综述：健康与疾病状态下心脏起搏活动的调控

《Journal of Physiology》：Regulation of cardiac pacemaking activities in health and disease

　　

人类心脏每分钟跳动60–80次，一生中可达超过30亿次心跳。每一次心跳均由窦房结（SAN）发起，SAN是一种高度复杂的结构，由能够自发产生动作电位（APs）并传导至整个心脏的特殊细胞组成。其自动节律性受离子通道和转运体的协调调控，这些分子构成了膜钟和钙钟，统称为“耦联钟”（coupled clock）。其活动受到自主神经和激素信号通路的严密调控，其中最显著的是β-肾上腺素能受体（β-AR）信号通路，该通路通过激活腺苷酸环化酶（AC）及随后产生3',5'-环磷酸腺苷（cAMP）来提高心率。相反，通过毒蕈碱M2受体的副交感神经信号会降低cAMP水平并激活内向整流钾电流，从而减慢起搏活动。本篇专题综述讨论了涵盖健康与疾病状态下SAN调控机制的最新文献，包括儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速等心律失常综合征、自身免疫性心脏离子通道病以及心力衰竭（HF）中的SAN功能障碍。HF中的SAN功能障碍（SND）常表现为心动过缓，这一并发症显著增加了HF患者的发病率和死亡率，并带来了心源性猝死的风险。近期研究支持了线粒体-肌质网连接组学（mitochondrial–sarcoplasmic reticulum connectomics）在HF常见SND中的作用，这些作用此前未被认识到。此外，还将讨论在SAN中优先表达并区室化以行使特殊功能的独特AC亚型的作用。最后，综述将探讨生物起搏器开发的最新进展。

引言

窦房结（SAN）作为心脏的主要起搏器，其固有的自动节律性启动每一次心跳。SAN作为核心起搏器的关键功能依赖于其鲁棒性、持久性及精细协调的活动。SAN功能障碍（SND）与危及生命的心动过缓相关，并使患者易发生心房颤动（AF）和心力衰竭（HF）等严重病症。随着人口老龄化，SND的负担持续加重，凸显了其对患者结局的重大影响。作为神经系统与心脏之间的主要接口，SAN在整合自主神经信号与心脏起搏活动中发挥核心作用。SAN调控的复杂性为脑-心及更广泛的器官轴相互作用提供了独特的切入点。尽管SAN被公认是心脏的中枢起搏器，但其功能调控的精确机制仍未完全阐明。本综述旨在探讨SAN功能的多面性调控，总结起搏活动如何受胞外和胞内信号调节，以及代谢和线粒体功能如何影响这些过程。同时强调了HF、心律失常综合征、衰老及癌症等不同临床背景下SND的机制基础，并讨论了新兴的实验模型和创新的治疗策略。

SAN生理学与心脏起搏机制

SAN解剖学与细胞构成：SAN是一个细长的多房室复合体，嵌入右心房壁，沿界嵴分布。它由位于上腔静脉与右心房之间的上部“头”部和延伸至界嵴与下腔静脉的下部“尾”部组成。这些区域在细胞密度、组织和传导界面上存在差异，反映了SAN内部的结构和功能性异质性。SAN包含多种细胞类型，其核心功能由表达超极化激活环核苷酸门控（HCN）通道的特殊起搏细胞承担。这些细胞与成纤维细胞、脂肪细胞、免疫细胞、血管相关细胞及神经支配相关细胞一起，嵌入结缔组织束中，部分隔离周围心房肌的电活动，同时允许电冲动传导的明确出口路径。

缓解SAN中源-汇不匹配的机制：作为产生电流的初级“源”，SAN起搏细胞相较于作为巨大“汇”的周围心房肌，体积更小、数量更少且耦合较弱。这种源-汇不匹配对起搏脉冲的有效产生构成了挑战。为确保可靠传导，SAN进化出了特殊的结构和组织适应性。解剖学上，其沿界嵴延伸弯曲的形状有助于起搏电流的有效分布。在组织层面，成纤维细胞和结缔组织部分隔离了起搏细胞与周围的心房汇，减少了SAN的电负荷。细胞异质性进一步促进了可靠传导，外周SAN细胞表现出起搏和心房特性，形成了连接核心SAN与心房肌的过渡缓冲。在分子水平上，SAN优先表达低电导连接蛋白，导致细胞间弱耦合，从而保护起搏细胞。这些适应性共同使SAN克服了源-汇不匹配，实现电冲动向心房的可控传播。

耦联钟系统：起搏细胞通过多种内向电流和肌质网（SR）的局部钙释放（LCRs）表现出独特的自发性舒张期去极化。内向电流包括由HCN通道携带的“ funny”电流（I_f）、通过L型和T型钙通道的钙电流（I_Ca,L, I_Ca,T），以及钠钙交换体（NCX）在钙排出期间产生的内向电流。随着舒张期去极化的进展，Ca_v1.3介导的I_Ca,L（在某些SAN细胞中还有I_Ca,T）在舒张晚期激活，进一步驱动膜电位达到动作电位（AP）生成的阈值。复极化通过多种钾通道的激活实现，包括延迟整流钾通道，使膜电位恢复到舒张水平并允许循环重复。这套节律性的电压依赖性肌膜离子通道和转运体构成了“膜钟”。与此同时，通过T型和L型钙通道进入的钙有助于通过SR钙-ATP酶（SERCA）进行SR钙 refill。随着SR钙负荷增加，ryanodine受体2（RyR2）介导的LCRs发生。其时机反映了SR钙循环以及与膜钟活动的耦合，包括通过Ca_v1.3通道的钙内流。由SERCA依赖性refill驱动并随之发生RyR2介导LCRs的振荡性SR钙循环被称为“钙钟”。LCRs增加肌膜下钙，激活NCX并产生加速晚期膜去极化的内向电流。膜钟调节SR钙负荷，而钙钟塑造膜去极化的时机；两者共同构成耦联钟系统，产生节律性、自我维持的起搏脉冲。

SAN内的异质性：SAN具有固有的异质性，在其组织结构、细胞构成、分子特征、遗传调控和行为功能上表现出多样性。最近的进展，特别是单细胞和多组学空间技术，提供了以前所未有的分辨率检查这种异质性的工具。这些方法现在允许详细表征起搏细胞多样性和区域特异性组织架构。人类SAN研究确定了成纤维细胞身份、细胞外基质（ECM）组成和结缔组织结构的显著区域差异。计算研究表明，细胞和分子异质性对于鲁棒的SAN功能至关重要，成纤维细胞和结缔组织增强了SAN的驱动能力，而I_f、I_Na和腺苷A1受体的表达梯度支持稳定的起搏活动。此外，单细胞转录组学已经生成了第一个哺乳动物SAN图谱，鉴定了多个起搏亚群并确认了Vsnl1作为小鼠SAN富集标记物。并行的人类单细胞研究确定了CD34作为人类起搏心肌细胞的标记物，并揭示了三个主要的起搏亚群：核心起搏细胞、过渡细胞和窦静脉样细胞。这些发现表明SAN功能依赖于跨结构、细胞、亚细胞和分子水平的协调异质性。

ECM的作用：除了提供结构支持外，ECM在心脏生物学中发挥积极的调节作用，影响传导、机械行为及对应激的反应。SAN的ECM具有独特的专一性，含有较高比例的纤维状胶原蛋白和弹性蛋白，表现出比心室ECM更大的刚度和异质性。这些复合材料可能减少施加在起搏肌细胞上的机械应变和力传递，从而保护肌细胞并支持节律活动。同样，人类SAN也比周围工作心肌含有更大比例致密的结缔组织。在衰竭心脏中，这一比例显著增加，并伴有肌成纤维细胞的出现和纤维化相关ECM蛋白（如骨膜蛋白POSTN和软骨中间层蛋白1 CILP1）的上调。这种ECM重构可能导致SND的发展。最近的实验工作进一步强调了SAN ECM的功能重要性。人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的起搏心肌细胞（hiPSC-PCMs）在SAN ECM而非心室ECM上培养时，会自组织成簇，重现原生SAN组织的关键特征。它们表现出更高的起搏特异性基因（如HCN4、T-box TBX3、TBX18）表达，并显示更强健的自发自动性。重要的是，只有SAN ECM能在机械应力下保持自动性，强调了其在支持起搏功能中的关键作用。

SAN自动性的调控

自主神经系统（ANS）的调节：尽管SAN凭借其固有的自动性可产生自发节律，但其活动受到ANS的精细调节，使心率能根据生理需求动态调整。ANS对SAN的调节主要通过交感神经和副交感神经通路实现。交感神经通过β-肾上腺素能受体刺激加速起搏放电，增加cAMP，增强I_f和L型钙电流（I_Ca,L），并促进钙循环。相反，通过M2毒蕈碱受体的副交感神经刺激通过激活G蛋白偶联的内向整流钾电流（GIRK, I_K,Ach）并减少cAMP介导的电流来减慢放电。利用3D组织透明化和高分辨率成像绘制SAN神经支配的详细架构表明，SAN不仅受外在自主输入的调控，还受内在神经元回路与外在纤维之间复杂相互作用的塑造。多尺度建模将神经放电模式、毒蕈碱受体信号和I_K,Ach激活与SAN膜电位和心率控制联系起来，强调I_K,Ach是副交感神经调节的主要膜钟效应器。

膜钟的调控

膜钟受直接影响通道（如HCN4、Ca_v1.2、Ca_v1.3、Ca_v3.1和钾通道）可用性和电流幅度的机制调控，从而塑造膜去极化和复极化。在离子通道中，HCN4在舒张期去极化中起主导作用，并受多层调控。HCN4的运输和表面表达受棕榈酰化等翻译后修饰以及与内质网蛋白的异构体特异性相互作用调控。生长因子和代谢信号通路在生理和应激条件下进一步调节HCN4的膜定位。在疾病和衰老模型中，非编码RNA和炎症重构诱导HCN4表达的变化，导致起搏稳定性改变。此外，人类HCN4突变和药理学调节剂（如伊伐布雷定）的见解表明，即使通道门控或可用性的微小改变也会转化为临床相关变化。在分子水平上，HCN4的内在门控表现为S4电压传感器的两步移动，第二次构象变化直接控制通道开放。虽然不直接参与逐拍膜去极化，但转录稳态通路（如Hippo-Yap和昼夜节律控制）和表观遗传机制设定了基础HCN4表达，从而有助于维持SAN自动性。电压门控钙通道（VGCCs）如L型Ca_v1.2/1.3和T型Ca_v3.1驱动SAN细胞晚期舒张期去极化和AP起始，使其成为起搏节律的关键决定因素。此外，它们是膜钟和钙钟之间的功能连接，触发LCRs。尽管如此，由于SAN的低表达水平和异质性，VGCCs的调控仍研究不足。先前的研究表明，Ca_v1.3受蛋白激酶A和C（PKA, PKC）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的磷酸化和选择性剪接调控。这些调节改变了它们的激活、失活和电流幅度，从而塑造SAN去极化。全面理解VGCC调控机制对于整合其与其他离子通道及整体耦联钟机制的作用至关重要。钾通道通过在塑造AP复极化和稳定起搏节律中也起着关键作用。K_v1家族通道（如超快速延迟整流钾电流I_Kur）和瞬时外向钾电流（I_to）调节AP复极化的早期相并贡献于固有起搏频率，在疾病或药理干预中可观察到改变。快速和缓慢激活的延迟整流钾电流（分别为I_Kr, I_Ks）决定了复极化晚期相和最大舒张电位（MDP），从而在生理条件下稳定SAN节律。除复极化外，I_Kr也有助于舒张期去极化，因为它在复舒张期去激活，增加舒张早期的净内向电流。I_Kr阻滞剂E-4031可使MDP去极化，延长复极化并减慢周期长度，同时继发性降低其他起搏电流（如I_f, I_Ca,L）的激活。GIRK/I_K,ACh电流提供了自主神经信号与SAN兴奋性之间的联系。最近的研究表明，GIRK通道活性可受副交感神经输入、妊娠、脓毒症或药理抑制的调节，所有这些都可改变心率和起搏器稳定性。此外，结蛋白等结构蛋白通过维持适当的细胞骨架组织来调节钾通道的定位。总的来说，钾通道整合了固有的电压门控特性，以微调SAN的膜钟动力学。

钙钟的调控

SR内的节律性细胞内钙循环对SAN的自动性至关重要。钙钟受多层调控，决定了其速率、时间协调性以及在驱动膜去极化方面的有效性。SR钙循环动力学（如LCRs的时间和同步性）和细胞结构调节SAN细胞中的钙钟行为。基础钙钟速度受cAMP信号和β肾上腺素能刺激严密调控。此外，钟动力学取决于钙循环蛋白的磷酸化，受PKA和CaMKII动态调节。同时，LCR的频率取决于关键SR钙循环蛋白（包括SERCA、RyR2和受磷蛋白PLB）的表达和分布。诸如SERCA活性降低或激酶信号受损等扰动会通过降低调节灵活性和适应范围来减慢钙钟。此外，氧化应激进一步修饰激酶敏感性和SR钙处理，导致细胞内钙循环和膜电流的重构。除了频率，LCR的时间和同步程度也关键地决定了钙钟的效率和稳定性。结构性和功能性研究表明，SAN中的RyR2通过junctophilin2锚定在特殊的微域中，并被组织成等级簇，其大小和空间排列决定了LCR的概率、振幅和时间一致性。此外，RyR2、SERCA和NCX之间的局部串扰进一步稳定了LCR的时间，而CaMKII依赖性磷酸化根据细胞内钙负荷动态调整RyR2敏感性和不应期。此外，区室化的信号通路，包括cAMP和IP₃依赖性机制，微调LCR时相和同步性。总之，这些机制将随机的钙释放转化为一个鲁棒、协调的钙钟。

膜钟与钙钟的耦联

膜钟和钙钟是两个独立的系统，但共同需要产生起搏活动。它们的协同相互作用产生固有的自动性，没有哪个钟占主导地位。一个时钟的中断会增加对另一个的依赖，但仅靠任何一个系统都不足以维持稳定的起搏活动。机制上，通过VGCCs进入的钙触发LCRs，进而激活NCX产生加速膜去极化的内向电流。时钟耦联受β-肾上腺素能信号动态调节。cAMP升高增强LCR同步性、NCX电流和膜离子通道可用性，而腺苷引起的cAMP降低可使两个时钟解耦，导致心动过缓。因此，固有的SAN自动性反映了细胞内钙和膜离子通道过程的动态和情境依赖性整合。鲁棒性和塑性源于相互的、可调的耦联，而不是单一的振荡器，确保了SAN的耐久性和安全性系数。

SAN活动的昼夜节律调节

基于驱动SAN自动性的耦联钟系统，昼夜节律调节进一步调节起搏功能，产生可预测的心率昼夜变化。下丘脑的视交叉上核（SCN）作为主钟，主要通过ANS将心血管功能与光暗周期同步，白天交感神经张力较高，夜间副交感神经张力增强。除了神经输入，SAN拥有由局部时钟基因（包括BMAL1、CLOCK、PER和CRY）控制的固有昼夜节律，这些基因驱动离子通道表达和功能的日常振荡。此外，SAN中的昼夜节律调节延伸至离子通道之外，涉及代谢通路、线粒体功能、细胞应激反应和转录调控的协调控制。重要的是，基线节律生成的昼夜控制和对心律失常的易感性虽相关但在机制上是可分离的过程。总体而言，这些发现表明昼夜定时是SAN自动性调节的重要层级，影响心率和起搏稳定性。

β-肾上腺素能信号与腺苷酸环化酶（AC）

SAN中的β-肾上腺素能受体：SAN表达多种β-肾上腺素能受体（β-ARs），以β₁-ARs为主，其次是β₂-ARs，而β₃-ARs表达水平较低。β-AR信号的相对表达模式和功能贡献似乎是物种依赖性的。在人类SAN组织中，定量放射自显影显示总β-AR密度约为邻近心房肌的3.5倍，β₁-AR和β₂-AR密度分别高出约4.2倍和2.6倍。与工作心肌相比，SAN细胞还表现出更高的基础cAMP水平以及升高的PKA和CaMKII活性。这些固有特征使SAN对肾上腺素能刺激敏感，突出了β-AR信号在心脏起搏活动调节中的意义。β₁-AR通常被视为主要负责SAN的正性变时反应。激活后，β₁-ARs偶联Gs蛋白，刺激AC并增加细胞内cAMP。经典的AC-cAMP-PKA信号级联在加速SAN放电中起核心作用。除激活PKA外，cAMP直接结合HCN4通道，使其激活向去极化电位移动，从而增强电流。β₁-ARs的下游效应物包括多个膜和钙处理组分，如I_Ca,L、I_Kr、I_Ks、RyR、PLB和SERCA。通过促进更早、更大和更同步的LCRs，β₁-AR刺激增强耦联钟的活动，增加膜去极化对钙的依赖性，并加强两个时钟系统之间的功能耦联。在临床前模型中，β₁-AR敲除显示出显著降低的变时储备，应激条件下峰值心率比野生型动物低约200次/分钟，尽管静息心率接近正常。结果支持β₁-AR是SAN功能最大交感加速的主要决定因素。β₂-ARs丰度低于β₁-ARs，但与周围心房肌相比在SAN中相对富集。它们通过Gs和Gi蛋白发出信号。Gs偶联增强cAMP产生，而Gi偶联通过PKA磷酸化抑制AC活性并限制cAMP扩散。这种动态的双重偶联使β₂-ARs能够微调起搏活动并防止过度或长期的cAMP升高。重要的是，β₂-AR的相对功能贡献在某些非人类物种中可能更大。在兔SAN肌细胞中，选择性β₂刺激比β₁刺激对I_f激活产生更大的正移和更大的速率增加。此外，β₂-ARs通常局限于小窝微区，允许在离散微区内进行空间受限的信号传导，具有更高的功能特异性。β₃-ARs在SAN中低水平表达，其在起搏中的功能作用仍知之甚少。

SAN中独特的AC亚型：β-AR刺激增加全局cAMP水平，但SAN功能的精确调控依赖于局部cAMP微区，这些微区由钙敏感AC产生，整合局部钙与全局β肾上腺素能信号。虽然AC5和AC6是心房和心室肌细胞中的主要亚型，但AC1和AC8代表了调节起搏活动的主要钙依赖性亚型。它们充当“重合检测器”，将主要源于IP₃受体介导的钙释放的细胞内钙转化为空间受限的cAMP产生。这种局部cAMP信号随后调节下游起搏离子通道，包括HCN和L型钙通道，从而加速膜去极化并稳定节律性放电。特别是，AC1与HCN4形成功能微区，而RyR2和L型钙通道与其他AC亚型以及AC1区室化。药理学抑制AC1可选择性减弱钙和IP₃依赖性SAN放电调节，而不抑制全局cAMP信号。实验操作这些通路强调了其生理重要性，因为AC8的过表达显著增加心率并破坏节律，表明cAMP产生失调可致心律失常。总之，这些发现支持钙激活AC协调细胞内钙以调节SAN自动性和心率的模型。

cAMP信号区室化的关键作用：作为一种调节众多细胞过程的普遍第二信使，cAMP在起搏活动中起关键作用。cAMP的产生主要由ACs介导，其亚型选择性表达于亚细胞区室并受上游信号（包括G蛋白和细胞内钙）严密调控。先前的研究表明，AC1和AC8位于SAN肌细胞膜或连接SR附近，在那里它们将局部钙瞬变转化为cAMP产生。这产生了靠近关键靶点的高cAMP浓度微区，而不会显著改变全局胞质cAMP水平。cAMP的降解由磷酸二酯酶（PDEs）介导，PDEs也选择性区室化于不同的亚细胞区域。PDEs充当“扩散屏障”，限制cAMP在其产生部位，并塑造局部信号的幅度和持续时间。在心脏起搏细胞中，多种PDE亚型（PDE1-PDE4）促成这种空间控制。例如，PDE3和PDE4被战略性地锚定在HCN通道、L型钙通道或β-AR复合物附近。特别是PDE3受PKA磷酸化抑制，提供了局部β-肾上腺素能信号的feedforward放大，而PDE4通过A-激酶锚定蛋白（AKAPs）锚定，允许对cAMP降解进行严格的时间和空间控制。同时，钙/钙调蛋白激活的PDE1A位于HCN4微环境附近，并在脂质筏富含域外形成局部PDE屏障，钙激活的ACs在此产生cAMP。除cAMP选择性PDEs外，cGMP的升高也可参与重塑局部cAMP的PDE通路。具体而言，cGMP可激活PDE2并抑制PDE3，产生对cAMP水解的情境依赖性改变。PDE2抑制改变了SAN肌细胞的AP放电，支持PDE2在调节起搏电生理中的功能作用。总之，PDEs的局部活性塑造了cAMP瞬变的幅度和动力学，限制了cAMP的功能区域，并最大限度地减少了β₁-和β₂-肾上腺素能信号之间的串扰。ACs的局部cAMP产生与PDEs的靶向降解之间的相互作用建立了功能微区，实现对起搏的精确调节。这种平衡的破坏，通过PDE抑制或AC错位，可导致异常的cAMP扩散和致心律失常活动。因此，信号通路的亚细胞区室化可能在开发具有空间特异性和最小化脱靶效应的疗法方面具有巨大潜力。

SAN中的代谢与线粒体功能：除了cAMP信号在亚细胞微区内的空间组织外，β-肾上腺素能信号还延伸至细胞内代谢区室，确保起搏活动的增加与足够的能量供应相匹配。β₁-和β₂-ARs的激活升高cAMP及其效应物PKA和EPAC（cAMP激活的交换蛋白），进而调节线粒体功能。β-肾上腺素能刺激通过磷酸化电子传递链组分和相关蛋白增强线粒体氧化代谢。同时，增加的胞质钙进入和SR钙循环促进线粒体通过线粒体钙单向转运体摄取钙，激活三羧酸循环的钙敏感脱氢酶并增加NADH产生。这些协调效应加速ATP合成，从而将β-肾上腺素能刺激与SAN的代谢需求耦合起来。重要的是，线粒体也积极塑造β-肾上腺素能信号的效能和保真度。通过缓冲细胞内钙，线粒体影响AC1和AC8激活所需的微区。线粒体活性氧进一步通过修饰受体偶联、AC活性和PDE功能来调节β-肾上腺素能信号，而ATP产生为cAMP合成和下游激酶信号提供能量底物。因此，在衰老和心脏病中观察到的线粒体功能改变会通过扰乱钙处理、氧化还原平衡和能量可用性而破坏β-肾上腺素能反应，最终损害SAN自动性和变时储备。

病理改变与临床相关性：在HF和衰老等病理条件下，SAN中的β-肾上腺素能系统经历多种适应性不良改变，损害起搏功能。β-AR在衰竭和衰老的SAN组织中下调，降低了SAN对交感刺激产生cAMP的能力。同时，G蛋白偶联受体激酶（GRKs）的上调促进慢性β-AR磷酸化，导致受体脱敏。此外，β₂-AR可能从其小窝微区迁出，改变空间特异性。β-AR的重构可能最初保护心脏免受儿茶酚胺过度刺激，但最终会减弱肾上腺素能反应性并限制SAN的功能储备。在cAMP降解水平上，PDE4D活性增加导致过量的局部cAMP降解，削弱β-肾上腺素能对SAN起搏活动的调节并增加致心律失常性。病理性丢失或重新分布PDE3进一步允许cAMP绕过调节检查点，促进异步钙释放并导致SND。此外，正常情况下维持cAMP区室化的PDE3和PDE4之间的功能协调在衰竭的SAN中被破坏，导致LCRs组织紊乱和起搏活动失败。理解SAN中cAMP信号的区室化有助于解释为什么传统疗法如β受体阻滞剂经常产生不可预测的心动过缓或变时功能不全，特别是在老年患者中。对SAN β-肾上腺素能调节的机制洞察可以支持开发更具选择性的治疗策略，包括靶向特定的钙敏感ACs或PDEs。与心房和心室肌细