《Advanced Science》：Natural Products Inspired Scaffold Diversification Leads to Unnatural Molecular Warhead and Covalent Strategy to Modulating Protein Function through Electrophilic Bromine Transfer
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研究人员发现了一种硫醇盐反应性的α,α-gem-二溴内酰胺（α,α-gem-dibromo lactam）弹头，可激活转录因子Nrf2并表现出抗炎活性，这对癌症、神经退行性疾病和心血管疾病具有重要意义。这些发现源于通过阿马碱（ajmalicine）和吲哚衍生的
研究人员发现了一种硫醇盐反应性的α,α-gem-二溴内酰胺（α,α-gem-dibromo lactam）弹头，可激活转录因子Nrf2并表现出抗炎活性，这对癌症、神经退行性疾病和心血管疾病具有重要意义。这些发现源于通过阿马碱（ajmalicine）和吲哚衍生的aza-氧烯丙基阳离子介导的[3+2]-环加成反应获得的新化合物。RNA测序（RNA-seq）和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）揭示了α,α-gem-二溴内酰胺的详细转录谱，表明其激活抗氧化Keap1/Nrf2通路并抑制NF-κB介导的炎症信号。研究人员证明了α,α-gem-二溴内酰胺的重要性，因为相应的α,α-gem-二氯内酰胺无法激活Nrf2通路。与含半胱氨酸化合物的化学反应表明，α,α-gem-二溴内酰胺与半胱氨酸残基反应，将亲电溴转移至靶分子，将独特的化学特性与生物学发现联系起来。与通过共价靶向Keap1的C151激活经典Nrf2通路的亲电体不同，α,α-gem-二溴内酰胺以C151非依赖的方式发挥作用，表明其具有独特的选择性和作用模式。与阿马碱相比，几种α,α-gem-二溴内酰胺的药理学特征分析显示了对肾上腺素受体的实质性差异，表明了其可调性和新型药理学。未来的研究旨在探索与人类疾病相关的二溴内酰胺弹头的基本活性。将此弹头安装到各种分子支架中可能是创建半胱氨酸反应性亲电体的通用方法。
论文解读：一种新型α,α-双溴内酰胺弹头的发现及其通过亲电溴转移调控Keap1/Nrf2通路的机制研究
研究背景与意义
天然产物及其衍生物作为共价修饰剂在药物发现和化学生物学中占据重要地位。传统的亲电弹头主要分为环张力功能基团（如β-内酰胺、环氧化物）、非张力亲电体（如α,β-不饱和羰基）以及潜伏型前药（如醌类）。然而，现有弹头在选择性、反应性及调控特定信号通路方面仍存在局限。Keap1/Nrf2通路作为细胞抗氧化和抗炎的核心防御机制，其激活依赖于Keap1蛋白中半胱氨酸残基的修饰。经典的Nrf2激活剂多为软亲电体，主要通过修饰Keap1的C151位点发挥作用。为了探索新的化学空间并开发具有独特选择性的分子工具，研究人员基于阿马碱（ajmalicine）这一复杂吲哚生物碱，利用aza-氧烯丙基阳离子介导的[3+2]-环加成反应构建了新型稠合环支架，并从中发现了一类具有新颖作用机制的α,α-gem-二溴内酰胺（α,α-gem-dibromo lactam）弹头。该研究成果发表在《Advanced Science》上。
关键技术方法
本研究综合运用了多种技术手段。首先，利用aza-氧烯丙基阳离子介导的[3+2]-环加成反应对阿马碱及四氢咔唑衍生物进行骨架多样化合成。其次，采用稳定转染的HEK293-ARE-luc细胞系进行荧光素酶报告基因检测，筛选Nrf2通路激活剂。利用RAW264.7巨噬细胞模型评估一氧化氮（NO）释放及炎症因子基因表达。通过RNA测序（RNA-seq）结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行全转录组水平的通路富集分析。在机制验证方面，使用了液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析小分子与谷胱甘肽（GSH）或N-乙酰半胱氨酸（NAC）的反应产物，并通过免疫共沉淀（Co-IP）检测NRF2的泛素化水平。此外，还利用GPCR PathHunter β-arrestin实验对化合物的脱靶效应进行了表征。
研究结果
1. 合成（Synthesis）
研究人员利用aza-氧烯丙基阳离子与阿马碱（7）或四氢咔唑底物（15）进行[3+2]-环加成反应，成功合成了新型稠合环产物。反应显示出良好的区域选择性，并通过X射线单晶衍射确定了产物的绝对立体构型。研究发现溶剂效应对反应的立体选择性有显著影响，例如在HFIP:CH2Cl2中主要生成特定非对映异构体，而在三氟乙醇（TFE）中则发生逆转。
2. 生物学研究（Biological Studies）
通过ARE报告基因筛选，研究人员从化合物库中鉴定出含有α,α-gem-二溴内酰胺基团的化合物9和20为强效Nrf2激活剂。剂量反应分析显示，两者在32 μM浓度下分别诱导约71倍和25倍的激活。相比之下，母体化合物阿马碱（7）在此实验中无活性，表明α,β-不饱和酯并非该系列化合物的药效团。在RAW264.7细胞中，化合物9和20显著抑制LPS诱导的一氧化氮（NO）产生，并上调Nrf2靶基因Nqo1的mRNA表达，同时下调NF-κB靶基因iNOS的表达，证实了Nrf2激活与抗炎活性的耦合。结构活性关系（SAR）研究表明，α,α-gem-二溴内酰胺是必需的药效团，其对应的二氯类似物或亚甲基类似物均完全丧失活性。化学反应性研究显示，α,α-gem-二溴内酰胺（如化合物18）能与硫醇亲核试剂（如NAC）发生溴转移反应，生成单溴化产物和二硫化物，且该反应需要碱性条件以促进硫醇去质子化为硫醇盐。进一步的机制研究表明，该弹头对硫醇盐具有化学选择性，且不依赖于Keap1的C151、C273或C288位点。在KEAP1突变体细胞中，化合物18仍能稳定NRF2蛋白并阻止其泛素化，表明其作用模式不同于传统的C151依赖性激活剂（如萝卜硫素SF）。RNA-seq和IPA分析进一步证实，化合物9、19和20能显著调节与Nrf2介导的氧化应激反应及异生物质代谢相关的基因，并抑制病原体诱导的细胞因子风暴等炎症信号通路。值得注意的是，针对肾上腺素受体（ADR）的GPCR谱分析显示，新型衍生物与母体阿马碱的药理学特征存在显著差异，例如化合物18丧失了拮抗活性，反而表现出对ADRA1B的选择性激动剂增强效应（PAM），证明了该支架的药理学可调性。
结论与讨论
综上所述，研究人员发现了一种新型的α,α-gem-二溴内酰胺弹头，该弹头通过独特的亲电溴转移机制与半胱氨酸残基反应，从而以不依赖于经典C151位点的方式激活Keap1/Nrf2通路，并表现出显著的抗炎活性。这一发现源于基于阿马碱的aza-氧烯丙基阳离子介导的[3+2]-环加成反应所构建的新型稠合环支架。RNA-seq和IPA分析揭示了这些小分子激活Nrf2通路并抑制NF-κB介导的炎症信号的详细转录谱。化学反应研究将独特的化学特性（溴转移）与生物学发现联系起来。SAR研究证实了α,α-gem-二溴内酰胺基团的必要性。机制研究表明了其独特的半胱氨酸依赖性和Nrf2激活模式。此外，针对肾上腺素受体的药理学特征分析表明，环加成产物改变了母体吲哚的药理学指纹图谱。这项研究不仅发现了一种具有生物学意义的化学型和反应性特征，为创造具有独特选择性模式的瞬时共价蛋白修饰提供了新的亲电弹头，也为探索其在其他疾病领域的应用奠定了基础。
