其他可能的通路相比，AMPK/SIRT1通路直接整合了腺苷信号、细胞代谢和炎症结果。因此，我们专注于AMPK/SIRT1通路，以阐明其在缓解腺苷诱导的神经炎症中的潜力。

**天王补心汤（TWBXD）**是一种经典的中药方剂，最初记录在古代医学文献《女科调经方》中。从民族药理学角度来看，天王补心汤以“滋养阴液、清热、养心安神”而闻名。它在临床上用于治疗多种神经精神障碍，特别是与阴虚火旺相关的失眠、焦虑和心悸。新兴的药理学证据表明，天王补心汤的生物活性成分可以调节AMPK/SIRT1信号通路。例如，丹参中的主要活性成分丹参酮IIA已被证明可以直接上调SIRT1表达并缓解细胞应激（Wu et al., 2023）。同样，茯苓中的主要羊毛甾烷型三萜类化合物茯苓酸能够强烈激活AMPK信号通路，调节细胞代谢和存活（Yang et al., 2022）。这些发现为假设天王补心汤可以通过AMPK/SIRT1通路缓解神经炎症和恢复睡眠稳态提供了强有力的分子依据。

尽管有这些有希望的发现，天王补心汤缓解失眠相关神经炎症的精确分子机制仍有待完全阐明。虽然急性生理性的腺苷升高可以作为促进睡眠稳态的细胞保护信号，但在持续压力下，慢性腺苷积累会病理性地使A2aR信号向促炎状态转变，最终导致星形胶质细胞过度激活和睡眠片段化（Peng et al., 2020）。因此，我们的研究特别针对A2aR-AMPK/SIRT1通路，因为A2aR启动了腺苷诱导的胶质细胞过度激活，而AMPK/SIRT1则作为下游的抗炎检查点。我们假设天王补心汤及其活性成分通过对抗A2aR来缓解失眠，从而恢复腺苷介导的AMPK/SIRT1信号通路抑制并减轻神经炎症。为了验证这一假设，我们结合了体内多导睡眠图和组织化学分析以及体外神经元-星形胶质细胞共培养模型。

**部分内容**
**天王补心汤的制备**
天王补心汤的14种中药成分（表1）从湖北中医药大学附属医院的中药药房采购。将这些草药成分放入细网无纺布袋中，使用自动中药煎煮设备（北京东华源）进行煎煮。加入四倍体积的纯净水浸泡40分钟后，将混合物煮沸30分钟，然后小火慢炖。

**LC-MS/MS分析**
使用LC-MS/MS分析了天王补心汤煎剂（图1A和1B）和经天王补心汤处理的小鼠血清（图1C和1D）的化学成分。质量标记物的分析基于《中国药典》中列出的天王补心汤中药成分及其报告的化学特性。天王补心汤煎剂的色谱图显示了复杂的化学组成。质谱分析鉴定出多种血清成分，包括槲皮素、哈帕苷、哈帕苷元和茯苓酸。

**讨论**
本研究采用了体内和体外模型来阐明天王补心汤治疗失眠的效果和分子机制。我们的发现表明，天王补心汤通过减轻神经炎症和恢复神经微环境稳态显著改善了睡眠结构。从机制上讲，天王补心汤成分通过对抗A2aR来缓解腺苷介导的AMPK/SIRT1抑制，从而减少炎症级联反应和神经毒性。

**结论**
本研究表明，病理性的腺苷积累是失眠病理生理学的主要因素。体外和体内实验均显示，天王补心汤治疗能有效恢复睡眠稳态并减轻神经炎症。这些治疗效果可能是通过抑制A2aR信号通路和重新激活AMPK/SIRT1通路来实现的，后者可以抑制炎症介质的释放。因此，天王补心汤草药煎剂能够缓解失眠。

**作者贡献声明**
张泽峰：可视化、实验。乔佩佩：写作-审阅与编辑、实验。张卓：软件、数据管理。吴一轩：资源、项目管理。李亚琪：写作-初稿、方法学、实验、数据分析、概念化。余明宇：实验、数据分析。黄盼盼：写作-审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。李珠江：验证、方法学。季世宇：写作-初稿。

**未引用的参考文献**
Korkutata and Lazarus, 2023.

**伦理批准**
实验方案获得了Shouzheng Pharma (Wuhan) Biotechnology Co., Ltd.的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（伦理编号：SZHY 2024090503）。所有程序均遵循《实验室动物护理和使用指南》及其后续修订版中的伦理标准。

**出版同意**
本提交已获得所有作者的出版批准。

**数据可用性**
数据可根据请求提供。

**资助**
本工作得到了湖北省自然科学基金[资助编号2023AFD116]和中国国家自然科学基金[资助编号82374310和82174247]的支持。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

**致谢**
我们感谢Shouzheng Pharma (Wuhan) Biotechnology Co., Ltd.的工作人员在动物护理和设施提供方面的出色支持。同时，我们也感谢Editage（www.editage.cn）对本手稿的英语语言编辑和校对工作。