对乙酰氨基酚会抑制Paracoccus denitrificans的反硝化作用：这与生物能量代谢的限制及细胞周质中的电子传递障碍有关

《Journal of Hazardous Materials》：Acetaminophen inhibits denitrification in Paracoccus denitrificans: Bioenergetic constraint and periplasmic electron transfer impairment

　　

董志辉|张宇|卢静|朱毅帆|卢成军|杨健|张正哲|金仁村

中国浙江省湿地智能监测与生态修复重点实验室，杭州师范大学工程学院，杭州310018

摘要

对乙酰氨基酚（APAP）经常在市政废水中被检测到，但其对异养反硝化作用的影响尚未得到充分研究。本研究将Paracoccus denitrificans暴露于0.5和7.5 ppm的APAP中，分别代表较低和较高的废水浓度水平。在0.5 ppm浓度下几乎没有观察到变化，而在7.5 ppm浓度下，反硝化作用显著受到抑制，表现为NO₂^-积累增加、N₂O排放量上升以及细菌生长速度减缓。细胞内ATP含量下降了12.5%，ΔΨ和ΔpH也有所下降，表明质子动力平衡受到破坏。与膜相关的电子传递系统没有显著变化，但胞质中的反硝化电子传递过程受到强烈抑制。对接分析显示APAP位于ATP酶的质子通道区域附近，ATP酶活性的变化与细胞能量代谢受损一致。这些结果表明，APAP主要通过影响生物能量代谢和胞质电子传递来抑制异养反硝化作用。本研究为评估药物残留物如何削弱废水处理系统中的生物脱氮过程提供了机制基础。

引言

对乙酰氨基酚（APAP），又称扑热息痛或泰诺，是全球使用最广泛的止痛药和退烧药之一[1]。COVID-19大流行后，其消费量显著增加，在某些地区年使用量已达数千吨[1]、[2]、[3]。同时，APAP在市政污水处理系统中也越来越频繁被检测到[4]，浓度范围从低于0.1 ppb到超过66.4 ppm不等[5]、[6]。由于其持续输入、高溶解度以及生物毒性[7]、[8]，APAP已成为市政污水处理系统中需要关注的化学物质。

以往的研究主要集中在APAP在硝化过程中的行为。在生物脱氮系统中，APAP在有氧条件下可以很容易被降解。然而，也有报道称APAP会对污泥硝化过程产生负面影响，尤其是对亚硝酸盐氧化[9]、[10]、[11]。APAP可以被异养微生物吸收，乙酰辅酶A C-乙酰转移酶和二氢脂酰脱氢酶已被确定为与其生物降解相关的关键酶[12]。除了作为碳源外，APAP还可以被硝化细菌产生的活性氮物种（如•NO和游离亚硝酸）氧化为过氧亚硝酸盐[13]、[14]。尽管如此，APAP的去除率并不总是100%，据报道去除效率在14.3%到100%之间[5]，这表明残留的APAP可能会进入下游的反硝化单元[10]、[15]、[16]、[17]。

反硝化是市政废水中生物脱氮的另一个关键过程。如果这一过程不完全，必然会导致中间产物如NO₂^-和N₂O的积累。N₂O尤其值得关注，因为它是一种强效的温室气体，其全球变暖潜能是CO₂的298倍[18]。与硝化过程相比，关于APAP在反硝化过程中的影响了解较少，现有证据也有限且有时不一致。在一个C/N比为1.5的膜反应器中，0.5 ppm的APAP对反硝化污泥中的硝酸盐去除或亚硝酸盐积累影响很小，仅观察到主要反硝化菌株Zoogloea ZP7的相对丰度略有下降[19]。相比之下，在Zoogloea ZP7纯培养液中，0.25 ppm的APAP在低碳条件（C/N = 2）下就能通过抑制膜电子传递系统活性来抑制反硝化作用，并同时抑制细菌生长[20]。这些观察结果表明，在复杂的污泥系统中，APAP对反硝化微生物的影响可能被掩盖。更重要的是，目前尚不清楚APAP是如何干扰反硝化相关的电子传递以及为什么细菌增殖会同时受到抑制。因此，需要纯培养系统来直接验证APAP对反硝化细菌生长和代谢的干扰机制。

反硝化本质上是一个由电子传递驱动的厌氧呼吸过程。基于此，我们假设APAP引起的抑制与细胞生物能量代谢的紊乱有关。为了验证这一假设，使用了模型反硝化菌Paracoccus denitrificans（ATCC 19367）进行了机制实验，该菌种在污水处理厂中广泛存在[21]、[22]、[23]。选择了0.5和7.5 ppm两个处理浓度来模拟废水中的暴露情况。首先评估了反硝化性能、中间产物的积累和细菌增殖情况，然后检测了细胞膜完整性、关键反硝化酶活性、细胞能量状态、质子动力以及电子传递特性。此外，还利用分子对接技术探讨了APAP与ATP酶之间的潜在抑制作用，并通过转录组分析识别与能量代谢和反硝化相关的转录反应。从生物能量学的角度出发，本研究旨在阐明APAP诱导反硝化抑制的机制及其对反硝化细菌的适应性响应，进一步了解药物污染对生物脱氮过程的潜在风险。

节选内容

化学物质和细菌培养及批次实验设计

对乙酰氨基酚（APAP，C₈H₉NO₂，CAS 103–90–2）由中国药化试剂有限公司提供。通过将0.125 g APAP溶解在5 mL无水乙醇中制备了储备溶液。P. denitrificans（ATCC 19367）从美国典型培养物保藏中心获得。该菌株在灭菌后的LB培养基（121°C，20分钟）中恢复生长至对数期。新鲜细胞在4°C下以6000 rpm离心5分钟，然后用灭菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS，12 mM，pH 7.4）洗涤3次。

APAP对反硝化性能的影响

通过监测TN去除效率（TNRE）、NO₃^-和NO₂^-的动态（分别表示为归一化浓度比C_t/C₀和C_t/C_0TN）以及N₂O的排放量来评估APAP对细菌反硝化的影响。在未添加APAP的对照组（CK）中，P. denitrificans表现出高效的反硝化作用，在22小时内TNRE达到89.4%（图1a），这与其在乙酸盐供氧厌氧条件下的高反硝化能力一致。

结论

APAP主要通过干扰细胞生物能量代谢来抑制P. denitrificans中的异养反硝化作用，而不是通过膜损伤或限制底物利用。在7.5 ppm浓度下，细胞内ATP、ΔΨ和ΔpH均下降，表明质子动力平衡受到破坏。与膜相关的ETSA变化不大，而cyt c连接的PETCA明显受到抑制，同时伴随着NO₂^-积累、N₂O排放量增加以及细菌生长减缓。

环境影响

作为废水中常见的药物成分，对乙酰氨基酚可能比之前认为的更严重地影响微生物的氮去除能力。在本研究中，对乙酰氨基酚通过干扰细胞内能量代谢来破坏反硝化过程，从而导致亚硝酸盐积累，可能增加处理后出水中的氮释放风险。这种功能紊乱会降低废水处理效果，并可能增加接收水体的富营养化风险。

CRediT作者贡献声明

张正哲：资料整理。杨健：数据分析。卢成军：数据分析。朱毅帆：数据分析。张宇：撰写——审稿与编辑、资金申请、概念构思。董志辉：撰写——初稿。金仁村：撰写——审稿与编辑、资金申请。卢静：数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：52500032）和浙江省自然科学基金（编号：LQN26E080042和LR20E080001）的支持。