刺胞动物配体门控氯离子通道的功能分析揭示抑制性信号传导的演化

《Advanced Science》：Functional Analysis of Ligand-Gated Chloride Channels in a Cnidarian Sheds Light on the Evolution of Inhibitory Signaling

　　

摘要：γ-氨基丁酸（GABA）是脊椎动物神经系统的主要抑制性递质。快速抑制性信号传导由A型GABA受体（GABAARs）介导。虽然GABA也存在于植物和原核生物中，但其何时首次被用于快速神经元通讯尚不清楚。刺胞动物（Cnidaria）是所有两侧对称动物（Bilateria）的姐妹群，拥有多种推定的GABAARs，但均未经功能表征。本研究调查了四种刺胞动物的推定抑制性离子通道受体。系统发育分析揭示了这些受体惊人的系统发育复杂性。虽然大多数形成了刺胞动物特异性的辐射进化支，但其他受体则与两侧对称动物受体聚类。研究人员对刺胞动物辐射进化支中的七种海葵属（Nematostella）GABAARs进行了功能分析，发现无一被GABA或甘氨酸激活，而有三种被谷氨酸激活。利用定点诱变技术，研究人员确定了一个位于经典配体结合口袋中的赖氨酸残基对谷氨酸的激活至关重要。研究结果表明，刺胞动物中存在一类使用谷氨酸作为配体的抑制性离子通道受体。此外，该研究提示刺胞动物的抑制性离子通道受体经历了大规模的多样化，这可能促进了刺胞动物神经系统复杂行为和感觉处理的演化。

论文解读：刺胞动物抑制性信号传导受体的演化与功能重塑

研究背景与立项依据

兴奋性与抑制性信号的平衡是神经系统的标志性特征。在脊椎动物中，快速抑制性神经传递主要由γ-氨基丁酸（GABA）通过A型GABA受体（GABA_ARs）介导。尽管GABA广泛存在于植物和原核生物中，但其在动物界中作为快速神经递质的确切演化起源仍不明确。刺胞动物作为两侧对称动物的姐妹群，其基因组中含有大量推定GABA_ARs的同源基因，但这些受体在功能上从未被表征，且尚未在刺胞动物中鉴定出特定的GABA_AR表达细胞类型。此外，关于刺胞动物神经系统如何利用递质调节肌肉收缩和刺细胞放电的机制也存在空白。因此，解析刺胞动物中这些推定受体的真实配体及功能，对于理解抑制性信号传导的早期演化具有关键意义。

研究方法概述

研究人员通过对海葵（Nematostella vectensis）等四种刺胞动物的转录组进行分析，鉴定了推定的配体门控离子通道（pLGICs）。利用分子系统发育学方法构建了包含两侧对称动物受体的演化树。随后，研究人员克隆了七个属于刺胞动物特异性辐射进化支的受体亚基，并在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中进行了功能表达。采用双电极电压钳（TEVC）技术记录电流反应，并通过定点诱变法验证关键氨基酸残基的功能。此外，还结合了蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Blue Native PAGE）验证受体组装状态，利用单细胞转录组图谱和原位杂交技术确定受体在生物体内的表达谱。

研究结果

2.1 大多数海葵推定GABA_ARs属于刺胞动物特异性辐射进化支

研究人员在新注释的海葵转录组中鉴定出39个与GABA_AR/GlyR超家族同源的pLGICs。系统发育分析显示，绝大多数刺胞动物pLGICs（包括26个海葵受体）属于一个刺胞动物特异性的辐射进化支，这表明该类受体在刺胞动物中经历了显著的扩张。相比之下，仅有少数受体聚类于两侧对称动物GABA_ARs的姐妹群，提示了复杂的演化历史。

2.2 部分推定GABA_ARs形成同五聚体

单细胞数据分析显示，这些受体主要在POU4阳性神经元、刺细胞和触手收缩肌中表达。研究人员克隆了七个受体（命名为nvpLGIC-1至7），序列比对证实它们含有半胱氨酸环（Cys-loop）受体的典型结构域。通过非变性凝胶电泳和表面标记实验证明，这些受体能够在卵母细胞膜上组装成同五聚体（homopentamers），其组装模式与已知的人源GABA_Aβ3亚基相似。

2.3 功能表达揭示三种谷氨酸门控氯离子通道（nvGluCls）

令人意外的是，双电极电压钳实验表明，这七种受体均不被GABA或甘氨酸激活。相反，其中三种受体（nvpLGIC-1, 2, 6）可被谷氨酸强烈激活，因此被重新命名为nvGluCl-1, 2, 3。浓度响应曲线显示其半数有效浓度（EC₅₀）在微摩尔级别。离子选择性实验通过改变胞外氯离子浓度，证实这些受体是氯离子通道。此外，经典的GABA_AR开放通道阻滞剂印防己毒素（PTx）能以约10 μM的半数抑制浓度（IC₅₀）阻断nvGluCl-2的电流，证明了其孔道结构与脊椎动物受体的保守性。

2.4 决定配体敏感性的关键氨基酸残基

为了探究谷氨酸识别的分子机制，研究人员构建了同源模型并进行分子对接。分析发现，配体结合口袋中环C上的一个赖氨酸残基（K229）在三种谷氨酸敏感受体中高度保守，而在非谷氨酸敏感的受体中则不存在。将K229突变为苏氨酸（Thr）或精氨酸（Arg）后，受体对谷氨酸的反应几乎完全丧失，证实了该残基在稳定谷氨酸α-羧基中的关键作用。分子动力学模拟进一步揭示了K229通过氢键网络间接稳定配体的机制。

2.5 刺胞动物特异性pLGICs在特异性细胞类型及神经元中表达

单细胞图谱和原位杂交结果显示，三种nvGluCls主要在触手的特定细胞类型中表达，包括刺胞动物特有的刺丝囊细胞（spirocytes）和触手收缩肌。双重荧光原位杂交进一步证实，nvGluCl-1和nvGluCl-3在Elav1阳性的神经元中表达，而nvGluCl-1和nvGluCl-2在POU4阳性的细胞（包括刺丝囊细胞）中表达。这些空间分布特征表明，这些受体可能参与调控触手的捕食行为。

结论与讨论

本研究揭示了刺胞动物抑制性pLGICs复杂的系统发育关系。虽然两侧对称动物的GABA_ARs形成了一个单系群，但刺胞动物中的同源受体却经历了一个大规模的特异性辐射扩张。功能分析表明，在海葵中测试的多个推定GABA_ARs实际上是谷氨酸门控的氯离子通道（GluCls），这一发现挑战了基于序列相似性预测配体特异性的传统假设。研究证实，谷氨酸作为一种古老的候选递质，在刺胞动物的抑制性信号传导中扮演了核心角色，且其结合口袋的关键残基与后口动物及线虫的GluCls存在趋同演化现象。此外，这些受体的表达谱与其在触手运动和摄食行为中的潜在功能相一致。这项工作不仅填补了无脊椎动物抑制性受体功能数据的空白，也为理解动物神经系统抑制性突触传递的演化历程提供了关键节点证据。该研究发表于《Advanced Science》。