钾离子能够使大鼠子宫在催产素及其结构类似物的作用下发生去极化：动力学分析

《Canadian Journal of Physiology and Pharmacology》：Potassium depolarized rat uterus in response to oxytocin and its structural analogues: kinetic analysis

　　摘要
本文的主题是研究大鼠去极化状态下肌层动态过程的动力学分析，重点关注其生物力学特性及其在产科中的潜在应用。通过增加器官浴中的K+浓度来实现去极化。去极化会导致肌肉张力迅速短暂增加，随后缓慢建立一个新的静息状态，在该状态下收缩活动的相位成分被抑制。肌层仍然可以被催产素及其结构类似物激活。时间-张力响应曲线显示，存在多个叠加的、时间依赖的指数成分，其速率常数反映了调节细胞内钙浓度的转运和分布途径。初始的快速张力上升之后，张力会缓慢变为稳态。当使用油浸法中断这一过程时，可以确定催产素肽在去极化状态下的亲和常数。对于11种催产素肽，在极化与去极化肌层中的平均效力比为9.14。两种状态下没有观察到配体偏倚。对响应曲线的动力学分析表明，这些结果与催产素刺激后钙敏感性和转运过程的变化一致。

1. 引言
催产素诱导的哺乳动物子宫收缩包括一个相位成分和一个张力成分（Mironneau 1976; Edwards et al. 1986）。张力成分是一种持续的、非周期性的肌肉收缩，而相位成分则以肌肉张力的周期性变化形式出现，并伴随着跨膜电位的去极化-复极化尖峰（Casteels and Kuriyama 1965; Kleinhaus and Kao 1969; Kao 1989; Garrett et al. 2024）；它由子宫体中分布广泛的起搏点引起（Lammers et al. 2015; Lutton et al. 2018; Young 2018）。这两个成分是重叠的；在特定的响应曲线中，它们的相对比例取决于刺激剂的浓度（Edwards et al. 1986）。肌浆中的钙浓度通过激活肌动蛋白-肌球蛋白复合物在调节肌层张力中起核心作用（Sanborn et al. 2005; Arrowsmith and Wray 2014）。在体外静息状态下（即没有催产素刺激时），这种浓度以及肌动蛋白-肌球蛋白纤维周围的钙浓度既受储钙 operated 钙通道（SOCE）和电压门控L型钙通道（VOCC）的调控，也受质膜钙ATP酶（PMCA）和钠-钙交换器（NCX）的调控（Noble et al. 2014）。肌细胞收缩的即时状态随后由与膜催产素受体（OXTR）相连的G蛋白相关的钙敏感性过程控制——通过钙调蛋白和肌球蛋白轻链的磷酸化（RhoA/ROCK途径）（Cario-Toumaniantz et al. 2003; Zangeneh and Hantoushzadeh 2023）。在没有催产素刺激的情况下，这些途径似乎是持续活跃的（Seifert and Wenzel-Seifert 2002; Kenakin 2005）。类似催产素的肽通过与OXTR相互作用来影响这一过程，OXTR属于Gq/11α-蛋白偶联受体家族（Rozen et al. 1995），位于肌层细胞膜的外表面（Ku et al. 1995; Gimpl and Fahrenholz 2001; Shlykov and Sanborn 2004）。OXTR的激活会产生两种第二信使：释放到肌浆中的肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和嵌入膜的二酰甘油（DAG）。IP3促进钙从细胞内储存库流入肌浆（Arrowsmith and Wray 2014）。这些储存库的随后耗尽导致通过SOCE通道进一步摄入钙（Prakriya and Lewis 2015）。DAG抑制通过电压门控SLO2.1通道的钾泄漏（Ferreira et al. 2019），引起短暂的膜去极化，从而导致VOCC通道的瞬时开放和随后的钙进入肌浆。OXTR介导的响应的张力成分主要与储钙依赖的钙摄入过程相关，即IP3信号通路；而相位成分则通过L型通道的激活介导，即DAG信号通路（Arrowsmith and Wray 2014）。逆转肌浆与细胞外环境之间的钾梯度会导致肌层膜去极化，并显著改变催产素响应曲线，其特征是相位成分的消失（Wanner et al. 1977）。如先前报道（Schild 1966），这有助于简化对平滑肌对收缩药物反应过程的理解，在这种情况下，特别是与雌激素主导的子宫组织中的尖峰形成机制相关，从而更一般地理解肌层功能。因此，我们使用去极化的肌层来进行子宫收缩相关过程的动力学分析。K+去极化稳定了张力，以便研究催产素及其肽类似物（OXT-肽）从细胞膜受体附近清除的过程（Pliska and Jutz 2021）。使用油浸技术（Kalsner and Nickerson 1968）可以将清除过程中的扩散和失活成分分开，使响应下降曲线平滑，便于进行数值分析。分离出张力状态简化了催产素刺激后肌层时间-张力曲线的动力学分析，从而可以得出关于钙在各个细胞区室间分布的结论。这些曲线除了用于比较不同状态下类似催产素的肽的子宫张力活性外，也是本文的研究对象。这对于临床产科具有重要意义，因为催产素及其类似物常被用作子宫收缩剂和宫缩抑制剂，有时甚至作为救命药物，例如在严重的围产期出血情况下（Pliska et al. 2022）。

2. 实验
数值分析基于我们最近的研究报告中的数据（Pliska and Jutz 2018, 2021）。相关实验条件如下：
2.1. 动物和组织制备
选择处于自然发情期的雌性SIV 50 Sprague-Dawley大鼠（体重170–200克，年龄5–6周，阴道涂片检测到无核角质化上皮细胞），通过断头法处死，解剖子宫角，并用手术刀刮除子宫内膜。将肌层的中部切片（约15毫米）切成3–4毫米长的条带。平均每只大鼠使用三条条带（共31只大鼠用于实验）。
2.2. 肽
本实验中使用的催产素及其肽类似物（下文简称OXT-肽）最初被设计为所谓的“酶探针”（Rudinger et al. 1972a, 1972b），并已进行药代动力学表征（Pliska and Jutz 2021）。它们列在表1中，包括它们的常规活性（包括我们在实验室重新评估的值）、缩写和来源。
表1. 研究的肽及其在体外的子宫张力活性
2.3. 时间-响应测量的实验设置
实验方案在我们之前的报告中详细描述（Pliska and Jutz 2018）。简而言之，肌层条带被悬挂在加热过的器官室（30°C）中，其中含有10毫升低钾Munsick培养基（Munsick 1960）（114毫米摩尔/升NaCl，7.8毫米摩尔/升KCl，0.1毫米摩尔/升MgCl2，0.6毫米摩尔/升CaCl2）。条带连接到等长力传感器（Statham应变计UC3），并通过通气进口管持续用Carbogen气体（95% O2 + 5% CO2）进行通气。基础张力调整至10毫牛顿。肌肉收缩在大约30分钟后达到稳定的相位状态（见图1）。然后将培养基替换为高钾Ringer器官浴培养基（Schild 1966）（K+ 155毫米摩尔/升，Ca2+和Mg2+ 0.5毫米摩尔/升）；在细胞外K+浓度约为140毫米摩尔/升时达到零跨膜电位（Casteels and Kuriyama 1965的推算值），并且在K+浓度为40毫米摩尔/升时抑制催产素的相位响应（Edwards et al. 1986）。培养基的更换导致肌肉张力迅速增加到25–35毫牛顿，然后缓慢恢复到静息状态。大约20毫牛顿的张力收缩由相当于其D2值5到50倍的肽浓度引起（见下一段）。当张力达到稳态后，通过将含有肽的培养基更换为“新鲜”的去极化培养基（洗脱设置；流速约为1毫升/秒，持续10分钟），或更换为粘度小于65厘泊的石蜡油（油浸设置（Kalsner and Nickerson 1968）来快速中断刺激。记录的张力以恒定的时间间隔数字化（总共记录了大约30个时间-响应数据对）。在用去极化培养基反复洗脱后，再进行一次刺激循环。在不同的大鼠肌层条带上测试单个肽。图1显示了一次刺激过程的记录。
图1. 雌激素主导的大鼠肌层对K+去极化（左）和在K+培养基中用催产素刺激的张力响应。记录了一个去极化实验（Wanner 1976）。自发收缩的肌层条带（具有相位成分）被高钾Ringer浴培养基去极化，60分钟后用催产素（浴培养基中浓度为20纳米摩尔/升）刺激，60分钟后用新鲜浴培养基洗脱。纵坐标：肌肉张力，单位为毫牛顿。

3. 评估程序
3.1. 浓度-响应分析
子宫张力响应（E）表示为一个有理分数，包含肽活性描述符K和浓度项c，以ν次幂形式表示（ν通常表示为Hill系数），??c= ??m3????????2+????(1)，其中Em是特定实验过程中特定肌层条带可达到的最大响应，??m=lim??→∞ ??c。K2表示在器官浴中引起半最大响应的肽的摩尔浓度，从而反映了组织对该肽的敏感性（“内在亲和力”）。为了可视化去极化后肌层对类似催产素的肽的收缩敏感性的变化，去极化后的亲和力描述符（K2 → C2）与低钾Munsick培养基中的亲和力描述符（K2 → D2）进行了比较。催产素类似物的亲和力描述符D2（以浓度单位表示）通常在已发表的报告中不可用。
个别肽的子宫张力活性（α）通过传统的4点、6点或8点平行线测定法（Schild 1942; Burn et al. 1950）进行评估，并以国际单位（IU）表示，这些单位由第三版《催产素、血管加压素和抗利尿物质国际标准》（Bangham and Mussett 1958）定义。将其大致转换回D2可以表示为??2,ap=??2,sp × ??sp，其中sp表示标准值，ap表示相应的类似物。关于催产素作为标准物，文献中报告的α值有些分散（Jo?t et al. 1987）；本文使用的平均值是496 ± 19 IU/毫克（标准误差，n = 4；参见表1）。催产素的D2平均值是根据多个研究小组使用方程2得出的剂量-响应曲线评估得出的：D2,sp = 3.05 ± 0.45纳米摩尔/升（标准误差，n = 8）。通过上述转换得到的类似物数据的相应负对数（pD2）列在表2中，同时还包括我们实验室之前通过剂量-响应分析获得的数据（Jutz 1976）。
表2. 催产素类似物的子宫张力活性描述符。
我们在实验室中根据剂量-响应关系（参见图2，B面板）使用非累积剂量方案（达到最大响应后用新鲜培养基洗脱）确定了极化肌层（低钾Munsick培养基）中一些肽的亲和力描述符D2。表2包括两种标准肽（OXT和DOT）的新确定的pD2值，以及在ETH Zurich重新合成的类似物（DAOT）（Mühlemann 1973; Keller 1974; Keller and Rudinger 1974; Jutz 1976），或为了与之前发表的数据进行比较而重新测定的类似物（HOT, C1OT, C1,6OT；参见表1）。
图2. 催产素（OXT，开放符号）和去氨基催产素（DOT，闭合符号）在极化和K+去极化状态下的浓度-响应关系。A面板：用油浸法中断刺激阶段后K+去极化大鼠肌层的数字化时间响应数据。kOXT和kDOT是用于将时间尺度转换为浓度尺度的估计速率常数（分钟?1，参见方程15）。B面板：极化状态（方块；见正文）和去极化状态下的OXT和DOT的浓度-响应曲线（圆圈）；叉号（×）表示在回归分析中未考虑的数据。横坐标：对数浓度c（摩尔）。C面板：同一数据（c以纳米摩尔/升表示）在Lineweaver–Burk图中的线性段（双倒数转换）。
3.2. 时间-响应曲线的指数分析
通过对响应（E）的数值数据进行数字化并将其标准化到最大可达响应?t = Et/Em（参见方程1），获得了关于肽或K+去极化对天然肌层响应的数值数据（Et表示时间t处的E值）。时间-?t关系是指数项的总和，每一项都可以统一表示为速率常数λ、初始前指数常数（a0 – a∞ = ?0）和背景偏移（??∞= lim??→∞???t）的函数：(a0???∞)????????+??∞ (3)。当a0 > a∞时，指数序列是递减的；当a0 < a∞时，指数序列是递增的。因此，?t=∑??((a0,?????∞,??)???????????+??∞,??) (4)。描述符a0、a∞和λ的数值首先通过非线性回归分析针对各个时间段k进行评估，然后用作公式(4)中这些系数的初始值。在数值计算中采用了高斯-牛顿（Levenberg–Marquardt阻尼最小二乘法）、拟牛顿（Martínez 2006）或单纯形（Spendley等人1962）算法。

3.3. 软件工具
用于数据评估和数学分析的软件包包括：Wolfram Mathematica版本13.3；SYSTAT版本13.2；以及GraphPad Prism版本10.4（描述性和非线性统计、统计测试）；MATLAB版本R2021a（数字化和数值程序）。

4. 结果
4.1. K+-去极化的动力学
本文描述的在极化状态下的雌激素主导的肌层（Munsick培养基）在单个组织条带中表现出自发的相位收缩，其尖峰发生率为2.5至3.5次/分钟（频率为0.04–0.06赫兹）。尖峰的初始速率常数（λis）是根据接近零时间点的时间-张力数据（Wanner等人1977）估算的（图1，左侧）。假设极化肌层的初始尖峰速度可以通过方程式6中的?a项充分描述，因此使用Maclaurin定理估算该状态下的相应速率常数λis：(1??????is???) ≈ ??is??? 1/2(??is2)??2+1/6(??is3)??3…（5），通过对前两项进行回归分析得到。平均λis值为0.34次/秒（参见表3），这与来自不同实验室的已发表数据评估结果一致。用高钾Ringer培养基替换Munsick培养基后（图1，左侧面板和图3，下方响应曲线），相位收缩消失，肌肉张力短暂增加，随后在我们的实验中缓慢恢复到一个比极化状态初始值高约1.5倍的新的静息状态。在实验过程中，这一因子大致呈抛物线形增加到约2.5。（注：例如，在怀孕的人类子宫中观察到了更高的K+静息状态水平（Bytautiene等人2003）。在较早的文献中使用等渗设置时，报告了不同的收缩曲线（Jung 1959）。

图3. OXT刺激序列的曲线。在K+-去极化培养基中记录了一系列刺激周期。OXT刺激被无OXT培养基的冲洗或油浸终止（上图）或油浸终止（下图）。虚线：实验过程中基本（静息）状态张力的时间过程。

表3. 响应曲线：参与指数过程的速率常数a。

初始尖锐瞬态尖峰（?0）的张力超调动力学，通常表示为指数项的总和（方程式4），包括一个上升部分（?a，速率常数λa）和一个下降部分（?d，速率常数λd），两者都通过方程式3映射：?a通过插入a0 = 0和a∞ = 1（归一化值）得到，?d通过a∞ = 0得到，?a=(1??????a???)，?d=?????d???（6）。

?d部分显然涉及与?a部分中增加的张力相反的细胞过程；整个尖峰响应?0的动力学可以经验性地表示为?a? ?d的乘积，?0= ?????d????(1??????a???）（7）。?0的峰值（?ap）在d???0/d???=0时达到，tap=1/??a·ln(1+??)，??=??a??d（8）。峰值可以从接近t = 0的狭窄时间间隔估算得到，即?ap=??·(1+??)?1+????（9）（参见表3）。（注意：峰值幅度仅取决于两个速率常数的比率；参见方程式8。随着R的增加，?ap渐近地趋近于1）。

与（可能是时间依赖的）静息状态相关的时间-响应数据（见图4）表明另一种缓慢的指数张力下降（由方程式3和4描述，其中a∞,1 = 0，?1= ??0,1??????1???（10）），与?a状态无关。相对响应?t表示以任意单位（此处为mN）测量的肌肉张力，与预先选定的标准化因子相关（此处为单个实验系列中的最高张力值；参见图3）；其选择不影响速率常数λ的评估。因此，在给定时间范围内K+-去极化的动力学可以通过?0、?1的叠加来描述，可能还有另一个描述接近静息状态的时间-响应过程的指数项?2。由于?2的进程（上升或下降）通常无法从实验数据中直接确定，其合适的表达式是通过插入方程式4得到的：?t=?????d????(1??????a???)+ ??0,1??????1???+(??0,2???∞,2)??????2???+??∞,2（11）。

图4. 雌激素主导的肌层的K+-去极化及其随后用催产素（10 nmol/L OXT）刺激的动力学阶段。圆圈：图1（K+-去极化）和图3（OXT响应，下方记录—第一次OXT刺激运行；曲线的上部，?rel > 0.3）上的时间-响应记录的数字化值。数字化值与预先确定的肌层条带的收缩性相关，并根据给定时间的相应背景值进行了校正。实线显示计算出的回归线，虚线显示通过指数分析识别的单个阶段的指数过程。（速率常数λ以分钟?1或秒?1表示）。R2：观测数据与预测数据的相关系数平方；df：相应的自由度。

在给定条件下的指数分析（限制：a∞, 2 ≥ 0）表明存在另一种下降形式的?2，并且进一步表明速率常数λ1和λ2大致相等（图4）。速率常数λ的数值总结在表3中。常数λd、λ1和λ2是在几种计算条件下对三个子宫条带估算的（见实验部分）。可以使用基于牛顿-拉夫森方法的求根程序对方程式8或9进行估算，从预先确定的常数和经验估算的峰值时间点得到λa。从方程式8的总导数中得到的λa的极限值，在假设峰值估计准确率为25%的情况下，位于0.2到1.1秒?1的区间内。通过方程式5估算的初始速率常数λa的值是可比的。这一阶段很可能是由于细胞内钙池之间的重新分配引起的（van Breemen和Daniel 1966），与下降阶段相比非常快，因此λa的平均值受到相当大的估算误差的影响。图4（左侧面板）展示了动力学分析的一个示例。

4.2. 去极化肌层对OXT肽的子宫收缩反应动力学
用催产素或OXT肽在预期C2浓度附近刺激去极化的肌层会导致初始的脉冲状张力超调，类似于前一节中描述的“衰减”反应（Fastier等人1973）。这大约达到基线张力的2.5到3倍，在大约10–15分钟内下降到一个较低的拐点，并在15–30分钟内达到稳态响应（“平台阶段”，方程式3中的a∞ > 0）（这是一个相当缓慢的过程）。通过迅速将刺激介质更换为石蜡油或无肽的Ringer溶液，前者在大约20–40分钟内恢复到基线张力，后者在大约10分钟内恢复。图3显示了一系列在两种模式下终止的催产素后续响应。在6小时的过程中，它们在刺激阶段的基本曲线保持相当单调，并且与刺激肽的浓度无关。中断稳态的不同方式确实导致了不同的下降曲线。油浸终止后的下降显示出平滑的指数过程，这取决于刺激肽从受体区室的消除速率（Pliska和Jutz 2018）。用K+-Ringer冲洗后的衰减形状经常偏离简单的指数曲线：它们表现出构建“反向（负）衰减”现象的倾向，如前所述（Wanner和Pliska 1975；Wanner等人1977），因此不适合分析衰减阶段。

在上述实验设置中，刺激后的静息张力在4–5小时的间隔内持续增加（图3中的虚线）。个别类似物的曲线在形式上相同，显然与刺激浓度无关。其中四种（OXT、DOT、DC6OT和DGOT）接受了动力学分析。与K+-去极化类似，瞬态初始阶段符合方程式6和7。平台阶段（??s?=lim t→∞???s；见方程式12）反映了与刺激开始时同时启动的叠加响应激活过程，??s= ??∞,2?(1??????2???）（12）。类似地，方程式11和13描述了整个刺激阶段的动力学：?t=?????d????(1??????a???)+??0,1??????1???+??∞,2?(1???2???）（13）。为了得到λ常数的数值估计，分两个阶段进行了非线性回归分析：首先，从接近峰值≥0的时间间隔的数据中评估λa和λd的值，然后使用单纯形算法作为整个时间间隔内所有常数的初始估计。或者，如上所述，使用峰值通过求根方法得到λa。表3列出了λ常数的估计值。图4的右侧面板显示了一个数值评估的OXT刺激曲线的示例。

方差分析（ANOVA）表明，这里使用的各种算法（高斯-牛顿、拟牛顿和单纯形）估算的常数没有显著差异。在使用个别肽的重复刺激过程中，λ值之间偶尔会出现差异。然而，事后假设检验（Tukey 1959）表明，数据中的散布主要是由难以控制的实验条件（如肌层制备的差异、刺激周期的安排等）引起的，而不是由刺激肽的化学结构差异引起的。

4.3. OXT肽：K+-去极化状态下的浓度-响应关系
4.3.1. 时间尺度转换为浓度尺度
在“实验”部分描述的用于极化肌层的评估方法在应用于去极化肌肉时无法提供可靠的结果。刺激曲线需要相对较长的时间才能达到稳态响应，而且在仅几次刺激循环后经常会出现快速耐受性。因此，我们使用了一种基于在稳态响应阶段终止后的时间t评估响应强度的替代方法（Pliska和Jutz 2018），该时间t由初始浓度c0确定。刺激后阶段的组织清除过程导致初始浓度c0在时间t降低到引发相应响应Et的值ct；代入方程式1得到??t=??∞????t????2+????t（14）。E∞是在刺激终止时的Et值（定义为t0 = 0）。ct衰减过程由叠加的指数时间项τ描述，τ?(??)=∑?????????????????，∑??????=1；????=??0 τ?(??）（15）。指数常数ki与受体区室中不同消除过程的速率有关（Pliska和Jutz 2018）；前指数项Ai是各个ki常数的函数。使用方程式1、13和15，并将时间过程Et与其在t = 0时的初始稳态值E0相关联，定义相对响应为???≡??????0= 1+????1+(?????(??)??（16），其中??=??2??0。C2是相应肽的体外活性的描述符（见上文）。我们最近的通信中提供的实验证据表明，单个指数项（分配为k的速率常数）充分代表了本文中描述的油浸阶段的消除过程。结合方程式15和16进行单指数近似（A1 = 1，k1 = k且Ai > 1 = 0）得到表达式???= 1+????1+(?????(??)??（17）。为了消除起点（t = 0）附近的可能的张力不规则性和响应曲线的初始下降部分，回归分析集中在0.15 < ?t < 0.75的时间间隔内的数据子集上。对方程式17应用高斯-牛顿和/或拟牛顿非线性回归算法来估算参数k、ν和C2。迭代进展在很大程度上取决于参数的起始值选择，特别是合适的起始G值；此外，参数k和ν经常显示出高度的渐近相关性。这个问题可以通过使用固定值ν = 1进行初步迭代计算来规避；在最初的几次迭代步骤中通常可以得到稳定的k值，而C2的迭代经常不收敛或导致循环振荡。然后，上述的单纯形算法通常会产生一致的C2和ν值。

4.3.2.亲和常数（C2）：通过两步迭代程序，根据各个肽的时间-响应曲线估算了它们的C2值。为此，将数字化的响应值参照每个刺激步骤估计的基线张力值，使用二阶多项式进行校正（参见图3）。在第一步评估中，通过上述程序（方程17）确定每个时间-响应曲线的速率常数k，并用它将时间尺度转换为浓度尺度（方程15，形式为ct = c0e?kt）。然后在下一步中推导出C2和ν值。汇总的数据包含在表2中。图2展示了使用两种标准肽——催产素和脱氨氧催产素的分析过程。A面板显示了数字化的时间-响应数据，B面板显示了这些数据转换为浓度-响应尺度后的结果，以及这两种肽在极化状态下的标准化剂量-响应曲线。C面板以双倒数坐标（Lineweaver-Burk图）展示了B面板中的数据集。在任何情况下，平均功率（Hill）系数ν都与1没有显著差异；如果系数不等于1（ν ≠ 1），则双倒数图会出现弯曲（Pli?ka 1975, 2001）。因此，通过动力学衰减曲线转换得到的数据集的剂量-响应关系可以用一个简单的矩形双曲线来充分描述。

4.3.3. 功效比：C2与D2之间的关系
C2/D2比值反映了肽在去极化和极化条件下的功效差异（表2）。当从单个肽的数据计算得出时，其平均值为9.29 ± 0.06（标准误差，n = 9）。C2和D2数据的负对数（pC2 = ?log C2，pD2 = ?log D2）在图5中绘制，显示出线性相关性（斜率接近1），这允许从x（pD2）和/或y（pC2）截距估计功效比（int），??2??2= 10???????? ??= 10????????? ??（参见图5中的插入文本）：平均C2/D2为9.14 ± 0.07。DC6OT的效能比显示最低值（表2），因此可能是一个潜在的异常值；然而，对于异常观测值的检验（Grubbs 1950）并不支持这一假设（p > 0.1）。

图5. 极化（pD2）和去极化（pC2）状态下催产素类似物的亲和度描述符。表2中的数据以及回归参数（估计的平均值和标准误差）位于插入的面板中。C2/D2比值是根据pC2和pD2截距估算的（见文本）。误差条：平均值的标准误差。开放圆圈表示具有极性Nα末端（-NH2, -OH）的肽，闭合圆圈表示非极性Nα的肽（脱氨类似物）。

因此，总体而言，K+去极化使肌膜对OXT肽的敏感性大约降低了十倍。

5. 讨论
5.1. 雌激素主导的肌膜的K+去极化
雌激素主导状态下肌膜的瞬时K+去极化会导致子宫起搏器的关闭，从而终止相位活动（Wray和Taggart 2024）。这会导致一个快速的短暂张力峰值（可能与相位成分的终止有关（Bursztyn等人2007；Tong等人2011），随后缓慢恢复到平衡状态。文献中也报告了类似的输出特征（Ruzycky等人1987；Bytautiene等人2003；Crankshaw和Morrison 2011；Morrison等人2016）。曲线分析（表3）表明，去极化肌膜从峰值到静息状态的张力下降至少包含两个叠加的指数过程：一个是“超调”补偿（λd在1.5到1.8 min?1之间），另一个（λ1约为0.08 min?1）是朝向零的较慢的自主张力下降。

如引言中所述，肌膜张力与肌动蛋白-肌球蛋白细丝附近Ca2+的浓度成正比，并且取决于它们的当前构象，这主要由钙敏感化过程决定。几种运输过程参与了肌浆中实际Ca2+浓度的确定。研究表明，去极化会打开L型电压门控钙通道（VOCC），从而允许细胞外钙进入细胞（Berridge 2008）。这种机制可能有助于初始冲动后的持续收缩，因为持续收缩会被钙通过VOCC的流动抑制剂阻断（Ruzycky等人1987）。van Breemen和Daniel根据数据估算的45Ca进入K+去极化大鼠子宫的流入速率为平均0.05 min?1（van Breemen和Daniel 1966），这与我们测量中发现的慢响应成分的值（0.08 min?1，表3）相符。Wanner等人（1977）的肌膜收缩室模型也得出了类似的低钙运输速率常数值。预先加载了45Ca的组织中的钙流出也分为两个阶段（van Breemen和Daniel 1966）：一个较快的阶段（估计的速率常数在0.16到0.46 min?1之间）和一个较慢的阶段（0.03 min?1）。这两个过程可能同时发生，较慢的过程可能导致钙被隔离到网状结构中。

这些钙运输途径显然太慢，无法解释瞬态初始冲动的快速收缩阶段。相反，正如通过对数字化模拟响应曲线的分析所显示的（Wanner等人1977），与细胞膜相关的钙池（Daniel 1965；Polá?ek和Pli?ka 1969）在K+去极化后立即发生的快速初始张力增加中起主导作用。对于用乙酰胆碱刺激豚鼠回肠肌肉也提出了类似的模型（Chang和Triggle 1973）。

研究发现，去极化冲动后的电化学变化会导致膜内钙的横向移动，显然也在内质网中，通过将其结合位点从高亲和力位点转移到低亲和力位点（Altenbach和Seelig 1984；Sinn等人2006；Melcrová等人2016），从而在膜中形成短暂的自由钙池，可能也在与膜相关的内质网中的钙储存库中。这些钙池中的钙运输到目标细丝的速度非常快，这一点从人类细胞培养的数据中可以得到证实（Holda等人1996）。网状结构中的钙池通过肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）介导的主动钙运输得到补充（Floyd和Wray 2007；Noble等人2014；Primeau等人2018）。比较速率常数λa和λd（表3）表明，钙的释放速度可能是补充过程的约20倍。

问题在于，这样的系统动力学是否与为峰值时间过程提出的经验关系（方程7）一致。我们通过以下模型来证明这一提议。假设一部分钙（m）从一个储存室（迅速补充）运输到肌动蛋白细丝的环境中（钙浓度：cf），随后cf很可能会通过扩散进入周围的肌浆而减少。系统中的钙重新分布过程可以用以下速率方程简化描述：
d???/d???=???s ??（19）
d???f/d???= ??s?????f???d???f（20）
Ks和Kd分别是储存室和细丝室中浓度变化的速率常数（Vf是其假设体积）。在初始条件m(t = 0) = m0, cf(t = 0) = cf,0下，解为：
???(??)= ??0??????s???（21）
??f?(??)=??1??????s???+ (??f,0 ???1)??????d???，其中??1=??0??f ??s??d???s（22）
Ks包括总运输到细丝室的钙量的增加（Ka）和减少（Kd）组分的速率常数，Ks = Ka + Kd（显然，Ka ? Kd）。假设峰值响应?0是由细丝室中钙浓度暂时增加引起的，高于其静息状态（Δcf），形式上为cf,0 = 0时，Δ???f?(??)=??2??????d???3（1??????a???）∝??0，其中??2=??0??f ??a+??d??a≈??0??f（23）。
这证明了方程7和23的比例关系。

另一方面，通过钾或激素刺激从去极化状态恢复到复极化状态的过程是缓慢的（Bytautiene等人2003；Morrison等人2016）。这也可能解释了去极化状态下静息状态中持续张力的低且相当随机的增加（图1）。由于激素或其他信号通路的激活，这种状态至少部分保留了收缩能力。

5.2. 去极化肌膜对OXT肽刺激的响应
目前的观察结果证实了我们之前的报告，即肌膜即使在去极化状态下也保持对OXT的响应性（Wanner 1976；Wanner等人1977；Pliska和Jutz 2018, 2021）。对OXT刺激的多相响应曲线（图1和3）是分叉的第二信使途径的结果（见引言）。初始峰值脉冲的动力学特征与上述K+去极化相似；它们的（粗略估计的）速率常数λa（表3）处于同一数量级。上述提到的膜内钙池的重组可能适用于所有去极化过程。尽管K+去极化显著降低了膜电位，但它可能不足以阻止与其配体（OXT）激活相关的去极化成分——即内质网K+通过SLO2.1通道的短暂抑制（Ferreira等人2019）。收缩效应的第二阶段与肌浆中钙的较慢重新分布过程有关；由OXTR刺激产生的肌醇三磷酸（IP3）启动了从其网状储存库中的钙释放。由于这些储存库的容量有限，它们可能通过储存操作的Ca2+进入从细胞外池中得到补充（Waldron等人1997）。因此，对OXT肽的响应的动力学阶段与已知的OXT刺激后调节钙重新分布的过程非常吻合。

5.3. 瞬态状态动力学
如表3所示，K+去极化和OXTR刺激的参数λa、λd的值只有轻微差异（它们的置信区间有重叠）。去极化状态的λa常数和极化肌肉中峰值初始速率的λis处于同一数量级。因此，可以初步得出结论，在所有这些情况下，快速的“衰减样”肌肉收缩是由相同的细胞过程引发的。

5.4. 刺激后的阶段：肌膜松弛
在我们的实验中，通过两种方式中断催产素刺激：一种是外部灌注去极化介质（“洗脱”模式），另一种是用石蜡油替换水介质（油浸模式，见上文）。图3显示了两种中断模式的特征性下降曲线差异。在洗脱模式（上图）中，张力在短时间内达到基线值，并经常显示出反向衰减现象（见上文）；其曲线大致类似于初始刺激阶段的水平反转曲线。在油浸模式（下图）中，下降较慢，因为两亲性肽分子的扩散受到高度疏水细胞外环境的阻碍。去除油并用“新鲜”的去极化介质替换通常伴随着短暂的弱收缩波（参见图3，下图），这表明即使暂时没有水介质环境也会影响肌膜的张力状态。这可能表明，K+去极化后的张力状态不仅受细胞膜内钙池重新分布的控制，还部分受细胞内外 compartments之间离子平衡的控制。

最近对油浸阶段松弛数据的研究（Pliska和Jutz 2018）表明，OXTR肽刺激终止后肌膜张力的下降主要是由于控制受体室内肽浓度变化的过程——即肽-受体复合物的解离、该室内肽的局部清除以及肽在细胞间 compartments和细胞间隙之间的运输。受体-肽结合速率以及受体-肽解离后控制肌肉张力的自主过程并不显著决定松弛速率。

由于在刺激后阶段，肌肉松弛成分不是速率决定因素，因此可以使用在油浸模式下获得的数据的时间-响应转换来估计亲和常数（pC2），正如实验部分所提出的。显然，pC2值是类似催产素肽的持续成分的活性描述符。图5中的图表显示了它们与极化肌膜中的亲和度描述符pD2的关系。这两个常数高度相关；回归分析表明持续成分的亲和力大约低10倍。然而，应当注意的是，pD2数据代表了两种成分（持续性和相位性成分）的非线性组合，并主要基于来自不同来源的已发表数据。此外，不同实验室对这些数据的估计方法并不一定统一：大多数出版物缺乏对所用方法的描述（如累积剂量-反应曲线、对单个浓度的反应、测量效应的持续时间等）。与此处报告的结果相反，在极化的人体妊娠子宫肌中，催产素的持续性活动增强效应（通过最大振幅测量）是引发相位性反应效应（通过平均收缩力测量）的4到6倍（Crankshaw和Morrison 2011；Morrison等人2016）。综合这些观察结果，可以推测（但无法证明）子宫肌中的OXTR信号传导存在系统偏差（Kolb等人2022），这种偏差与跨膜电位有关：在极化和去极化的肌细胞膜中，受体的激活涉及不同的G蛋白分子。这种差异可能因物种和/或激素而异。pC2与pD2之间的密切相关性（图5）表明，本研究中研究的肽类物质存在配体偏倚的可能性较低，尽管在另一组与OXTR相互作用的激动剂或拮抗剂肽类中也观察到了这种现象（Busnelli等人2012）。

6. 结论
1. 在体外条件下，高细胞外钾浓度使雌激素主导的鼠子宫肌去极化，导致等长记录的肌肉张力短暂急剧增加，随后缓慢下降至新的静息状态。
2. 去极化峰值的快速出现支持了磷脂结构重排可能在肌细胞膜中起作用的假设，这不仅促使额外的游离Ca2+离子（主要来自膜结合的内质网）释放到肌动蛋白-肌球蛋白纤维周围，还通过钙敏化进一步激活肌动蛋白-肌球蛋白复合体。
3. 在去极化状态下，对OXT肽的相位性反应被抑制，但其持续性反应仍然存在。与极化状态下的传统评估活性相比，其反应敏感性降低了大约十倍。在去极化状态下评估的OXT肽活性指标（pC2）很可能反映了收缩反应的持续性成分。极化状态和去极化状态下的亲和力指标之间存在密切相关性。子宫肌的收缩力（最大收缩）保持不变。
4. 通过将时间尺度转换为浓度尺度来计算持续性效应亲和系数的方法，在本例及类似情况下被证明比传统的稳态剂量-反应分析更为适用。
5. 与K+去极化和OXT刺激后去极化子宫肌中肌肉张力初始峰值相关的动力学数据表明，这两种过程具有相同的物理基础。
6. 通过比较相应的动力学数据（表3），可以假设类似的收缩活动动力学模型也适用于雌激素主导的极化子宫中的单个放电峰值，无论是自发的还是由催产素刺激的。

致谢
本出版物部分包含了Oskar Wanner博士和Guido Jutz博士的博士论文数据，经前者许可使用（G.J.于2014年去世）；相关参考文献已在文中引用。我们想向他们两人以及我们实验室的技术人员表示感谢。特别感谢Paul Pliska博士对本文数学部分的仔细审阅以及对文本的诸多建议。同时，V.P.也感谢苏黎世联邦理工学院IT部门的Rolf Joho先生在特定数学软件使用方面提供的持续帮助。