3D打印的淀粉-醇溶蛋白水凝胶在体外消化-Caco-2模型中提高了叶黄素的生物可利用性和肠道转运效率

《Journal of Functional Foods》：3D-printed starch-zein hydrogels enhance lutein bioaccessibility and intestinal transport in an in vitro digestion–Caco-2 model

　　奥卢瓦托比·阿穆萨特（Oluwatobi Amusat）、萨福拉·艾哈迈德扎德（Safoura Ahmadzadeh）、索鲁尔·巴雷卡特（Sorour Barekat）、阿里·乌贝伊托古拉里（Ali Ubeyitogullari）、孙-奥克·李（Sun-Ok Lee）
美国阿肯色大学费耶特维尔分校食品科学系，邮编72704

**摘要**
叶黄素是一种黄质类胡萝卜素，以其抗氧化和促进健康的特性而闻名，尤其是在改善眼睛健康方面。然而，其有限的生物可利用性和较低的肠道吸收率可能限制了其生物活性。最近在递送系统方面的进展，包括3D食品打印（3DFOODP），有可能克服这些障碍。因此，本研究探讨了3DFOODP封装对3DFOODP封装叶黄素（3DL）的抗氧化活性、生物可利用性和细胞转运的影响。我们使用模拟胃肠道消化和Caco-2细胞比较了3DL与标准叶黄素（LS）以及叶黄素、淀粉和玉米醇溶蛋白的粗混合物（CM）。结果表明，3DL的叶黄素生物可利用性和抗氧化活性显著高于LS和CM。尽管3DL的细胞摄取量与LS和CM相当，但其肠道转运量显著更高（p < 0.05）。这些发现表明，3DFOOP可能是增强叶黄素递送和功能性食品应用的一种有前景的策略。

**1. 引言**
叶黄素（C40H56O2）是一种黄质类胡萝卜素，天然存在于绿叶蔬菜、黄色水果和蔬菜中，以及某些动物产品（如蛋黄）中（Bolla等人，2020；Chen & Yao，2017）。由于人体无法内源性合成叶黄素，因此只能通过饮食获取（Yao等人，2021）。叶黄素因其多种促进健康的特性而受到认可，包括抗氧化、抗炎和免疫调节作用，据报道对眼睛健康、认知功能、心血管保护以及血管生成和突变调节有益（Ahn & Kim，2021；Arshad等人，2025；Koushan等人，2013）。值得注意的是，叶黄素及其异构体玉米黄质是唯一能够穿过血-视网膜和血-脑屏障的类胡萝卜素，这对黄斑色素形成和预防年龄相关性黄斑变性至关重要，因为它们可以过滤蓝光并中和氧化应激（Arab Firozjae等人，2024；Dhas & Mehta，2020；Stringham等人，2019）。然而，叶黄素在摄入后发挥其生物活性的程度取决于其生物利用度（Ochoa Becerra等人，2020；Sy等人，2012）。生物利用度是指从基质中释放出来的生物活性化合物被吸收、分布、代谢并可用于生理作用的比例（Ozturk等人，2015）。尽管叶黄素具有诸多健康益处，但由于其亲脂性、水溶性差以及在光照、高温、氧气和不同肠道pH值下的化学不稳定性，其生物利用度受到限制，这些因素会促进氧化降解、顺反异构化及活性丧失（Arunkumar等人，2013；Chen & Yao，2017；Feng等人，2017）。此外，高结晶度（Ahmadzadeh等人，2023）、食物基质和加工条件也进一步限制了其生物利用度。

叶黄素的C40异戊二烯结构使其在肠道环境中容易聚集，只有少量能够溶解并被吸收，这一过程受到食物基质组成的显著影响（Ahn & Kim，2021；Arunkumar等人，2013）。使用稳定同位素示踪剂的临床研究表明，叶黄素的吸收效率从羽衣甘蓝的3.6%到混合蔬菜的38%不等，这反映了食物基质和个体差异对叶黄素吸收的显著影响（Lienau等人，2003；Novotny等人，2005）。生物可利用度是指消化后从基质中释放出来并融入混合胶束中的叶黄素部分，它决定了哪些叶黄素可以在肠道中被细胞摄取（Han等人，2024；Oduro-Obeng等人，2024；Yang等人，2018；Yao等人，2021）。为了在受控条件下模拟这一肠道吸收过程，广泛使用Caco-2细胞单层作为体外系统，该系统能够复制关键的肠细胞特征，包括膜转运蛋白、B型I类清除受体（SR-BI）、簇决定因子-36（CD36）和Niemann-Pick C1样1蛋白（NPC1L1），这些成分介导类胡萝卜素的摄取（During & Harrison，2007；Mantovani等人，2022；Murador等人，2021；Shwetha等人，2022；Sun等人，2008；Yang等人，2018）。因此，将体外消化与Caco-2细胞单层结合使用，常用于估计肠道吸收潜力而非真正的系统生物利用度（Maares & Haase，2020）。

为了解决这些问题，人们探索了许多封装和递送系统，以保护叶黄素免受降解、提高其溶解度、调节释放曲线，并最终增强其吸收潜力（Ahmadzadeh等人，2023；Arshad等人，2025）。传统的封装方法如喷雾干燥、冷冻干燥、挤出和复合共凝聚存在颗粒大小小、可扩展性有限、产量低和能耗高的缺点（Ahmadzadeh等人，2023；álvarez-Henao等人，2018；Nedovic等人，2011；Qv等人，2011）。尽管新兴技术如基于脂质的递送系统（脂质体、固体脂质纳米颗粒、纳米结构脂质载体）（Liu等人，2021；Mitri等人，2011；Shanmugam等人，2011；Shu等人，2023；Ueno等人，2023），以及乳液、纳米颗粒和蛋白质-多糖复合物（Leng等人，2022；Yan等人，2020）在叶黄素封装方面具有潜力，但它们仍存在缺陷，如脂质氧化、对温度和pH值的敏感性（Ahmadzadeh等人，2023；Ubeyitogullari等人，2022）。3D食品打印（3DFOODP）是一种新兴技术，用于食品工业中定制化、结构化食品的制造，并正在探索其在个性化营养和功能性食品设计中的应用。它提供了一种有前景的方法，通过高精度地将生物活性化合物（BCs）纳入复杂的三维基质中，克服传统封装方法的不足（Ahmadzadeh等人，2023；Meigui等人，2025）。虽然3DFOODP目前主要处于研究和试点阶段，但它已经引起了越来越多的监管关注，并已在某些商业应用中得到采用，包括糖果、临床营养和个人化食品制造（Derossi等人，2018；Escalante-Aburto等人，2021；Samota等人，2025）。从法律角度来看，3D打印食品应被视为新型食品（Baiano，2022）。尽管目前尚无统一的3D食品打印法律框架，但3D打印食品预计应符合现有的食品安全和标签法规，特别是关于食品级材料的使用（Baharuddin等人，2023；Samota等人，2025）。3D打印的关键优势在于其能够创建具有可控孔隙率和表面积的复杂几何结构和内部结构，据报道这些结构可以改善物理化学稳定性并调节封装生物活性化合物在胃肠道条件下的释放（Ahmadzadeh等人，2025；Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024；Meigui等人，2025）。已有研究报道了3DFOODP成功封装生物活性化合物的案例，例如Ahmadzadeh和Ubeyitogullari（2023）的研究表明，在淀粉-乙基纤维素凝胶中同轴3D打印叶黄素可提高其稳定性。值得注意的是，3D打印不仅可作为封装机制本身使用，还可以作为预封装生物活性化合物的递送平台，将其纳入功能性基质中。例如，在3D打印的油凝胶和水凝胶中共同递送姜黄素和白藜芦醇可以提高它们的生物可利用性和稳定性，其中油凝胶系统提供了封装作用（Kavimughil等人，2022；Leena等人，2022）。因此，3D打印封装不仅在加工、储存和胃肠道传输过程中保护生物活性化合物，还通过逐层添加创建了结构复杂的基质，为脂溶性生物活性化合物（如叶黄素）的递送提供了有前景的平台（Ahmadzadeh等人，2023；Meigui等人，2025）。

Ahmadzadeh和Ubeyitogullari（2024）的先前研究表明，同轴3D打印在淀粉/玉米醇溶蛋白凝胶中封装叶黄素有效，提高了其储存稳定性和生物可利用性。然而，这些改进的生物学相关性尚未通过生理模型进行验证。因此，本研究旨在通过使用Caco-2细胞单层作为人体肠道屏障的模型，评估3DFOODP封装叶黄素的生物可利用性、抗氧化潜力、肠道细胞摄取和转运，以验证该封装系统的功能优势。3DFOODP封装的叶黄素（3DL）直接与标准叶黄素（LS）和叶黄素与封装材料（淀粉+40%玉米醇溶蛋白）的粗混合物（CM）进行了比较。

**2. 材料与方法**
2.1 **材料**
高直链淀粉玉米淀粉（直链淀粉含量72%）从Ingredion（IL，美国）购买。玉米醇溶蛋白、猪胰酶和猪胆汁提取物来自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。标准叶黄素（≥98%）从Cayman Chemicals（密歇根州安娜堡，美国）获得。淀粉酶（活性为165,000细菌淀粉酶单位/克）从MP Biomedicals（俄亥俄州索伦，美国）购买。QuantiChrom? FRAP检测试剂盒来自BioAssay Systems（加利福尼亚州海沃德，美国）。用于封装的叶黄素、荧光异硫氰酸酯（FITC）、2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）、Trolox标准品和4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）以及其他细胞培养试剂均从Thermo Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）购买。
2.2 **3DFOODP封装叶黄素的制备**
3D食品打印（3DFOODP）封装方法按照我们之前的研究进行（Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024）。3DFOODP封装的叶黄素样品使用Allevi 2 Bioprinter（宾夕法尼亚州，美国）以螺旋立方体形式3D打印（封装在含40%玉米醇溶蛋白的基质中，打印速度为10毫米/秒），采用同轴喷嘴设置。具体细节见其他文献（Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024）。然后将3DFOODP封装的叶黄素（3DL）与标准叶黄素（LS）和叶黄素与封装材料（淀粉+40%玉米醇溶蛋白）的粗混合物（CM）进行比较。
2.3 **体外模拟消化**
体外消化按照（Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024；Brodkorb等人，2019；Minekus等人，2014）的方法进行，但作了一些修改。模拟唾液液（SSF）、模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）使用KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2(H2O)6和(NH4)2CO3、CaCl2(H2O)2的储备溶液制备，并维持在37°C。LS（标准叶黄素粉末）和CM（未打印的淀粉-玉米醇溶蛋白-叶黄素粉末）以粉末形式使用，类似于冷冻干燥的3DL样品。对于每次消化重复实验，称取每种配方中相当于0.2毫克叶黄素的量，并直接分散到模拟口腔相中（不含有机溶剂）。样品充分水化并混合后，再进行胃相和肠相处理。
0.5克3DFOODP-叶黄素（3DL）和对照粉末（LS和CM，每种调整至含0.2毫克叶黄素）分散在Milli-Q（MQ）水中，得到5克口服剂量。开始口腔相时，向其中加入3.5毫升SSF和25微升0.3摩尔/毫升的α-淀粉酶溶液（在SSF中），最终浓度为75微摩尔/毫升。加入MQ水使最终体积比为1:1（v/v），然后调整pH至7。混合物在37°C下以150转/分钟的转速在摇摆培养箱中振荡2分钟。对于胃相，向口腔相中加入8毫升SGF、1.6毫升猪胰酶溶液（最终活性为2000微摩尔/毫升）和5微升0.3摩尔/毫升的CaCl2。用1摩尔/毫升的HCl调整pH至3.0，然后加入MQ水至最终体积为20毫升，实现1:1（v/v）的样本与胃液比例。在37°C下以150转/分钟的转速在摇摆培养箱中振荡2小时。对于肠相，向胃相中加入8.5毫升SIF和5毫升胰酶溶液，使最终胰蛋白酶活性为800微摩尔/毫升。然后加入新鲜制备的胆汁溶液（2.5毫升，160毫摩尔），达到最终胆盐浓度为10毫摩尔，以及40微升0.3摩尔/毫升的CaCl2。根据需要用1摩尔/毫升的NaOH或HCl调整pH至7.0，然后加入MQ水至最终体积为40毫升。混合物在37°C下以150转/分钟的转速在摇摆培养箱中振荡2小时。

消化过程通过将烧瓶迅速浸入冰浴中并调整pH来终止。同时，在相同条件下消化对照样品LS和CM（浓度与3DL中的叶黄素含量相同，均为0.2毫克）。
消化完成后，将消化物在4°C下使用Sorvall X4R Pro-MD冷冻离心机（Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）以10,000 xg离心45分钟，收集上清液并通过0.22微米醋酸纤维素膜过滤，以获得胶束部分。该分离出的胶束部分储存在-80°C下，用于量化可生物利用的部分。该胶束部分随后用于所有细胞培养实验，以评估叶黄素的细胞摄取和从顶侧到基底侧的转运。叶黄素的提取、定量和生物利用度

叶黄素从原始未消化样品和胶束中提取。3DL、CM和LS的胶束部分使用丙酮：乙醇：己烷（1:1:3，v/v）混合物提取，涡旋2分钟后在20°C下以1000×g离心10分钟。整个提取过程在暗红色光下进行。后续提取使用纯己烷进行，直到黄色消失。尽管没有使用内标物，但所有样品都在相同的条件下提取以确保回收率的一致性。己烷层被收集起来，并在氮气下蒸发。最终样品用100%甲醇复溶并通过0.45 μm过滤器过滤。叶黄素浓度通过HPLC-PDA（Waters，美国）测定，使用Waters反相C18（4.6×250 mm，5 μm）柱。流动相由乙腈和甲醇（90:10，v/v）混合物组成，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL。柱温保持在25°C。叶黄素在446 nm处被检测到。生物利用度计算为胶束部分中的叶黄素浓度（C_micelles）与消化开始时的初始叶黄素浓度（C_initial）的比值，以百分比表示。

(1) 生物利用度% = (C_micelles / C_initial) × 100

3DFOODP包封的叶黄素在消化前后的抗氧化能力

使用1 mg/mL的未消化样品和消化后胶束部分的提取物测定抗氧化能力（DPPH和FRAP），以确保消化前后的测量结果可以直接比较。

对于DPPH自由基清除活性，将样品（10 μL）与140 μL的0.1 mM DPPH甲醇溶液混合，并在室温下避光孵育30分钟。使用微孔板读取器（Synergy HT多模式微孔板读取器，Bio Tek，Winooski，VT，美国）在517 nm处测量吸光度。数据以Trolox当量（TE）/g表示，使用Trolox标准曲线的清除效果（Gu等人，2023年）。

样品的铁还原抗氧化潜力（FRAP）使用QuantiChrom? FRAP测定试剂盒（BioAssay Systems，Hayward，CA，美国）进行评估。样品与工作试剂混合并在室温下孵育40分钟。在590 nm处测量吸光度。数据以样品中的亚铁（Fe2+）当量表示。

2.6. 细胞培养和细胞活力

从美国典型培养集（ATCC，Manassas，VA，美国）获取Caco-2（ATCC? HTB-37?）人肠上皮细胞，以确定细胞活力、LS、CM和3DL的体外细胞摄取和转运。Caco-2细胞在含有1%非必需氨基酸（NEAA）、10% FBS和1%抗生素抗真菌剂的DMEM中培养。细胞在37°C、5% CO2（VWR?水套CO2培养箱，VWR International，Radnor，PA，美国）和95%相对湿度下生长，并在80–90%汇合度时收获。所有后续的细胞培养实验都使用模拟胃肠道消化和离心后的LS、CM和3DL样品的胶束部分。

根据制造商的指南，使用CellTiter 96? AQueous One Solution细胞增殖测试（MTS测定）（Promega Co.，Madison，WI，美国）测量LS、CM和3DL胶束对细胞活力的影响。Caco-2细胞以每孔1.0×10^4细胞的密度接种在96孔板中，并在37°C和5% CO2下孵育24小时。细胞用消化后获得的胶束部分的不同稀释度（2倍、4倍和6倍稀释）处理过夜。16小时后，用新鲜的细胞培养基替换细胞上清液，并加入20 μL MTS试剂。孵育1小时后，使用微孔板读取器在490 nm处测量吸光度。细胞活力定义为相对于对照细胞的存活细胞比例。

2.7. Caco-2细胞中对叶黄素的摄取和分泌

Caco-2细胞以每孔2.0×10^5细胞的密度接种在12孔板的transwell插片（聚碳酸酯膜，内径12 mm，孔径0.4 μm，Corning Inc.，Kennebunk，ME，美国）上，并在37°C和5% CO2下孵育。使用第30代到第39代的细胞进行后续实验。实验前，Caco-2细胞分化21天以形成完整的单层，并使用Millicell-ERS电压-欧姆计（MD Millipore Corporation，Billerica，MA，美国）通过跨上皮电阻（TEER）测量确认单层完整性。TEER值大于400 Ω cm^2的Caco-2单层用于后续的转运和细胞摄取实验。分化的单层用PBS洗涤两次，并在顶侧和基底侧腔室中替换为无血清培养基。细胞在37°C和5% CO2下孵育1小时以促进叶黄素的摄取和转运（根据细胞活力实验的结果，随后使用了4倍稀释度）。为了确定细胞摄取，Caco-2单层在顶侧用0.5 mL的胶束部分（在无血清DMEM中稀释4倍）孵育12小时，温度为37°C，CO2浓度为5%。孵育时间基于初步实验选择，以测量最大吸收率并获得足够的叶黄素进行准确测量。孵育后，用冷PBS冲洗膜三次以去除未内化的叶黄素，然后将细胞收集在1 mL PBS中。通过冰上超声处理（100 W，10分钟）制备细胞裂解物，然后在4°C下以10,000×g离心20分钟。收集上清液用于HPLC测定叶黄素的定量。

对于转运（分泌）实验，将0.5 mL的LS、CM和3DL胶束加入顶侧（AP）腔室，而基底侧（BL）腔室提供1.0 mL的无血清培养基。细胞在37°C和5% CO2下孵育。在0、3、6、9、12小时时从BL收集500 μL的样本，并补充相同量的新鲜无血清培养基。12小时后，收集BL中的剩余样本。这些样本在-80°C下储存，直到进一步分析。使用HPLC确定通过细胞单层的叶黄素量（相对于初始叶黄素量）。转运效率（%转运）计算为每个采样时间点（0、3、6、9和12小时）从顶侧转运到基底侧的叶黄素百分比，而总转运（%）计算为整个12小时孵育期间在基底侧回收的叶黄素总量，同时考虑每个采样间隔的体积校正。叶黄素跨膜的运动速率，也称为表观渗透系数（Papp），根据公式（2）计算。

(2) Papp = ΔQ/Δt × A × C0，其中ΔQ/Δt是叶黄素跨屏障的稳态通量（μg/s），A是插片的表面积（cm^2），C0是AP侧的初始叶黄素浓度（μg/mL）。单层上的转运通量根据转运到BL腔室的叶黄素累积量的斜率计算。

2.8. 使用共聚焦激光扫描显微镜的定性细胞摄取研究

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查FITC标记的LS、CM和3DL的定性细胞摄取。细胞以1×10^5的密度接种在8孔Millicell EZ slide单元（PEZGS0816；Millipore，Burlington，MA，美国）中，并在37°C下孵育48小时至汇合。样品按照Bolla等人（2020年）描述的方法进行FITC标记。在4°C下避光条件下，使用1 mg/mL的FITC在DMSO中标记样品12小时。反应用1 mL的50 mM NH4Cl淬灭，并用Spectra透析管（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）透析12小时以去除未结合的FITC。然后通过0.2 μm醋酸纤维素过滤器过滤细胞。随后，用PBS洗涤细胞，并用10 μL的对照（DMSO）、FITC-LS、FITC-CM和FITC-3DL处理。处理组分别孵育6小时和12小时。在每个时间间隔，丢弃生长培养基，并用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。然后用4%缓冲的甲醛溶液固定细胞，并在37°C下孵育20分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞三次，并用DAPI在黑暗中染色细胞核15分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 900，Jena，德国）在495/519 nm的激发/发射波长下检查细胞的绿色荧光（FITC）和在358/461 nm的激发/发射波长下检查蓝色荧光（DAPI）。

2.9. 统计分析

所有统计分析使用JMP Pro 18（JMP Statistical Discovery LLC，Cary，NC，美国）进行。生物利用度和抗氧化测定的数据以平均值±标准差（SD）报告，细胞培养实验的数据以平均值±标准误差（SEM）报告（n = 3个独立生物重复）。单因素ANOVA用于单因素实验（生物利用度、抗氧化活性、细胞摄取），双因素ANOVA用于时间依赖性转运实验；Tukey的post hoc检验用于成对比较，Dunnett的检验用于比较细胞活力实验中的处理组与对照组（p < 0.05）。使用Shapiro–Wilk和Levene的检验评估正态性和方差同质性；当这些假设被违反时，使用非参数替代方法（Kruskal–Wallis和适当的post hoc检验）进行分析。

3. 结果

3.1. 叶黄素的体外生物利用度

生物利用度通过模拟消化后释放的总量确定（Gomes等人，2019年）。溶解在肠道消化物的混合胶束中的部分通常称为叶黄素的生物利用度（Burgos等人，2013年；Ochoa Becerra等人，2020年）。本研究通过测量模拟消化后混合胶束中的叶黄素量来评估3D包封叶黄素（3DL）、粗混合物（CM）和叶黄素标准品（LS）的体外生物利用度（图1）。

不同配方之间的叶黄素生物利用度有显著差异（p < 0.05），3DL的胶束相叶黄素回收率最高，为20.16 ± 2.5%，其次是LS的7.84 ± 0.8%和CM的7.14 ± 0.4%（p < 0.05），表明3DFOODP包封具有更高的生物利用度（图1）。

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图1. 叶黄素标准品（LS）、粗混合物（CM）和3DFOODP包封叶黄素（3DL）的体外生物利用度。条形图表示平均值±标准差（n = 3）。不同字母表示在每组内样本之间存在显著差异（p < 0.05）。

3.2. 抗氧化活性

在体外模拟消化前后，测定3DFOODP包封的（3DL）和对照叶黄素样品（LS、CM）的抗氧化活性（图2）。

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图2. 模拟体外消化对（a）DPPH自由基清除活性和（b）铁还原抗氧化能力（FRAP）的影响，比较3DL与LS和CM。条形图表示平均值±标准差（n = 9）。不同字母表示样本之间存在显著差异（p < 0.05）。LS = 叶黄素标准品；CM = 粗混合物；3DL = 3DFOODP包封叶黄素。

消化前，3DL、CM和LS样品的DPPH自由基清除活性没有显著差异，表明包封不影响叶黄素的初始活性。消化后，所有样品的清除活性显著降低了71–83.5%。然而，消化后3DL的DPPH活性显著高于CM（290.5 ± 57.8 μM TE/g）和LS（309.6 μM ± 38.9 TE/g）（图2a）。同样，初始FRAP值在p < 0.05时相当，但消化后3DL保持了显著更高的还原能力（202.0 ± 1.8 μmol Fe2+/g），而LS（125.9 ± 4.2 μmol Fe2+/g）和CM（100.7 ± 6.9 μmol Fe2+/g）（图2b），表明3DFOODP包封增强了氧化还原活性。

3.3. 细胞活力

在用3DL、LS和CM胶束处理24小时后，评估Caco-2细胞的活力。结果显示不同稀释度之间存在显著差异（p < 0.05），但在相同稀释度下三种样品类型（3DL、LS、CM胶束）之间没有显著差异，表明3D打印包封过程和组成生物材料均未引入细胞毒性（图3）。

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图3. 用LS、CM和3DL胶束处理24小时的Caco-2细胞的活力。数据表示为平均值±标准误差（n = 4）。带有*的均值表示样本与对照组有显著差异（p < 0.05）。LS = 叶黄素标准品；CM = 粗混合物；3DL = 3DFOODP包封叶黄素。

在X2稀释度下，细胞活力与对照组有显著差异（p < 0.05），因此被归类为细胞毒性。在X4和X6稀释度下，所有三种样本的细胞活力与对照组没有显著差异，确认这些浓度无细胞毒性。选择X4稀释度进行所有后续的转运和细胞摄取研究，因为它是确认无细胞毒性的最低浓度。

3.4.**体外细胞摄取和转运效率**

本研究使用了跨孔细胞单层模型来评估3DL中的叶黄素与LS和CM的吸收情况。表1显示，在这种稀释度下，3DL、LS和CM之间的叶黄素细胞摄取量没有统计学上的显著差异（p < 0.05），表明在测试条件下各配方之间的摄取效率相当。

**表1.** 在37°C下孵育12小时后，Caco-2细胞中对样品（LS、CM和3DL）中叶黄素的体外细胞摄取量和总转运百分比。

| 样品 | 细胞摄取量（%） | 总转运量（%） |
| --- | --- | --- |
| 叶黄素标准品（LS） | 11.9 ± 3.0a | 28.7 ± 4.8a |
| 粗混合物（CM） | 12.5 ± 1.6a | 26.6 ± 1.6a |
| 3D包封叶黄素（3DL） | 14.6 ± 2.4a | 60.4 ± 0.9b |

**图4** 显示了叶黄素样品的转运时间依赖性。3DL表现出更优且更早的转运特性，在3小时时已有2.0 ± 1.3%的转运量，而LS和CM在此时间点没有转运。6小时时，3DL的转运量显著高于CM（7.4 ± 0.9%）和LS（1.7 ± 0.7%）。9小时时，3DL的转运量达到峰值（28.2 ± 3.1%），是LS（13.6 ± 4.5%）的2.1倍，是CM（12.6 ± 1.8%）的2.2倍。到12小时时，3DL的转运量稳定在23.1 ± 1.3%，LS为14.7 ± 1.9%，CM为11.5 ± 1.0%。总体而言，3DL通过3DFOODP包封在Caco-2单层中的总转运量显著高于LS（28.7 ± 4.8%）和CM（26.6 ± 1.6%）（表1）。

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**图4.** 叶黄素在Caco-2细胞模型中的转运时间效应关系。数据以平均值±SEM表示（n = 3）。不同大写字母（A-C）表示处理组之间的显著差异，不同小写字母（a-c）表示在p < 0.05条件下不同时间点的显著差异。

**3.5. 表观渗透性（Papp）**

图5显示了3DL与LS和CM的表观渗透系数（Papp）的比较。3DL的渗透系数（1.2 × 10^-5 cm/s）是LS（5.9 × 10^-6 cm/s）的2.1倍，也是CM（5.4 × 10^-6 cm/s）的2.3倍，这支持了3DFOODP包封显著提高了肠道转运速率的观点。

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**图5.** 叶黄素标准品（LS）、叶黄素粗混合物（CM）以及3DFOODP包封叶黄素（3DL）的表观渗透系数（Papp）。数据以平均值±SEM表示（n = 3）。不同字母表示具有显著差异（p < 0.05）。

**3.6. 定性细胞摄取**

通过共聚焦显微镜分析了FITC标记样品（LS、CM和3DL）的体外细胞摄取情况。图6a和b分别显示了6小时和12小时时细胞对FITC标记样品的摄取情况。所有组中，由FITC产生的绿色荧光表示叶黄素，而用DAPI染色的细胞核则显示为蓝色荧光。6小时和12小时时，用FITC标记的3DL处理的细胞荧光强度高于LS和CM。

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**图6.** Caco-2细胞与FITC标记的LS、CM、3DL胶束共孵育6小时（a）和12小时（b）的共聚焦激光显微镜图像，展示了叶黄素在Caco-2细胞内的内化过程。DAPI用作核标记物。FITC（绿色）：荧光异硫氰酸酯；DAPI（蓝色）：4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。LS = 叶黄素标准品；CM = 粗混合物；3DL = 3DFOODP包封叶黄素。（有关图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网络版本。）数据以平均值±SEM表示（n = 3）。不同字母表示具有显著差异（p < 0.05）。

**4. 讨论**

3D打印的高表面积和多孔结构会影响扩散和释放。先前的研究表明，具有更高内部孔隙率的3D打印结构可以影响扩散并调节包封化合物的释放动力学（Zhang等人，2021年），并且3D打印的水凝胶和油凝胶可以通过控制层叠和生物材料之间的网络形成来改变消化过程中的释放行为（Kavimughil等人，2022年）。在我们的研究中，3DFOODP包封通过将更多的叶黄素输送到肠道胶束相中，从而提高了叶黄素的生物可利用性，这在相同的消化条件下优于LS和CM。体外消化模型通常根据消化后叶黄素在肠道胶束相中的比例来估计其生物可利用性，这代表了可能被肠道吸收的部分（Carbonell-Capella等人，2014年；Chacón-Ordó?ez等人，2019年；Reboul，2019年）。在肠道条件下，胆盐介导的胶束化是脂溶性化合物（如叶黄素）被纳入混合胶束的主要机制，并被认为是可生物利用的（Lu等人，2020年；Luo等人，2022年；Salvia-Trujillo & McClements，2016年；Song等人，2024年）。尽管在类似的多糖基包封系统（如壳聚糖-海藻酸盐包封系统）中也观察到了碱性触发的基质降解（Khatibi等人，2024年），但本研究中没有直接测量这一机制，这可能需要在后续研究中考虑。

我们的生物可利用性低于Zhao等人（2025年）报告的3D打印叶黄素乳液凝胶在豆油中的43.9%，与Luo等人（2022年）报告的叶黄素在钙海藻酸盐水凝胶中的21-30%相似，但高于微流控脂质基胶囊的结果（Yao等人，2021年）。与我们的淀粉-玉米醇溶蛋白基质相比，富含脂质的基质（如豆油）实现了更高的生物可利用性，这与已知膳食脂质在促进叶黄素纳入混合胶束中的作用一致（Kotake-Nara & Nagao，2012年；Mashurabad等人，2017年）。尽管缺乏富含脂质的载体相，3DL的生物可利用性仍分别比LS和CM高出2.6倍和2.8倍。这表明通过3D打印对递送系统的结构修改可以显著提高叶黄素的吸收可用性。与我们的先前研究（Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024年）相比，3DFOODP包封叶黄素的生物可利用性从9.8%提高到了20.1%，未包封叶黄素从1.5%提高到了7.8%。这些差异可能是由于消化方案的不同（包括更长的口服阶段和不同的酶浓度），以及生物可利用部分的分离方式（更高的离心力）造成的。3DL的生物可利用性提高表明，3DFOODP包封在水凝胶基质中影响了叶黄素与消化条件的相互作用，包括pH变化和酶活性，这可能增强了其纳入混合胶束的能力。这与钠藻酸盐类胡萝卜素微粒的保护作用一致（Trif等人，2019年），以及水凝胶包封系统通过胶束溶解和胃肠道保护提高类胡萝卜素生物可利用性的能力（Luo等人，2022年；Steiner等人，2018年）。淀粉-玉米醇溶蛋白基质可能对这些效果有所贡献，因为玉米醇溶蛋白聚集体可以在胃肠道环境中抵抗酶降解，从而保护叶黄素（Han等人，2024年；Jiao等人，2020年）。为了确定生物可利用性的提高是由于胶束化的增强、降解的减少还是两者兼有，需要对消化过程中叶黄素进行完整的质量平衡分析，而这在本研究中并未进行。此外，未确定胶束 fraction的粒径和ζ电位，这限制了胶体结构与观察到的生物可利用性差异之间的直接关联。

在抗氧化活性方面，我们观察到消化后自由基清除活性比铁还原能力损失更多。这是由于DPPH（评估抗氧化剂捕获自由基的能力）和FRAP（测量铁还原）测定方法采用的不同机制（Borges等人，2019年）。虽然所有样品的模拟消化过程都显示出抗氧化活性总体下降的趋势，这与生物活性化合物（如类胡萝卜素）在恶劣的消化道条件下容易降解的发现一致（Jiao等人，2020年；Luiza Koop等人，2022年；Scrob等人，2019年；Wanyo等人，2024年），但3DL在消化后的抗氧化活性显著高于LS和CM。这表明3DFOODP包封在淀粉-玉米醇溶蛋白水凝胶基质中提供了更好的保护，并在胃肠道传输过程中保持了叶黄素的抗氧化功能。在研究案例蛋白/寡壳聚糖纳米复合物用于叶黄素递送时也报告了抗氧化潜力的下降，以及模拟消化后叶黄素的类似减少，这些减少归因于消化条件、化合物降解和转化为新的代谢物（Wang等人，2024年；Yusof等人，2025年）。

叶黄素的脂溶性使其在消化过程中容易发生异构化和氧化，从而对其抗氧化能力产生负面影响（Ochoa Becerra等人，2020年）。酸性的胃环境还会形成叶黄素的脱水产物，如3-羟基-3′,4′-二脱氢-β-γ-胡萝卜素和3-羟基-2′,3′-二脱氢-β-ε-胡萝卜素，这些产物的抗氧化性能降低（Kotake-Nara & Nagao，2011年）。将疏水性生物活性化合物（如叶黄素）包封到结构化基质中可以提高其在消化过程中的稳定性，并促进上皮细胞的吸收（Li等人，2020年；Yao等人，2021年；Zhao, Liu等人，2018年）。先前关于叶黄素的各种包封系统的研究通常报告了摄取量的提高，尤其是当基质增强了胶束形成时。Q. Zhao等人（2018年）发现使用叶黄素-环糊精递送系统（lutein-CD-MCDS）的Caco-2摄取量比纯叶黄素高50-70倍，T. Zhao等人（2018年）观察到包封的叶黄素NaCas微粒在较高浓度下增加了摄取量，但在较低浓度下与叶黄素没有显著差异，表明存在浓度依赖性反应。同样，Li, Zhong和Kopec（2024年）发现，尽管在中链甘油三酯中的包封提高了酯化叶黄素的摄取量，但在标准叶黄素中没有显著差异。另一项研究发现，在4小时后，用壳聚糖包封的叶黄素与单独的叶黄素在Caco-2细胞中的摄取量没有差异，但在24小时后有显著差异（Shwetha等人，2022年）。

在本研究中，三种处理方法（3DL、LS和CM）之间的叶黄素摄取量没有显著差异（表1）。尽管结果表明我们的包封系统提高了叶黄素的生物可利用性，但细胞摄取受到多种因素的影响，包括叶黄素的异构构型（Chitchumroonchokchai等人，2004年；Yang等人，2018年，Yang等人，2019年）和膜转运蛋白的相互作用（Blank-Landeshammer等人，2022年；Reboul，2019年；Reboul等人，2005年）。此外，细胞内代谢、脂滴中的隔离、外排转运蛋白的活性（Guo等人，2024年；Reboul，2019年，Reboul，2023年）以及由于长时间孵育导致的饱和（Li等人，2024年）也影响叶黄素的细胞摄取，这可能部分解释了尽管生物可利用性存在差异，但摄取量没有显著差异的原因。

生物活性化合物在细胞摄取后的分泌在通过胃肠道的系统生物利用性中起着关键作用。叶黄素的分泌在Caco-2细胞单层模型中进行了测量，并表示为转运效率（Yang等人，2018年）。我们的研究表明，只有3DL在3小时时表现出可测量的转运，而LS和CM在早期时间点表现出延迟或无法检测到的转运（图4）。这与先前的观察结果一致，即叶黄素的转运在最初的4小时内延迟或无法检测到（Chitchumroonchokchai等人，2004年；Oduro-Obeng等人，2024年）。这表明3DP在从包封基质中更好地溶解叶黄素进入混合胶束方面优于LS和CM，从而提高了其潜在的顶端摄取和后续转运能力。

所有配方中叶黄素在Caco-2单层中的转运都呈现双相模式，在9小时达到峰值，然后在12小时略微下降，这可能是由于转运蛋白饱和所致。这种模式与β-胡萝卜素等类胡萝卜素在Caco-2模型中的转运蛋白饱和动力学一致，其中β-胡萝卜素向基底侧的分泌速率取决于转运蛋白的饱和度，从而导致分泌减少（Liu等人，2019年；Reboul，2013年）。这表明在这些实验条件下，叶黄素有一个最佳的吸收窗口，超过这个窗口后，转运蛋白介导的基底侧分泌成为限制因素。在整个时间过程中，3DL始终产生的基底侧叶黄素通量高于LS和CM，这可以归因于叶黄素从打印基质中更好地溶解到胆盐混合胶束中，这对于顶端摄取和后续转运是必要的（Ahmadzadeh & Ubeyitogullari，2024年；Focsan等人，2019年；Yang等人，2018年）。更好地溶解到混合胶束中增加了可供转运蛋白摄取的顶端叶黄素浓度，这与已知的结论一致，即叶黄素纳入改性多糖聚集体后其转运能力得到增强（Zhang等人，2024年）。此外，研究表明，有效的胶束化可以防止H-聚集，从而阻碍转运和吸收（Wang等人，2023年）。几项研究将叶黄素的肠道转运和摄取归因于被动扩散和由清除受体B类1型（SR-B1）、簇决定因子36（CD36）和Nieman-Pick C1 Like1（NPC1L1）转运蛋白介导的促进扩散（Blank-Landeshammer等人，2022年；Reboul等人，2005年；Yang等人，2018年）。尽管本研究未对此进行调查，但这些机制可能在转运效率中发挥了作用。

有趣的是，尽管各处理方法之间的细胞摄取水平相似，3DL表现出的总顶端到基底侧的转运量显著高于LS和CM。这表明，运输能力的增强可能并非归因于顶端内化的增加，而是由于类似肠细胞的细胞在吸收后的处理过程。这与已建立的类胡萝卜素运输模型一致，其中细胞内保留、膜吸附和基底侧外排效率决定了被吸收的类胡萝卜素中有多少能够到达基底侧（During等人，2002年；During和Harrison，2007年；Reboul等人，2005年）。3DFOODP基质可能会影响样品的胶束组成以及消化过程中产生的脂质环境，从而最终影响类胡萝卜素在细胞内的运输、结合到类似脂蛋白的颗粒（乳糜微粒）中，以及通过转运蛋白（如肠细胞中的ABCA1）的脂蛋白介导的出口机制（Kalungwana等人，2023年；Reboul，2013年，Reboul，2019年，Reboul，2023年；Shwetha等人，2022年）。因此，3DP可能改善了类胡萝卜素向类似脂蛋白颗粒的运输，并提高了其基底侧的运输和分泌效率，从而在不改变总吸收量的情况下提高了整体运输能力。表观渗透系数（Papp）是一个关键参数，反映了化合物穿透和通过肠上皮屏障的能力，其值大于1 × 10^-6 cm/s表示高渗透性（Artursson等人，2001年；Zhang等人，2024年）。本研究中的所有Papp值均超过1 × 10^-6 cm/s，表明屏障并未影响渗透性。我们的结果与其他3DP封装研究一致，例如在MCT油凝胶中的姜黄素和白藜芦醇，在3DFOODP处理后显示出渗透性的增加（Kavimughil等人，2022年）。3DL的较高表观渗透性也与之前报道的封装系统相当，这些系统显示出1-3倍的渗透性改善（Je等人，2017年；Luo等人，2024年；Tan等人，2021年；Zhang等人，2024年）。因此，这项研究表明，3D打印的淀粉-zein基质显著提高了类胡萝卜素的渗透性和运输能力。然而，仅物理组合壁材料而没有结构化的封装并没有改善渗透性，这一点从LS和CM在这些条件下的差异中可以看出（图5）。这一发现强调了基质结构和组成在优化类胡萝卜素递送中的重要性。

在本研究中，3DL相对于LS和CM具有更高的生物可利用性，导致胶束相中的类胡萝卜素浓度更高，从而在Caco-2单层细胞中建立了更陡峭的浓度梯度，推动了更大的基底侧通量。这与基于生物聚合物的封装系统能够改善疏水性化合物的溶解度、促进其与肠细胞顶端膜的相互作用并增强跨细胞运输的研究结果一致（Gómez-Guillén和Montero，2021年）。本研究中使用的淀粉/zein基质先前已被证明可以改善类胡萝卜素的稳定性和分散性（Ahmadzadeh和Ubeyitogullari，2024年）。据报道，zein的两亲性有助于稳定封装的疏水性化合物并提高其水溶性（Han等人，2024年），而淀粉则提供了结构完整性，并与消化条件下的调节释放曲线相关（Gheorghita等人，2024年；Lemos等人，2021年）。这些基质特性是否在当前研究中主动保护了类胡萝卜素免受消化过程中的降解尚未直接验证，这是一个重要的机制问题，需要未来的研究来解答。

对从3DL、CM和LS的胶束组分中提取的FITC标记类胡萝卜素进行共聚焦激光扫描显微镜观察，提供了Caco-2细胞内类胡萝卜素分布的空间可视化。从定性上看，与LS和CM相比，用3DL处理的Caco-2细胞显示出更高的绿色荧光强度，并且所有组别从6小时到12小时的荧光强度都在增加，这与逐渐的细胞内积累一致，而不是表面结合。尽管共聚焦显微镜观察到了这些定性差异，但定量细胞摄取测量并未显示出各制剂之间的显著差异。FITC标记过程中的化学修饰可能改变了类胡萝卜素与顶端转运蛋白的相互作用及其在细胞内的分配。除了检测灵敏度的差异外，由于共聚焦显微镜捕捉的是空间分布和相对强度而非绝对的细胞内类胡萝卜素质量，这些因素进一步解释了两种方法之间的差异。因此，共聚焦显微镜数据应被视为支持但非决定性的证据，表明类胡萝卜素的摄取有所增强，这些差异需要进一步的机制研究。

5. 结论

总体而言，本研究表明，在淀粉/zein复合基质（3DL）中3D打印类胡萝卜素可以提高其生物可利用性、抗氧化活性的保留以及跨Caco-2单层的跨上皮运输能力，优于未封装的类胡萝卜素标准品（LS）和物理混合物（CM）。尽管在各制剂之间未检测到细胞摄取的统计学显著差异，但这些差异可能反映了细胞内保留和膜吸附的差异，而不是各制剂之间的等效吸收。综合来看，这些发现表明3DFOODP提供的结构组织可能增强了类胡萝卜素的肠道递送，验证了3D打印的淀粉-zein复合系统作为高效类胡萝卜素递送系统的有效性，这可能是一种有前景的封装策略，有助于改善类胡萝卜素的生理递送。虽然体外消化-Caco-2模型为类胡萝卜素的生物可利用性、细胞摄取和肠道运输提供了宝贵的见解，但它并不能直接测量系统生物利用度，因此体内验证仍然是必要的。未来的工作应研究参与类胡萝卜素从3D打印基质中摄取的具体转运机制，并使用动物模型或人体干预研究来评估系统生物利用度。

作者贡献声明：
Oluwatobi Amusat：撰写——原始草稿，可视化，验证，方法学，研究，正式分析。
Safoura Ahmadzadeh：验证，方法学，研究。
Sorour Barekat：验证，方法学，研究。
Ali Ubeyitogullari：撰写——审阅与编辑，验证，监督，资源管理，项目管理，方法学，资金获取，概念化。
Sun-Ok Lee：撰写——审阅与编辑，验证，监督，资源管理，项目管理，方法学，资金获取，概念化。

伦理声明
本研究未涉及任何人类参与者或动物。所有实验均在体外使用已建立的细胞系和模拟消化模型进行。