《Journal of Hazardous Materials》：Metabolic triage under oxidative stress: Peracetic acid drives Listeria monocytogenes into a persistent, biofilm-enhanced small colony variant state
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杨慧|朱银诺|段雷|张乃云|李思静|廖启林|于梦瑞|张子怡|史超西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西省杨陵市712100摘要环境生物危害导致的小菌落变异体（SCVs）的形成，对工程环境中的危害检测和缓解构成了严峻挑战。在本研究中，我们探讨了过氧乙酸（PAA）诱导的List
杨慧|朱银诺|段雷|张乃云|李思静|廖启林|于梦瑞|张子怡|史超
西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西省杨陵市712100
摘要
环境生物危害导致的小菌落变异体（SCVs）的形成，对工程环境中的危害检测和缓解构成了严峻挑战。在本研究中，我们探讨了过氧乙酸（PAA）诱导的Listeria monocytogenes SCVs的生理特性和形成机制。PAA处理后，出现了短暂的、微型化的SCVs，其特征为代谢休眠、延迟期延长、酶活性降低以及ATP耗竭。转录分析显示，应激响应基因（sigB）和外排基因（mdrL）上调，而毒力基因（hly、inlA）以及代谢基因（betL、ftsZ）下调。尽管flaA基因上调，但SCVs的运动能力受损，生物膜形成能力增强。从生理学角度来看，SCVs表现出膜超极化、细胞内ROS水平升高以及对酸、热和渗透压压力的交叉保护。关键的是，使用CCCp抑制ATP合成后，菌群从可培养状态转变为不可培养状态，这证实SCV的形成是一种主动的、依赖能量的适应机制，而非被动损伤。此外，虽然侵袭能力减弱，但细胞表面的疏水性和黏附性显著增强。这些发现表明，PAA使L. monocytogenes进入一种以持久性为优先的防御性休眠状态，为这种生物危害在环境氧化应力下的毒理学反应和持久性策略提供了新的见解。
引言
Listeria monocytogenes是一种杆状、革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，广泛存在于工程系统和环境中[1]。它是一种重要的机会性生物危害，常与农业和工业环境相关[2]。从公共卫生的角度来看，L. monocytogenes（尤其是血清型1/2a、1/2b和4b）对人类构成严重威胁，可引起脑膜炎、败血症和发热性肠炎等系统性疾病[3]。过去十年中，李斯特菌病的死亡率一直保持在较高水平，介于20%到30%之间[4]、[5]。尽管采取了严格的控制措施，欧盟/欧洲经济区的确诊病例数仍在稳步上升，近年来的监测数据显示，疫情经常与新鲜农产品和肉类产品有关[4]、[6]、[7]。
为了控制这类生物危害，化学消毒剂在环境和工业卫生中得到广泛应用。过氧乙酸（PAA）因其广谱效力和环保特性而被广泛用作氧化性化学应力源[8]、[9]。PAA通过使蛋白质变性并破坏细胞壁通透性来有效灭活细菌并穿透生物膜[10]。具体而言，PAA的分解会产生高活性氧（ROS），主要是羟基自由基（·OH）和有机过氧基自由基，它们通过非特异性攻击细菌的关键成分（包括膜脂质、蛋白质和DNA）造成致命损伤[11]。然而，虽然高浓度的这些物质具有致命性，但在亚致死浓度下产生的强烈氧化应力可能成为推动细菌适应的强大选择压力。因此，存活下来的亚群可能会进化出具有环境抵抗力的表型。
这些生物危害的表型异质性对当前的环境监测和危害控制系统构成了严峻挑战。现有行业协议的一个关键局限性在于，它们主要针对处于“标准”浮游或指数生长状态的细菌，从而忽略了已经适应环境压力的不同亚群。在沙门氏菌 [12]、金黄色葡萄球菌 [13] 和 铜绿假单胞菌 [14] 等主要病原体中，小菌落变异体（SCVs）的形成已被广泛记录，表明它们在工程环境中构成了重要的潜在风险源。SCVs的菌落直径约为野生型（WT）的十分之一[15]，表现出显著的生理重编程——包括代谢休眠、增强的耐受性和强大的生物膜形成能力[16]。这些适应性使得传统的检测方法和消毒剂量无效，使SCVs能够作为“隐蔽”的再污染源持续存在[17]。因此，阐明工业压力下SCVs的具体特性和形成机制对于弥合当前标准与实际微生物持久性之间的差距至关重要。
本研究的目的是探讨PAA诱导的L. monocytogenes SCVs的生理和致病特性。我们特别分析了SCVs与野生型菌株（ATCC 19115）在抗逆性、生物膜形成能力和致病性（黏附性和侵袭性）方面的差异。这些发现旨在阐明PAA诱导的SCVs的毒理学适应策略，并为环境和工业系统中危害缓解方案的改进提供理论基础。
章节摘录
细菌菌株和培养条件
Listeria monocytogenes ATCC 19115菌株来自美国典型培养物收藏中心（ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。该菌株在Tryptic Soy Agar（TSA；中国北京Land Bridge Technology）上于37°C培养24小时。工作菌株通过将单个菌落接种到30毫升无菌Tryptic Soy Broth（TSB；Land Bridge）中并在37°C下以130 rpm的转速振荡培养18小时制备。细胞通过在4°C下以8000 × g离心10分钟进行收获，然后重复洗涤两次。
菌落形态和诱导效率
SCV诱导的实验过程如图1A所示。PAA处理后，观察了菌落形态。如图1B所示，野生型（WT）菌株在TSA平板上形成了典型的较大菌落。相比之下，用10、20和30 ppm PAA处理300秒的细胞形成了“针尖”状菌落（图1B a-d）。为了确认这种表型是稳定的而非暂时的生长延迟，将培养时间延长至48小时。而WT菌落则继续生长。
讨论
细菌向小菌落变异体（SCVs）的形态转变是一种关键的生存策略。除了增加检测难度外，SCVs在工程环境和公共卫生网络中还构成了固有的但尚未充分了解的风险，因此迫切需要评估其持久性和致病性。在本研究中，L. monocytogenes暴露于PAA后形成了“针尖”状菌落，且细胞大小减小。
结论
总之，本研究表明，PAA诱导的L. monocytogenes SCVs是一种多方面的毒理学反应和生存策略，由环境氧化应力驱动。向SCV表型的转变表现为代谢抑制、膜超极化和SigB介导的应激反应激活。本研究的一个关键发现是，SCV的形成不是被动失效，而是一种主动的、依赖能量的过程；存在一个最低的ATP阈值。
环境影响：
像过氧乙酸（PAA）这样的化学氧化剂被广泛用于减轻生物危害。然而，在工程环境中亚致死的PAA暴露可能会无意中将Listeria monocytogenes驱动为高度耐受的、持续存在的小菌落变异体（SCVs）。这种毒理学适应受临界ATP阈值的调控，触发代谢优先级调整——停止运动以促进强大的生物膜形成。因此，残留的化学应力源可能产生“隐蔽”的致病性。
CRediT作者贡献声明
李思静：软件处理、数据分析。张乃云：数据可视化、实验研究。段雷：资源准备、方法学设计。朱银诺：验证、方法学验证。史超：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。张子怡：监督、软件协助。于梦瑞：监督、数据分析。廖启林：监督、实验研究。杨慧：初稿撰写、资源协调、概念构思。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
本研究得到了深圳市自然科学基金（JCYJ20230807111500001和JCYJ20240813151818024）以及国家自然科学基金（32272445）的支持。
