通过丝状真菌支架共同封装微藻Haematococcus pluvialis和乳酸菌Lacticaseibacillus casei，提高了益生菌在模拟胃肠道条件下的存活率

《Journal of Functional Foods》：Co-encapsulation of microalgae Haematococcus pluvialis and lactic acid bacteria Lacticaseibacillus casei via filamentous fungi scaffolds improved probiotic viability in simulated gastro-intestinal conditions

　　Suvro Talukdar | Tyler J. Barzee
肯塔基大学生物系统与农业工程系，美国肯塔基州列克星敦

**摘要**
利用丝状真菌的菌丝网络来包裹微生物的真菌辅助细胞固定化技术，在食品、能源和环境应用中展现出巨大潜力。将多种微生物共同封装在真菌颗粒中，可以开发出兼具互补功能和营养特性的食品输送系统，包括增强益生菌的保护作用和生物活性化合物的输送。本研究使用可食用的丝状真菌Aspergillus awamori来包裹Haematococcus pluvialis微藻和Lacticaseibacillus casei乳酸菌（LAB），以实现益生菌的输送。活性和热失活的颗粒均能成功包裹微藻和LAB，尽管在非活性真菌状态下需要较低的剪切条件。在体外模拟的胃肠道条件下，共封装显著提高了L. casei的存活率。这些发现表明，可食用丝状真菌作为多物种封装的有效支架具有巨大潜力，能够同时输送益生菌和生物活性化合物，并提升其保护效果和功能性。

**1. 引言**
全球人口的增长加剧了对可持续食品来源和材料的需求（Tilman, Balzer, Hill, & Befort, 2011）。与此同时，消费者对饮食与健康关系的认识不断提高，推动了对具有针对性营养健康益处的功能性食品的兴趣（Baker, Lu, Parrella, & Leggette, 2022）。微藻、真菌和细菌因其快速生长率、资源高效性和多样的生物量组成，在食品系统和循环生物经济中展现出巨大应用前景（Ng et al., 2024）。这些微生物群体的生物量提供了独特的营养和功能优势，使其成为开发功能性食品的理想候选者。例如，丝状真菌是膳食纤维、蛋白质和必需氨基酸的来源，而微藻富含蛋白质、脂类、类胡萝卜素色素和维生素；某些细菌（如乳酸菌）以其支持肠道健康的益生菌特性而闻名（Ambati et al., 2019; Zhang et al., 2021; Zielińska & Kolo?yn-Krajewska, 2018）。

由于微小尺寸，收获像LAB和微藻这样的益生菌/营养细胞存在显著挑战。传统的离心、凝固和过滤方法通常能耗较高，且可能对脆弱的细胞造成机械损伤，从而降低其在大规模应用中的功能性和成本效益（Singh & Patidar, 2018）。除了收获挑战外，在加工、储存和消费过程中保持敏感的益生菌细胞的活性和功能性也非常重要。将益生菌输送到胃肠道（GI）的特定区域是一个重大难题，因为它们容易受到极端pH值变化（如胃的高酸性环境）、消化酶（如胃蛋白酶和胰酶）以及小肠中的胆盐等恶劣环境条件的影响，这些因素会损害其活性和功能性（Govaert et al., 2024; Terpou et al., 2019）。封装益生菌是一种有效的技术，可以提高其在整个胃肠道中的生物活性。目前探索的封装技术包括基于凝胶的基质、喷雾干燥、流化床、挤出和聚合物纳米颗粒等，以保护益生菌并提高其活性（Rajam & Subramanian, 2022; Q. Sun, Yin, He, Cao, & Jiang, 2023; Ramírez et al., 2025）。然而，这些技术也有各自的挑战，如能耗高、机械稳定性差以及在恶劣条件下的稳定性不足。此外，目前使用的封装材料并不一定具有营养价值（Q. Sun, Yin, He, Cao, & Jiang, 2023）。高效收获和有效保护的双重挑战凸显了需要创新方法来同时解决处理和输送问题。

丝状真菌凭借其菌丝网络结构及其天然固定多种细胞的能力，有望成为增强微生物细胞功能和稳定性的强大基质。与许多传统封装材料不同，真菌生物质不仅提供结构支持，还具有营养价值，且可在廉价培养基中生长，并能同时收获细胞（Barzee, Cao, Pan, & Zhang, 2021; Ogawa, Moreno-García, & Barzee, 2024）。真菌已被用作固定不同类型细胞（如微藻、酵母和动物细胞）的支架（Ogawa et al., 2024; Talukdar, 2023），并在食品、生物燃料和水处理等领域取得成功应用，尤其是在单物种固定方面。最新进展表明，真菌辅助封装技术在食品系统中具有广泛的应用潜力，包括用于调制饮料、发酵食品、抗氧化剂和脂质输送平台以及3D打印结构食品产品（Baiocco, Preece, & Zhang, 2021; Barzee et al., 2021; Doyle, Talukdar, Xiong, Adedeji, & Barzee, 2025; Lu, Ogawa, Moreno-García, & Nitin, 2024; H. Sun, Chen, Xiang, Hu, & Zhao, 2022）。然而，关于利用真菌作为益生菌保护和输送材料的探索还非常有限。尽管先前的研究展示了真菌辅助微藻固定化在开发具有可调营养成分（如蛋白质含量）的生物制品方面的潜力（Talukdar & Barzee, 2023），但共封装多种微生物的概念为创造含有生物活性化合物的益生菌输送系统开辟了新途径。因此，共封装方法有望生产出具有更好营养成分和健康益处的益生菌产品。然而，由于共封装系统中各参与微生物之间的生态位可能存在重叠，理解系统内微生物的活动状态和相互作用力至关重要。以往关于真菌辅助固定的研究主要集中在单物种系统上，这导致了对共封装过程中多物种相互作用及其对益生菌活性和输送性能影响的认知不足。此外，真菌封装此前主要用于生物活性化合物的输送（Lu et al., 2024）。本研究扩展了这一概念，旨在通过统一的真菌封装系统同时输送益生菌和生物活性化合物。

因此，在本研究中，我们探讨了将微藻和细菌共同封装在丝状真菌颗粒中的方法，以探索其在功能性食品应用中的潜力，如益生菌和生物活性饮料、发酵食品以及结构化食品基质。选择Haematococcus pluvialis（HP）微藻是因为其高蛋白质含量及其能产生astaxanthin的能力——这是一种高价值的红色类胡萝卜素色素，具有强大的抗氧化活性，在营养补充剂、制药、化妆品和水产养殖等行业中有广泛应用（Ba, Ursu, Laroche, & Djelveh, 2016; Oslan et al., 2021; Shah, Liang, Cheng, & Daroch, 2016）。选择Lacticaseibacillus casei（LC）细菌是因为其益生菌特性（D. Hill et al., 2018），而使用可食用的丝状真菌Aspergillus awamori（AA）作为固定基质，是因为其在食品生产中的历史应用（Gao et al., 2025; Hayashi, Kajiwara, Futagami, Goto, & Takashita, 2021）。研究了活性和热失活丝状真菌支架上的单物种和共封装效果，并在模拟胃肠道条件下评估了固定化L. casei的益生菌活性，以评估真菌菌丝基质的保护作用及共封装在提高益生菌存活率方面的潜在协同效应。

**2. 材料与方法**
实验设计如图1所示。研究包括两个主要部分：
（1）共封装研究，探讨机械搅拌速度（75 rpm vs 150 rpm）和真菌活性状态（活性 vs 热失活）对微藻和LAB在真菌颗粒中固定效率的影响，包括通过形态分析和表面表征对封装前后的生物制品进行表征；
（2）益生菌输送研究，评估在模拟胃肠道条件下真菌辅助单物种和共封装培养物的LAB活性。

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**图1. 实验设计概览。**

**2.1. 微藻培养**
在UTEX提供的BG11培养基中，使用之前描述的相同培养系统和技术（Talukdar & Barzee, 2025），在1 L光生物反应器中培养微藻株H. pluvialis UTEX 2505（简称HP）。光生物反应器采用LED照明（Intertek 5,012,137），光照强度为100 μmol photon/m2/s，光照周期为12小时/黑暗周期12小时。通气量为1 vvm，使用0.2 μm膜过滤的湿润空气。微藻生物量通过标准方法测定为挥发性悬浮固体（VSS），生物量浓度计算公式为：
$$ C = 0.72 \cdot ABS680 - 0.03 $$
其中C（g VSS/L）为微藻细胞浓度，ABS680为680 nm处的吸光度。微藻细胞数量通过血细胞计数器计数，固定化细胞数量计算公式为：
$$ B = 6 \times 10^7 \cdot ABS680 - 7 \times 10^6 $$
其中B（细胞数/mL）为细胞浓度，ABS680为680 nm处的吸光度。

**2.2. 真菌和细菌培养**
Aspergillus awamori ATCC 22342（简称AA）在30°C下培养于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中。通过用无菌水无菌清洗琼脂表面制备孢子悬浮液，并用血细胞计数器测定孢子浓度。将孢子悬浮液接种到100 mL马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中，最终浓度为1,000孢子/mL，然后在30°C下、150 rpm的摇床（Innova 42, New Brunswick Scientific）中培养48小时，得到直径约4.2 mm的真菌颗粒。真菌生物量通过标准方法（APHA, 2012）测定为总固体（TS）和挥发性固体（VS）。

**2.3. 搅拌速度对微藻和益生菌细菌固定的影响**
为了评估搅拌速度对微藻封装的影响，使用直径约4.2 mm的预成型真菌颗粒，先用去离子水清洗后分别以活性（A-）或热失活（HD-）形式使用。热失活通过121°C下高压灭菌1小时实现。通过在马铃薯葡萄糖琼脂上接种并30°C下培养，确认热失活颗粒的代谢不活性，未观察到真菌生长。在30°C下、150 rpm的摇床（Innova 42, New Brunswick Scientific）中以两种不同的搅拌速度（75 rpm和150 rpm）进行固定化，时间各为35小时。每次实验中，将真菌颗粒加入100 mL微藻溶液中，微藻浓度为0.54 g VSS/L（通过用去离子水稀释静止相中的微藻溶液获得），菌藻装载比为5.1 g VS真菌/g VSS，细菌装载量为1.47 × 10^5 CFU/mL。使用公式1计算实验开始和平衡时溶液中的微藻细胞浓度，从而确定每克TS真菌中的固定化细胞数量。微藻固定化效率通过测量上清液在680 nm处的吸光度（SpectraMax M2）来表示：
$$ IEabs = \left[ 1 - \frac{ABS680_t}{ABS680_i} \right] $$
其中ABS680,i为初始吸光度，ABS680,t为t小时时的吸光度。固定化效率值范围为0（0%固定化）到1（100%固定化）。

为了确定固定化策略对L. casei细菌封装的影响，进行了单物种和多物种封装实验。单物种系统（HD – AA + LC - 75）仅包含L. casei的固定，而多物种系统（HD - AA + HP + LC - 75）同时包含H. pluvialis和L. casei。由于初步研究发现高搅拌速度（150 rpm）导致细菌细胞固定化效果较差，因此本实验采用低搅拌速度（75 rpm）进行。对于单物种（仅细菌）封装，将HD颗粒和细菌加入100 mL BG-11培养基中，以模拟多物种系统的环境。对于多物种（细菌和微藻）封装，将HD真菌颗粒（0.33 g VS）和细菌加入100 mL微藻溶液（0.54 g VSS/L）中。两种系统中，L. casei细菌的最终接种浓度为5 × 10^6 CFU/mL，并在30°C下、75 rpm下搅拌35小时。接种细菌的浓度通过接种到MRS琼脂上来确定（da Silva, Tagliapietra, do Amaral Flores, & dos Santos Richards, 2021）。通过用无菌玻璃珠匀浆颗粒并接种到MRS琼脂上来确定固定化细菌的数量（da Silva et al., 2021）。

**2.4. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析**
根据之前描述的方法（Talukdar & Barzee, 2025），对封装前后的颗粒进行了FTIR分析。这些颗粒在?40°C和66.66 Pa的压力下使用LabConco FreeZone 4.5 L型冷冻干燥机（型号72040，位于美国堪萨斯城）进行了48小时的冻干处理。冻干后的样品使用衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱仪（Nicolet iS50，Thermo Fisher Scientific）进行分析，该光谱仪配备了掺杂氘的L-丙氨酸硫酸盐（DLaTGS）探测器。光谱采集范围为500–4000 cm?1，分辨率为4 cm?1，每个样品平均扫描32次。OMNIC软件（Nicolet Instrument Corporation，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）用于获取光谱数据，而GraphPad Prism 10（美国加利福尼亚州圣地亚哥）则通过二阶多项式滤波来去除噪声。

2.5. Zeta电位
使用Zetasizer仪器（Nano N3700，Malvern Panalytical，英国）和先前描述的方法（Talukdar & Barzee, 2025）测量了真菌颗粒以及共培养的微藻和细菌的zeta电位。具体步骤如下：首先用无菌去离子水清洗真菌颗粒并使其均匀分散成悬浮液，然后在室温下测量zeta电位。微藻溶液用BG-11培养基稀释至最终浓度为0.54 g VSS/L。通过添加1 M NaOH或HCl调节样品的pH值，然后在pH范围3.0至10.00内测量每个样品的zeta电位。

2.6. 扫描电子显微镜成像
按照先前描述的方法（Chu et al., 2021），对共封装后的真菌颗粒进行了扫描电子显微镜（SEM）观察。颗粒先用磷酸盐缓冲液清洗，然后在2.5%戊二醛中固定24小时。固定后的颗粒依次浸入不同浓度的乙醇（50%、60%、70%、80%、90%、100%）中各20分钟进行脱水处理。随后使用临界点干燥器（Leica EM CPD 300）在CO2环境中干燥，并用铂进行溅射涂层，涂层厚度为5 nm，最后在FEI QUANTA 250扫描电子显微镜下观察。

2.7. 模拟胃肠道条件下的益生菌存活性评估
为了评估益生菌的存活情况，将均质化的颗粒置于模拟的胃肠道环境中，该环境复制了人体消化系统的条件（da Silva et al., 2021）。食管-胃阶段通过加入25 mg/mL的胃蛋白酶溶液（溶于0.1 M HCl）来模拟，该溶液以0.05 mL/mL的速率逐渐加入，同时使用1 M HCl将pH值从5.5调节至2.0。搅拌速度保持在130 rpm。十二指肠阶段通过加入2 g/L的胰酶和12 g/L的牛胆盐来模拟，起始时加入量为0.25 mL/mL，pH值调节至5.0，搅拌速度保持在45 rpm。最后，通过加入过滤灭菌的0.1 M NaHCO3将pH值调节至6.5，并持续搅拌45分钟。在每个阶段，将10 μL的均质化颗粒接种到MRS琼脂平板上，每个稀释度重复两次。平板在37°C下培养72小时后计数菌落（da Silva et al., 2021）。然后计算每克干物质（TS）中的菌落形成单位（CFU）。为了防止真菌生长，在MRS培养基中添加了200 ppm的尼斯塔汀（nystatin）作为抗真菌剂。

2.8. 统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 10（美国加利福尼亚州圣地亚哥）软件进行。所有实验至少包含三个生物学重复。对log10转换后的数据进行了双因素方差分析（two-way ANOVA），以评估胃肠道阶段和固定策略的影响及其相互作用。使用Shapiro-Wilke检验评估模型残差的正态性，并通过观察残差图评估误差方差的恒定性（homoscedasticity）。显著性水平设定为p ≤ 0.05，对于显著效应，进行了事后Tukey HSD检验进行家族间比较。

3. 结果与讨论
3.1. 共封装性能
真菌颗粒显示出复杂的三维菌丝网络结构，该结构作为微藻和细菌封装的主要支架，在热处理后仍保持完整（图2）。SEM成像显示，在热失活的（图2A）和活性的（图S1）真菌颗粒中，成功共封装了Haematococcus pluvialis和Lacticaseibacillus casei。然而，在高搅拌速度（150 rpm）下，HD颗粒不利于细胞附着（图2B）。高搅拌速度下固定效率较低可能是由于高剪切力超过了HD真菌材料的相对较弱的吸引力（Talukdar & Barzee, 2025）。形态分析揭示了与定量固定效率结果一致的细胞固定模式（图S2和图3）。所有处理条件下微藻细胞均成功固定，且HD-AA+HP+LC-75共培养颗粒的固定效率在35小时时达到最大值62.7%（图S2）。这一趋势与之前报道的单一物种固定研究结果一致（Talukdar and Barzee, 2023, Talukdar and Barzee, 2025），表明细菌的存在并未显著干扰微藻的固定效果。此外，在固定过程中未观察到细菌、微藻细胞或真菌结构的视觉损伤，表明固定后的颗粒能够承受益生菌递送系统所需的后续处理步骤。细菌和微藻都被包裹在颗粒的内部结构中，所有处理条件下都观察到了多层吸附现象（图2A和图S1）。这种细胞迁移现象在微藻-真菌系统中已有报道（Chu et al., 2021; Talukdar and Barzee, 2023, Talukdar and Barzee, 2025），对于益生菌应用可能特别有益，因为菌丝网络和共封装的微藻提供的多层保护可以减少益生菌在胃肠道中的酸性及酶促条件下的直接暴露（Shi et al., 2022）。由于HD真菌颗粒在益生菌递送应用中的重要性高于活性真菌颗粒，因此结果主要关注HD处理方法，而活性颗粒系统的更多细节见补充材料。

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图2. 在75 rpm和150 rpm下HD-AA+HP+LC的扫描电子显微镜图像。HD-AA+HP+LC是热失活的A. awamori颗粒，其中固定了L. casei细菌和H. pluvialis微藻。
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图3. 在单培养和共培养条件下，HD真菌颗粒支架中微藻和LAB的固定性能。数据表示为平均值±标准偏差（至少2个生物学重复）。HD-AA+HP是热失活的A. awamori颗粒，其中固定了H. pluvialis微藻；HD-AA+LC是固定了L. casei细菌；HD-AA+HP+LC是固定了L. casei细菌和H. pluvialis微藻的共培养物。
在75 rpm下，量化了HD真菌颗粒中H. pluvialis和L. casei的细胞固定情况（图3）。结果显示，与共培养的HD-AA+HP+LC-75（8.90 ± 0.30 log CFU g?1）相比，L. casei在HD-AA+LC-75中的细胞固定效率更高（9.70 ± 0.03 log CFU g?1），而H. pluvialis的固定水平在两种情况下相似。H. pluvialis的存在可能导致细菌固定效率降低，这可能是由于共封装过程中真菌基质内的表面竞争或附着位点减少所致。

3.1.1. Zeta电位
为了了解共封装过程中各生物体之间的静电相互作用，测量了75 rpm下藻类-细菌共培养物的zeta电位（HP + LC-75 rpm），并结合在相同条件下获得的单个生物体数据进行了分析（Talukdar & Barzee, 2025）。藻类-细菌共培养物（HP + LC-75 rpm）和HD真菌的zeta电位测量结果显示，在pH范围3.0至10.0内具有不同的表面电荷特性（图4）。两个系统在整个pH范围内显示出相似的zeta电位变化趋势，即随着pH值的增加，zeta电位值降低（变得更负）。这种pH依赖性趋势归因于微生物细胞表面可电离基团（如羧基（-COOH）、氨基（-NH3+）和磷酸基团）的脱质子化。在较低的pH值下，这些基团的质子化减少了整体负表面电荷；而在较高的pH值下，脱质子化加剧，导致zeta电位值更负，从而增加了微生物细胞之间的静电排斥（Ozkan & Berberoglu, 2013; Talukdar & Barzee, 2025）。HP + LC-75的zeta电位值范围大约为pH 3.0时的?6.3 mV到pH 10.00时的?38.88 mV。相比之下，HD真菌的zeta电位值略低，范围约为pH 3.0时的7.85 mV到pH 10.00时的?23.32 mV。两种样品观察到的负zeta电位值与先前报道的各组成微生物的zeta电位特性一致，其中H. pluvialis和活性真菌颗粒在中性pH值（约8.0）时均表现出负表面电荷（分别为?33.34 mV和?19.90 mV）（Talukdar & Barzee, 2025）。HP + LC-75的最终pH值为约8.0，此时zeta电位为?31.69 mV。尽管HD真菌和藻类-细菌共培养物（HP + LC）具有负表面电荷，但细菌和微藻仍能成功共封装，表明固定过程受多种机制控制，而不仅仅是静电相互作用。这些发现表明，物理捕获和微生物之间的生化相互作用可能是有效多物种固定的主要驱动因素。

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图4. 在不同pH值下，热失活真菌（HD Fungi）和自由藻类-乳酸菌共培养物（HP + LC-75）的zeta电位。
所有共封装系统的初始pH值约为8.1（图S3）。在含有活性真菌颗粒的共封装系统中，最终pH值在75 rpm时显著降至7.13 ± 0.08，这归因于代谢活跃的真菌颗粒和L. casei在培养基中产生的有机酸（Cao, Barzee, El Mashad, Pan, & Zhang, 2024; Panesar, Kennedy, Knill, & Kosseva, 2010）。HD-AA+HP+LC的pH变化适中，最终pH值为7.58 ± 0.01，反映了热失活真菌的代谢不活跃性，而L. casei仍保持代谢活性并产生有机酸。在150 rpm下，同一热失活系统的pH值下降最小，为7.81 ± 0.01，这可能是由于真菌颗粒的代谢不活跃性和真菌基质内细菌固定较少所致。

3.1.2. FTIR分析
使用衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱技术表征了HD A. awamori真菌颗粒的功能基团，以及封装了H. pluvialis微藻、L. casei细菌以及共封装的微藻和细菌的颗粒（图5）。总体而言，FTIR光谱显示了反映固定微生物组成和代谢特征的独特生化信号。热失活导致与多糖和蛋白质相关的峰减少，表明细胞外聚合物（EPS）的丢失和蛋白质变性。微藻细胞的固定略微增强了这些峰，主要是由于添加了藻类多糖和蛋白质。在L. casei细菌固定的颗粒中，这种效应最为明显，表明其分泌了富含多糖、蛋白质和含氮化合物的EPS。相比之下，共封装系统的峰强度处于中等水平，表明藻类和细菌的同时存在可能引发了复杂的相互作用，可能是由于资源竞争、真菌基质内的空间限制或微藻和细菌之间的代谢相互作用影响了EPS的分泌和整体生化特性。固定后没有新的光谱带出现，证实这些相互作用主要基于物理捕获和生化增强，而非新化学键的形成，这与之前涉及活性和热失活真菌颗粒的固定研究结果一致（Talukdar and Barzee, 2023, Talukdar and Barzee, 2025; Wang et al., 2022）。

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图5. HD A. awamori（HD-AA）、固定了L. casei细菌的HD A. awamori（HD-AA+LC）、固定了H. pluvialis的HD A. awamori颗粒（HD-AA+HP）以及共固定了细菌和微藻的HD A. awamori颗粒（HD-AA+HP+LC）的傅里叶变换红外光谱谱图。所有处理均在75 rpm下进行。
在所有样品中都观察到一个位于3300 cm?1附近的宽吸收带，对应于OH伸缩振动，可能来自水、碳水化合物或氢键。该峰的强度在HD-AA中较低，反映了多糖含量的减少，这与之前的研究结果一致（Talukdar & Barzee, 2025; Zou et al., 2024）。在微藻被固定后，该谱带的强度略有增加，这可能是由于微藻多糖的贡献。HD – AA + HP + LC与HD - AA + HP显示出相似的强度，表明添加细菌并未显著影响水合或碳水化合物含量。相比之下，HD - AA + LC在3300 cm?1处显示出最高的强度，表明L. casei可能分泌类似EPS的化合物或增强了真菌基质内的多糖相互作用，从而产生了更强的OH键峰。2934 cm?1处的CH伸缩可能来自真菌、微藻或细菌分泌的多糖（Abid等人，2018年）。HD真菌的较低强度表明在热处理过程中EPS被去除。微藻的固定以及微藻和细菌的共固定由于这些生物体贡献的EPS而增加了强度。L. casei固定的真菌显示出的最强强度可能归因于细菌分泌的EPS（Li等人，2014年）。接近1647 cm?1的酰胺I带，归因于蛋白质或肽的CO伸缩，显示出相似的模式。HD真菌中的弱峰表明蛋白质在热处理过程中发生了变性，而H. pluvialis的固定则由于藻类蛋白质的加入而增强了这一现象。尽管HD - AA + HP + LC显示出与HD - AA + HP相似的酰胺I峰强度，但HD - AA + LC显示出了最强烈的酰胺I峰，超过了单独固定和共封装的样品。这种增强的强度表明L. casei可能通过分泌富含蛋白质的EPS来提供更高的蛋白质或肽含量（Li等人，2014年）。在1540 cm?1处观察到一个峰，对应于硝基化合物的N - O伸缩振动，其强度在不同样品中有所变化。HD-AA真菌中的强度最低，而在微藻固定后强度有所增加，这可能归因于H. pluvialis产生的含氮代谢物或细胞成分。微藻和细菌的共固定由于这些生物体贡献的EPS而增加了强度。L. casei固定的真菌显示出的最强强度可能归因于细菌分泌的EPS（Li等人，2014年）。接近1647 cm?1的酰胺I带，归因于蛋白质或肽的CO伸缩，显示出相似的模式。HD真菌中的弱峰表明蛋白质在热处理过程中发生了变性，而H. pluvialis的固定则由于藻类蛋白质的加入而增强了这一现象。尽管HD - AA + HP + LC显示出与HD - AA + HP相似的酰胺I峰强度，但HD - AA + LC显示出了最强烈的酰胺I峰，超过了单独固定和共封装的样品。这种增强的强度表明L. casei可能通过分泌富含蛋白质的EPS来提供更高的蛋白质或肽含量（Li等人，2014年）。在1540 cm?1处观察到一个峰，对应于硝基化合物的N - O伸缩振动，其强度在不同样品中有所变化。HD-AA真菌中的强度最低，而在微藻固定后强度有所增加，这可能归因于H. pluvialis产生的含氮代谢物或细胞成分。HD-AA+LC在1540 cm?1处显示出最明显的峰，表明L. casei显著促进了硝基化合物的形成，可能通过氮代谢或产生富含氮的EPS成分。Minari、Piazza、Sass和Contiero（2024年）报告称L. casei产生的EPS含有高达18%的蛋白质，表明EPS中存在富含氮的功能基团。共封装的真菌显示出介于单独固定和细菌固定的真菌之间的强度。接近1240 cm?1的酰胺基团的CN伸缩显示出类似的趋势。HD-AA真菌中的强度较弱，而HD-AA+HP显示出强度的显著增加，表明微藻蛋白质的贡献显著。然而，HD-AA+LC在1240 cm?1处显示出最明显的峰，表明L. casei显著增强了酰胺基团的存在，可能通过分泌富含蛋白质的EPS或表面蛋白质。接近1030 cm?1的峰，归因于多糖的CO伸缩，在HD真菌中较弱，在微藻细胞固定后强度有所增加，表明H. pluvialis为真菌基质贡献了多糖成分。HD-AA+HP + LC显示出的光谱与HD-AA+HP几乎相同，而HD-AA+LC在1030 cm?1处显示出所有样品中最高的强度，表明L. casei分泌的类似EPS的化合物显著增强了真菌基质中的多糖含量。

3.2. 在模拟胃肠道条件下的益生菌活力
为了确保益生菌在胃肠道中的足够活力，建议含有益生菌的食物在食用前提供8–9 log CFU g?1的初始细胞浓度（Terpou等人，2019年；Vasiljevic & Shah，2008年）。为了避免对益生菌递送系统的潜在干扰，优先选择HD真菌颗粒而不是活性真菌，因为代谢不活跃的颗粒消除了与固定细菌和微藻竞争营养或代谢相互作用的风险。然而，HD颗粒中细菌固定的敏感性表明必须使用低剪切率来确保两种微生物（微藻和乳酸菌）的成功共封装。因此，在益生菌递送研究中，仅使用了来自HD真菌的材料和低剪切条件（75 rpm）。

为了评估真菌辅助固定策略对益生菌递送的影响，在模拟胃肠道条件下评估了L. casei细菌的活力，分为三组处理：未固定的细菌（对照组）、HD-AA + LC（单一物种封装）和HD-AA + HP + LC（共封装）（图6）。对log10转换数据进行了双因素方差分析（ANOVA）以改善正态性和同方差性。分析显示，两个主要因素显著影响了益生菌的活力结果。胃肠道阶段是最有影响力的因素，占益生菌活力总变异的53.07%（p < 0.0001），表明消化条件对细菌存活有显著影响。固定策略是第二大因素，解释了总变异的41.24%（p < 0.0001），证实了固定方法对整个胃肠道中益生菌活力的显著影响。胃肠道阶段和固定策略之间的交互作用占变异的2.01%，但没有统计学意义（p = 0.0968），表明不同固定策略的保护效果在所有消化阶段基本一致。结果表明，胃肠道阶段和固定策略（单物种和共封装）都显著影响了益生菌的活力（p < 0.05）。

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图6. 在模拟胃肠道条件下，L. casei的益生菌活力与在HD Aspergillus awamori颗粒中单独封装和与Haematococcus pluvialis微藻共封装的L. casei细胞的比较。（A）绝对细菌计数（log CFU）显示了所有处理组的初始浓度和每个消化阶段的存活情况。（B）每克真菌的绝对细菌计数（log (CFU g?1)）显示了单物种封装和共封装的初始浓度和每个消化阶段的存活情况。（C）三个消化阶段（胃、十二指肠和回肠）中存活L. casei的对数减少。（D）三个消化阶段（胃、十二指肠和回肠）中L. casei的存活百分比。条形上方字母表示统计显著性；具有相同字母的条形之间没有显著差异（p > 0.05）。数据表示为平均值±标准差（至少3个生物重复）。

在所有固定策略中，L. casei的存活在模拟的胃肠道阶段中呈现出一致下降的趋势，存活百分比和活细胞计数从胃到回肠逐渐减少（图6）。当比较不同胃肠道阶段的整体益生菌表现时，固定策略的影响变得明显。由于不同固定系统（单物种和多物种）的细菌固定性能不同，无法在不同处理中实现一致的细菌加载量。尽管单物种固定的初始细菌负载量为9.45 log CFU g?1，共封装为8.70 log CFU g?1，自由细菌为4.49 log CFU，所有系统在每CFU基础上都暴露于相同的酶条件下，确保了公平比较。L. casei的最大对数减少范围在0.69到1.08之间，而在HD-AA+HP + LC共封装处理中，三个胃肠道阶段的最大对数减少范围为0.12到0.49（图6B）。在胃阶段，不同固定策略之间的L. casei存活出现了明显差异。胃阶段代表了第一个具有挑战性的环境，因为条件高度酸性且含有胃蛋白酶（Guyton & Hall，2006年）。自由L. casei对高度酸性环境的抵抗力较差，存活率下降到20.4%（3.80 log CFU）。相比之下，HD-AA + LC显著提高了抵抗力，保持了34.67%的存活率（8.99 log CFU g?1），而共封装系统（HD-AA + HP + LC）在胃阶段表现出最强的保护效果，保持了47.86%的存活率（8.58 log CFU g?1）。

在十二指肠阶段也观察到了类似的趋势，其中胆盐和消化酶的暴露进一步降低了细菌的存活率。自由细胞的存活率下降到17.5%（3.74 log CFU），证实了它们的耐受性有限。固定在真菌中的细菌（HD-AA + LC）保持了相对稳定的存活率，为33.11%（8.97 log CFU g?1），而共封装系统表现出最佳的保护效果，保持了44.67%的存活率（8.54 log CFU g?1）。到了回肠阶段，由于累积的消化压力，所有处理的存活率都下降了。自由L. casei的存活率进一步下降到8.4%（3.42 log CFU），而固定在真菌中的细菌保持了10.47%的存活率（8.47 log CFU g?1），高于治疗阈值。共封装系统继续表现出优越的性能，存活率为20.42%（8.21 log CFU g?1），几乎是单物种真菌固定的两倍。这表明H. pluvialis在真菌基质中的加入增强了细菌的存活。结果表明，与微藻的共封装为细菌的存活提供了额外的保护作用。此外，结果还表明，单独在真菌颗粒中固定的LAB在整个胃肠道中的益生菌活力显著高于自由细菌，除了回肠阶段。然而，单物种和多物种固定的益生菌活力在整个胃肠道中除了回肠阶段外统计上相似。共封装的LAB活力提高表明微藻提供了额外的营养或保护作用，有助于在长时间暴露于胃肠道压力下维持细菌的活力。共封装系统中保持的高细菌计数确保了足够的活性益生菌能够到达肠道的目标部位，从而提供有益的健康效果。这些发现提供了有力的证据，表明与微藻的共封装创造了比单独使用真菌固定更高的保护效果。活力的增强可能归因于微藻细胞在真菌基质中创建的额外物理屏障，提供了对消化酶和胆盐的额外保护；藻类生物质可能具有的缓冲能力有助于维持更有利于细菌存活的局部pH条件（Sorokin，1971年）；以及藻类EPS提供的营养支持，可能有助于在长时间压力条件下维持益生菌的活力。在整个胃肠道中，益生菌活力的持续增强验证了共封装方法作为一种潜在的益生菌递送技术，通过结合富含蛋白质和抗氧化剂的微藻提供了双重好处。然而，未来的研究需要探索封装材料在胃肠道中的潜在保护机制。

在模拟胃肠道条件下，评估了Lacticaseibacillus物种的存活百分比（以CFU g?1计），并与使用不同支架系统的先前研究进行了比较（表1）。与文献数据的比较分析显示，基于真菌生物质的递送系统表现与商业和植物生物质基的益生菌递送方法相当或更好（da Silva等人，2021年）。此外，HD-AA + LC和HD-AA + HP + LC的益生菌活力保持在推荐的治疗有效范围（6–7 log CFU g?1）内（C. Hill等人，2014年）。商业冻干益生菌在整个胃肠道阶段的活力仅为3.16%，而商业胶囊的活力更低（0.13%）。使用发酵牛奶和果肉的植物生物质系统表现不稳定，胃阶段的活力为4.37%，十二指肠阶段为11.75%，最终回肠阶段为6.76%。然而，工业冻干益生菌在整个胃肠道阶段的活力显著更高（胃阶段后为63.1%，回肠阶段后为31.2%），但这些冻干益生菌需要特定的激活程序，如MRS肉汤培养基中的孵育和随后的处理步骤，这些步骤消费者在家里无法实际操作。因此，尽管在实验室条件下它们的保护性能有所提高，但它们直接应用于普通消费者可能仍然有限（da Silva等人，2021年）。

表1. 不同研究中报告的Lacticaseibacillus物种在胃肠道模拟前的存活百分比。结果以log CFU g?1表示，括号内为初始CFU g?1的百分比存活率。

样本 | 支架特征 | 胃肠道模拟 | log CFU g?1 | （%存活率）
--- | --- | --- | --- | --- |
| 发酵牛奶 + 果肉（Guabiroba） | 6.2 | 4.85 | (4.37%) | 5.28 | (11.75%) | 5.04 | (6.76%) | (Prestes等人，2021年) |
| 商业冻干益生菌 | 7.3 | 5.8 | (3.16%) | 5.8 | (3.16%) | 5.8 | (3.16%) | (da Silva等人，2021年) |
| 商业胶囊 | 9.9 | 7.1 | (0.16%) | 7.1 | (0.16%) | 7.0 | (0.13%) | (da Silva等人，2021年) |
| 工业冻干益生菌 | 8.2 | 8.0 | (63.09%) | 7.9 | (50.12%) | 7.7 | (31.62%) | (da Silva等人，2021年) |
| HD-AA+LC | 真菌生物质 | 9.45 | 8.99 | (34.67%) | 8.97 | (33.11%) | 8.47 | (10.47%) | 本研究 |
| HD-AA+HP + LC | 真菌生物质 | 8.70 | 8.58 | (47.86%) | 8.54 | (44.67%) | 8.21 | (20.42%) | 本研究 |

* 商业益生菌是从药店购买的，使用前需要少量（用水稀释）或无需准备即可直接食用。工业益生菌由专门的公司生产，用于食品制造应用，需要按照制造商的协议在MRS肉汤中激活。

评估益生菌递送系统的有效性需要仔细解释细胞存活百分比和绝对细胞浓度（log CFU g?1）。虽然基于真菌生物量的系统采用了与表1中列出的商业益生菌相似的胃肠道模拟方法，但其他研究在胃肠道模拟条件上使用了略有不同的方法。这些方法上的差异使得不同输送系统之间的直接比较变得具有挑战性。此外，包括细菌菌株、初始细胞生理状态、培养条件以及内在的耐受机制在内的生物变量对存活结果有着显著影响，而这些因素与输送系统的保护能力无关。在研究商业胶囊时，报告细胞存活率百分比与绝对计数的重要性变得尤为明显——这些胶囊虽然显示出了非常低的存活率（0.13%），但由于初始细胞装载量极高（9.9 log CFU g?1），仍保持了治疗相关的浓度（7.0 log CFU g?1）。这个例子表明，尽管可以通过高初始细胞装载量达到推荐的治疗水平，但细胞存活率百分比提供了更相关的衡量输送系统保护效果的方式，从而能够在不同平台之间进行公平的比较，而无需考虑初始浓度。未来的工作需要进一步优化固定化系统，并允许对输送系统进行定制，以实现乳酸菌（L. casei）和虾青素的受控或区域特异性释放。此外，还需要进一步研究以了解封装基质在消化过程中的保护机制，这将有助于深入了解导致这种共封装技术性能提升的生化相互作用。真菌辅助共固定化的工业规模化取决于包括原材料采购、真菌培养、固定化及后续干燥过程在内的各个阶段的成本结构。使用杏仁壳生产真菌生物质的技术经济分析证明了从低成本底物开始培养过程的经济可行性（Cao, Chen, Mashad, Pan, & Zhang, 2026）。虽然大部分运营成本来自原材料和公用事业费用，但真菌生物质的最低售价对原材料成本最为敏感。然而，将细胞固定在真菌颗粒中引入了额外的设备和能源需求，这些因素尚未进行经济量化。因此，需要专门的技术经济分析来评估封装及后续加工过程，以确定整个过程在工业规模上是否具有成本竞争力。

**4. 结论**
本研究首次展示了使用丝状真菌作为益生菌输送载体的应用。热灭活的阿魏曲霉（Aspergillus awamori）成功共封装了微藻（H. pluvialis）和乳酸菌（L. casei），建立了一种新型的多物种输送系统。共封装提高了益生菌的存活率，特别是在模拟胃肠道条件后，L. casei的存活率显著高于未封装的细菌对照组。这种真菌辅助的共封装平台代表了益生菌输送技术的一项进展，通过整合富含蛋白质和抗氧化剂的微藻，实现了功能性食品的保护效果增强和营养成分的改善。因此，该系统可以有效地应用于需要提高益生菌存活率和生物活性营养素输送的功能性食品系统中，如质地饮料、发酵产品及结构化食品。这类应用符合对多功能食品成分日益增长的需求，这些食品成分通过在同一平台上结合益生菌和富含抗氧化剂的微藻，提供了营养和健康促进潜力。未来需要进一步研究以优化操作参数和细胞存活率，评估产品的长期稳定性，并进行体内研究以确认其治疗效果。

**作者贡献声明**
Suvro Talukdar：撰写原始草稿、数据可视化、方法论设计、实验实施、数据分析、概念构建。
Tyler J. Barzee：撰写修订稿、数据可视化、项目监督、项目管理、方法论设计、资金筹集、数据分析、概念构建。

**伦理声明**
本研究未涉及人类参与者或动物实验，所有实验均在实验室条件下使用微生物培养物进行。因此，无需伦理批准或知情同意。