使用离子导入技术研究二氯芬酸钠外用离子溶液在雄性白化大鼠体内的体外和体内效果

《Advances in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences》：Study of Ex Vivo and In Vivo Effect of Topical Ionic Solution of Diclofenac Sodium in Male Albino Rats Using Iontophoretic Technique

　　**摘要**

**背景**
本研究旨在通过开发一种定制的离子导入装置来克服经皮药物输送的局限性，从而快速增加非甾体抗炎药（NSAIDs，如双氯芬酸钠[DS]）的输送效果。

**方法**
准备了三种浓度的DS外用溶液。设计了一种定制的离子导入装置，用于体外、离体和体内研究该装置对DS外用溶液释放的影响。

**结果**
使用离子导入装置时，DS的释放量与药物浓度及施加的电流成正比：2.0%的溶液比1.5%和1.0%的溶液显示出更明显的药物释放效果。同样，在5 mA电流下，DS的释放速率明显高于1 mA电流。在体外实验中，2%浓度的DS显著减小了大鼠爪子的体积，与体内对照组和被动对照组相比有显著差异。

**结论**
这些结果在体外和体内研究中的一致性强调了这种离子导入技术的有效性和临床前概念验证。尽管这些结果令人鼓舞，但仍需进一步研究长期皮肤耐受性和刺激性，以确定其在人类用药中的安全性。这项工作为非侵入性药物输送系统的进一步开发奠定了坚实的基础，为改善治疗效果提供了有前景的方法。

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**1. 引言**
非甾体抗炎药（NSAIDs）是最受欢迎的处方外用药。它们广泛用于治疗疼痛、炎症和其他肌肉骨骼疾病。据估计，每年大约5%–10%的处方药物是NSAIDs [1, 2]。尽管NSAIDs存在胃肠道出血、高血压和肾脏损伤等副作用，但它们仍被认为是治疗轻度至中度疼痛的一类主要药物 [3, 4]。NSAIDs通过抑制环氧化酶（COX-I和COX-II）来阻止炎症反应 [5–8]。在传统剂型（如片剂）中，长期高剂量使用会加剧NSAIDs的副作用 [7]。双氯芬酸钠是最常用的NSAIDs之一，以钠盐或钾盐的形式存在，有多种剂型，包括片剂、胶囊、注射剂、缓释剂型和外用制剂 [8–11]。双氯芬酸钠的外用治疗尤其受到青睐，尤其是传统凝胶和/或乳膏，因为它们可以减少全身副作用并提高患者的依从性。其主要缺点是药物渗透性较差，这影响了其疗效 [12, 13]。经皮药物输送系统（TDDS）是一种将药物以受控速度输送到体内循环系统的皮肤应用方法，以确保长期的治疗效果 [14, 15]。皮肤是TDDS中的关键组成部分，是最大的器官，能够促进多种药物剂型的应用，提供局部和全身效应。然而，TDDS的主要限制是药物难以穿透角质层 [16, 17]。为了克服这一障碍并提高药物通过皮肤膜的渗透性，人们设计了多种策略，包括化学增强剂和/或物理方法，如声波导入、电穿孔和离子导入 [13, 15]。其中，离子导入被认为是一种最合适、无创且局部化的技术 [12, 18]。它通过向电解质溶液中施加直流或周期性电流来运输离子或带电分子。离子溶液的极性选择适当，使得离子化药物分子在电流作用下穿过生物膜 [19]。通常，施加低电压电流（0.5 mA/cm2）可以改善药物在皮肤中的传输，因为安全标准低于0.5 mA/cm2，可以防止皮肤刺激和不可逆损伤 [13]。该技术常用于输送不同类型的麻醉剂和NSAIDs [16, 20]。本研究旨在开发一种定制的离子导入装置，用于快速输送双氯芬酸钠（DS），有效治疗疼痛和炎症。通过多种体外、离体和体内实验验证了该装置的适用性，为其未来的临床应用做好准备。

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**2. 材料与方法**
2.1. 材料
双氯芬酸钠（DS）由Barrett Hodgson Pakistan Pvt Ltd.提供/捐赠。二甲基亚砜和丙二醇从Sigma-Aldrich购买，乙醇从BDH-AnalaR购买。本研究中使用的所有其他溶剂/化学品均为分析级，纯度极高。所有制备过程均使用新鲜制备的去离子水。

2.1.1. 动物
共购买了42只体重约150–200克的雄性白化Wister大鼠，来自当地供应商。实验前，这些大鼠在Baqai医科大学的动物房中饲养24小时，环境温度控制在25±2°C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。实验期间，所有大鼠均可自由摄取商业饲料颗粒和水。所有研究程序和方案均获得Baqai医科大学伦理委员会的批准（参考编号：BMU-IREB/09/2024/015）。

2.2. 方法
2.2.1. 通过FTIR光谱法测定DS
通过FTIR光谱法确认了纯DS的身份和纯度。使用Nicolet iS5光谱仪（ThermoFisher Scientific Inc., USA）配备的钻石晶体ATR（Smart iTR）采样组件收集光谱数据。在4500至700 cm?1范围内进行了64次扫描，分辨率设置为4 cm?1，并通过内置的Omnic软件（版本9）进行处理。

2.2.2. pH值测量
使用pH计（Accumet, AR10, Fisher Scientific, USA）上的玻璃电极和温度探头分别测量外用溶液的pH值和温度。使用pH值为4.0和7.0的市售缓冲片剂（Merck, Germany）在去离子水中配制100 mL溶液，用于在室温（25±2°C）下校准仪器。将玻璃电极直接浸入外用溶液中几秒钟以达到平衡。根据需要，使用氢氧化钠（0.1 M）或盐酸（0.1 M）溶液将外用溶液的pH值调整至7（±0.1）。

2.2.3. DS外用溶液的制备
将所需量的DS溶解在DMSO中，然后在带塞的玻璃容器中用磁力搅拌器在室温（25±2°C）下搅拌20分钟，直至形成透明无色溶液。DS外用溶液的组成见表1。搅拌过程中加入适量的丙二醇（PG），继续搅拌10分钟，随后加入乙醇并继续搅拌10分钟。在混合过程中分次加入水，并根据需要使用0.1 N HCl/NaOH调整溶液的pH值。调整pH值后，彻底搅拌10分钟，再用剩余的水补足体积。最终搅拌10分钟，直至溶液温度达到室温（25±2°C）。

表1. DS外用溶液的不同组成
| 成分 | 百分比（w/v） |
|-------|---------|
| DS | 1.0 |
| DMSO | 20 |
| PG | 20 |
| 乙醇 | 20 |
| 水 | 39 |

所有外用溶液均在统一条件下制备，并储存在避光的无菌容器中，室温（25±2°C）。定期检测这些溶液的感官变化。

2.2.4. 测定方法的验证
使用双光束紫外-可见光谱仪（UV-1601, Shimadzu, Japan）和10毫米光程的石英比色皿进行吸光度和光谱测量。所有光谱测量均在室温（25±2°C）下进行。仪器自动校准波长刻度，吸光度刻度定期使用以下标准进行校准 [21, 22]。

2.2.5. 硫酸中的重铬酸钾（0.050 g/L，浓度为0.01 N）
- 波长：257 nm 和 350 nm
- 吸光度：0.723 和 0.536（±0.01）

2.2.6. 醋酸缓冲液中的核黄素（pH 4.0）
- 波长：444 nm
- A（1%，1 cm）：328

2.2.7. DS的测定方法
从药物溶液（浓度为1%、1.5%或2%）中吸取1 mL样品，转移到25 mL容量瓶中，加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.4），持续振荡10分钟。然后用0.45 μm膜过滤器过滤溶液。根据Bucci等人的方法进行分光光度测定，稍作修改 [23]。以磷酸盐缓冲液作为空白对照，在276 nm处测量样品的吸光度。根据国际协调委员会（ICH）指南 [24] 重新确定了方法的线性、范围、重复性和灵敏度。使用100 mL磷酸盐缓冲液配制的DS标准溶液（浓度范围5–30 μg/mL）进行验证。对DS测试溶液（浓度为1.0%–2.0%）也进行了相应的准确性和精度测定。

2.2.8. 离子导入装置的设计与开发
该装置是独特设计的，组件选择基于其预期功能。表2列出了先前报道的离子导入系统与所提出的定制Arduino装置的比较分析。典型的框图和离子导入装置分别见图1(a)和图1(b)。装置中使用的组件及其功能如下：

**表2. 离子导入输送系统的比较分析**
| 特征类别 | 实验室规模/通用电源 | 提出的定制Arduino装置 |
|----------------|------------------|----------------------|
| 经济可行性 | 中等：（100–300美元）但需要额外外设 | 极低成本：（<50美元）使用现成组件 |
| 电路架构 | 线性或开关式直流调节（恒定电压） | 基于开源微控制器的PWM/恒定电流 |
| 电流调节 | 手动电压调节；皮肤电阻变化可能导致电流波动 | 集成电位器（1–5 mA）配合主动数字反馈 |
| 安全机制 | 无：电阻波动可能导致皮肤灼伤 | 双层安全机制：物理紧急按钮+软件警报 |
| 数据透明度 | 需要外部万用表 | 实时遥测：内置LCD显示毫安、电压和时间 |
| 便携性和电源 | 低：台式；需要交流电源 | 高：模块化电源，支持锂离子电池或USB-C接口 |
| 验证方法 | 需要手动外部验证 | 自动验证：内置电流表实时确认剂量 |

**图1 (a)** 离子导入系统的典型框图
**图1 (b)** 离子导入装置

2.2.8.1. 液晶显示器（LCD）
LCD主要用于显示设备的运行状态和其他组件的工作情况。该装置安装了16×2英寸的LCD，具有I2C接口。

2.2.8.2. Arduino
Arduino是一个基于易于使用的硬件和软件的开源电子平台。其功能是读取输入信号（如光线、按钮按压或Twitter消息），并将其转换为输出信号（如激活电机、点亮LED或在线发布信息）。可以通过Arduino编程语言（基于Wiring）和Arduino软件（IDE）向微控制器发送指令。所有实验中电流密度保持恒定。

2.2.8.3. 电位器旋钮
电位器是一种可提供可变电阻的旋钮，其电阻值可被读取到Arduino板上。通过电位器可以调节电压（电流）。

2.2.8.4. 计时器旋钮
计时器旋钮用于设置时间间隔。在Arduino中，它用于测量事件的时间间隔。8位定时器被用于音调功能。

2.2.8.5. Arduino蜂鸣器
压电蜂鸣器是一种可以直连接到Arduino上的微型扬声器。压电效应是指某些晶体在通电时会改变形状的现象。通过施加适当频率的电信号，晶体可以发出声音。

2.2.8.6. LED
当电路运行时，LED会亮起；当电路停止工作时，LED会熄灭。

2.2.8.7. 电源和紧急按钮
在LCD上安装了一个电源按钮，用于激活和关闭设备。还安装了一个紧急关闭按钮，并连接到Arduino电路中，以便在紧急情况下停止设备运行。

2.2.8.8. 操作按钮（开/关开关）
安装了一个操作开关，并连接到Arduino电路中，专门用于设备的启动。通过电位器和定时器设置好操作参数后，按下该按钮即可启动设备。

2.2.8.9. 安培计（电流表）
安培计是一种用于测量电路中正负两端电流的仪器。使用了一款MT87数字万用表（中国制造）来检查电路中的直流电是否正常流动，以确保安全。在1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mA处设置了检查点，通过连接安培表的端子来进行设备校准。该离子导入设备设计为能够输送1-5 mA范围内的电流。在每个设定点，电流波动范围约为1-5 mA ± 0.2 mA（0.02标准差）。根据电极与皮肤的电阻（通常为1-10 kΩ），所需的电压大约在5到50 V之间。电路会自动调整电压以保持设定的电流，这可以通过不同的时间间隔手动检查药物输送情况。总体而言，电压在5分钟内保持稳定。所有实验都进行了六次重复，以评估结果的可重复性。

2.2.8.10. 定时器
为了重新检查LCD上显示的时间，使用了秒表来校准定时器的功能。设置了多个检查点，即30秒、60秒、90秒、120秒和150秒，以确保设备正常工作。

2.2.9. DS的释放研究
2.2.9.1. 体外/离体（主动和被动）渗透研究（有无离子导入）
在实验研究中，最接近人类皮肤的模型是啮齿动物的皮肤：人类皮肤的厚度为2.97毫米，表皮层为46.9微米，角质层为16.8微米；而大鼠皮肤的厚度为0.92-2.80毫米，表皮层为30.4-61.1微米，角质层为13.7-34.7微米；这表明人类皮肤和大鼠皮肤之间存在相似性[25]。此外，使用大鼠皮肤进行渗透研究是一种方便且应用广泛的方法[26]。离体研究中使用的动物数量为12只：其中离体被动研究（无离子导入）n=6只，离体离子导入研究（有离子导入）n=6只。

2.2.9.2. 皮肤准备
动物通过颈椎脱位的方式被处死，然后进行脱毛处理。脱毛后涂抹消毒剂以防止污染。使用脱毛膏（Veet）去除大鼠腹部区域的毛发，涂抹时间按照制造商说明的四分之一进行，即人类使用的时长。最大涂抹时间为2分钟，之后毛发容易被去除，并将脱毛膏从大鼠身体上擦干净。脱毛膏的涂抹时间是一个重要因素，以避免对动物皮肤造成化学灼伤[27, 28]。

2.2.9.3. 皮肤切割
成功去除大鼠腹部区域的毛发后，小心地分离皮下组织和脂肪碎片，然后切割皮肤。

2.2.9.4. 皮肤浸泡
将切割下来的大鼠皮肤浸泡在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中60分钟，然后将其安装在Franz扩散池上。

2.2.9.5. 皮肤安装在Franz扩散池装置上
将浸泡过磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的大鼠皮肤安装在Franz扩散池装置上。

2.2.9.6. Franz扩散装置
使用带有恒温水循环罐的数字6单元扩散装置（Franz扩散系统，型号EMFDC 06，Orchid Scientific，印度）来研究DS的释放情况。每个单元内填充4±0.2 mL的磷酸盐缓冲液（pH 7.4），并在32±0.5°C下以100 rpm的速度用磁珠搅拌受体溶液。使用啮齿动物的皮肤代替膜。使用前将啮齿动物的皮肤在受体介质中浸泡30分钟，然后将其放置在Franz扩散池的供体室和受体室之间，并用铝夹固定。使用注射器向供体室中加入1 mL的DS局部溶液。设备的负极（阴极）通过铜线连接到供体室，以增强阴离子药物的传输；设备的正极（阳极）通过铜线连接到采样端口，以收集释放的离子。药物的释放量通过以下公式计算：

2.2.9.7. 释放动力学
使用各种方程（包括零级、一级和Higuchi模型）确定了每种复合溶液中DS的释放动力学，公式如下（Helal等人，2012年；Higuchi，1961年，1963年；Shoaib等人，2010年）：

其中Qt是时间t内的药物释放量；k0是零级速率常数，单位为浓度/时间；t是时间（小时）；

其中Q0是药物的初始浓度；k是一级速率常数；t是时间（小时）；

其中Q是药物释放量；kh是释放速率常数；t是时间（小时）。

2.2.9.8. 与Franz扩散装置连接的离子导入设备的标准操作程序
以下是本研究中用于从Franz扩散装置释放DS的医疗离子导入设备的简要步骤：
i. 通过将USB端口连接到“电源银行”来启动设备。
ii. 通过电位器旋钮设置电流（单位为毫安），并通过定时器旋钮设置时间（单位为秒），并在LCD上显示结果。
iii. 设置好参数（电流和时间）后，按下“操作按钮”以开始通过皮肤膜输送药物。
iv. 在不同时间点（0、1、2、3、4和5分钟）以及不同电流强度（1、2、3、4和5毫安）下采集样本。
v. 从采样端口抽取1毫升样品，并转移到5毫升容量瓶中，然后用磷酸盐缓冲液补足体积。使用该溶液进行的测定方法与“DS测定”部分中讨论的方法相同。
vi. 每次添加等量的新鲜受体介质以维持平衡状态。
vii. 设置的时间结束后，药物输送和设备操作会自动停止。注意：如果在操作过程中发生紧急情况，可以使用“紧急按钮”立即停止所有功能。

2.2.9.9. 体内测定
2.2.9.9.1. 大鼠足部水肿的卡雷胶诱导实验
为了测定DS的抗炎活性，在大鼠右后爪的足底区域注射0.1毫升1%的新鲜制备的卡雷胶来诱导水肿。这是一种精确且广泛适用的方法，用于评估药物的抗炎效果[29, 30]。使用Vernier卡尺测量卡雷胶注射前后的大鼠足部大小，并使用Plethysmometer在60、120和180分钟时测量足部体积，以评估DS的抗炎效果。

2.2.9.9.2. 实验方案
为了分析DS的抗炎活性，使用了与离体研究相同的剂量。动物被随机分为三组（每组10只）。

2.2.9.9.3. 第1组：对照组
在大鼠中诱导炎症，并如上所述测量足部大小和体积。

2.2.9.9.4. 第2组：被动对照组
动物通过腹腔注射酮胺和赛拉嗪（比例为1:2，即K:100 mg/kg和X:10 mg/kg）进行麻醉[31]。之后，在大鼠的腹部区域涂抹DS局部溶液。1.5小时后，在大鼠右后爪的足底区域注射0.1毫升1%的新鲜制备的卡雷胶，并如上所述在不同时间间隔测量足部大小和体积。

2.2.9.9.5. 第3组：离子导入治疗组
按照之前的方法准备皮肤。之后，在大鼠的腹部区域涂抹DS局部溶液，并进行1-5毫安的离子导入治疗。1.5小时后，在大鼠右后爪的足底区域注射0.1毫升1%的新鲜制备的卡雷胶，并如上所述测量足部大小和体积。

2.2.9.9.6. 统计分析
使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）对数据进行统计分析，随后进行Dunnett多重比较（SPSS 21）。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论
3.1. 通过FTIR光谱确认DS的身份和纯度
通过FTIR光谱确认了DS的身份和纯度。将样品粉末与DS的参考标准进行了比较（图2）。在1572和1556 cm?1处观察到的主要峰对应于羧基团的伸缩（C=O和C=C）。在1451和1397 cm?1处观察到的弯曲峰是CH3基团的峰；在1305和1282 cm?1处观察到的峰是C–N伸缩的峰。在745 cm?1处观察到一个明显的峰，对应于C–Cl伸缩。所有主要峰都与报道的值相符，没有发现额外的峰，表明该材料是纯净的[23, 32–36]。图2显示了DS（a）样品和（b）参考标准的FTIR光谱。

3.2. DS局部溶液的pH值
观察到pH值低于5.5会导致沉淀，从而使DS局部溶液不稳定。Bucci等人也观察到了这种不稳定性[23]。因此，所有局部溶液的pH值被设定为7.0（±0.1），这处于DS稳定性的最佳范围内。当pH值超过pKa（pKa 4）时，DS的溶解度会增加[37]。在生理pH值下，DS以离子形式存在，这使其成为阴极离子导入的理想候选物。

3.3. DS局部溶液的制备
在制备DS局部溶液的过程中观察到了放热反应。使用数字温度计测量局部溶液的温度，最初温度高于45°C。当该溶液进行紫外光谱分析时，显示出不适当的、不可重复的且显著高的吸光度（>1.000）。相反，当局部溶液在冷却水浴中制备或在室温下放置几分钟后，每次测得的吸光度都适当且可重复。因此，在进行光谱分析之前，将局部溶液的温度降至正常水平（低于30°C）非常重要。

3.4. 测定方法的验证
根据Bucci等人的方法进行了DS的测定，但进行了轻微修改[23]。在本研究中，使用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液代替去离子水，并在276 nm处测量吸光度（图3）。为了确定测定结果，根据ICH（2005）的指南确定了测试方法的线性、准确性、精确度和灵敏度，结果见表3[24]。图3显示了pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中DS的紫外光谱。表3。用于通过紫外光谱法分析DS的验证数据。

线性范围：5–30 μg/mL
相关系数：0.9999
斜率：1.66 × 10?2
截距：5.47 × 10?3
截距的标准误差（SEb）：1.25 × 10?2
截距的标准误差（SEb）：0.005
截距的标准差（SDc）：5.47 × 10?3

回收率范围（%）：98.08–101.33
准确度（%）：99.79 ± 1.049
精密度（%RSD）：1.051
检测限（LOD）：1.23 μg/mL
定量限（LOQ）：3.72 μg/mL

注：n = 6；SE = 标准误差；SD = 标准差；Recovery (%) = （实际回收量/添加量）× 100；Accuracy (%) = 平均回收率范围；%Relative standard deviation = (SD/平均值) × 100；Limit of detection = 3.3 × (截距的标准误差/斜率)；Limit of quantification = 10 × (截距的标准误差/斜率)。在5–30 μg/mL的浓度范围内，该方法表现出线性，R2值为0.9998（图4）。通过将平均浓度除以理论浓度计算了响应因子（RF），以确认测定方法的线性范围结果（图5）。这些值表明，在研究的条件和参数下，所研究的浓度范围是线性的，因为所有浓度的比率几乎相同，即约为0.03（图5）。该方法具有很高的准确度（99.79 ± 1.049%）和精密度（1.051%），回收率范围在98.08%到101.33%之间（表3）。此外，该方法具有很高的灵敏度，如检测限（LOD）和定量限（LOQ）值所示，证实该方法适用于DS的测定（表3）。

DS测定的校准曲线。DS响应因子与浓度的关系图。

3.5 DS的测定
所开发的测定方法已应用于复合的即席外用溶液，以定量DS。测定结果准确且精确，如表4所示。

3.6 DS的释放研究
3.6.1 体外/离体（活性）渗透研究：有无离子导入法的比较
使用与离子导入系统连接的数字6孔扩散装置（Franz扩散系统）研究了DS的释放情况。该设备连接到Franz扩散装置上，以模拟通过贴片将药物应用于人体皮肤的程序。研究了电流对药物释放的影响与时间和药物浓度的关系（图6）。随着电流的增加，药物释放量也随之增加（表5）。这些数据与无离子导入法的DS外用溶液的被动释放进行了比较（表6）。这表明，离子化药物的释放量与传递的电流量成正比（图6）。较高的药物释放可能是由于溶液和离子之间的极化增强所致。

3.6.2 体内药物释放
选择了在体外研究中表现最显著的DS浓度（2%）进行体内研究。大鼠爪子的炎症在1小时内达到最大值，并在3小时内消退。接受DS外用溶液的被动组与对照组相比，炎症有所减轻（33.33%，p值<0.05）；而同时接受2% DS和5 mA电流离子导入治疗3分钟的组，爪子尺寸显著减小（62.19%，p值<0.05，与对照组和被动对照组相比）。表9给出了在卡拉胶诱导的大鼠爪水肿模型中，有无离子导入法对DS抑制效果的百分比。

3.6.3 体外渗透与体内疗效的相关性
为了了解DS释放程度与治疗效果之间的关系，研究了体外药物渗透量与爪水肿抑制百分比之间的相关性。观察到强烈的线性相关性（表10），表明在5 mA电流下，离子导入系统的药物渗透改善导致了炎症的减少（62.19%）。相关性分析证实，Franz扩散模型是预测离子导入系统体内抗炎活性的有效工具。

4. 结论
本研究使用定制设计的便携式离子导入系统，成功评估了DS外用离子溶液在雄性白化大鼠体内的体外和体内效应。通过Franz扩散装置，在不同的浓度、电流强度和时间间隔下评估了DS的释放情况。结果表明，2% DS溶液的释放量始终优于1.5%和1%溶液。具体而言，5 mA电流作用5分钟可促进约95%的药物释放，证明这是有效的最佳配方和参数。这些结果在体外和体内研究中的一致性强调了这种离子导入技术的有效性和临床前潜力，为非侵入性药物递送系统的开发提供了有希望的途径，为未来的转化研究奠定了基础。

本手稿未收到任何资助。作者声明无利益冲突。相关数据可向通讯作者索取。