联合抗抑郁药物氟哌噻醇-米曲森对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）血糖水平及胰岛素样肽基因DILP5和DILP6表达的影响

《BioMed Research International》：Effect of a Combined Antidepressant Drug Flupentixol–Melitracen on Glucose Level and Expression of Insulin-Like Peptide Genes DILP5 and DILP6 in Drosophila melanogaster

　　**摘要**

全球抑郁症患者的数量正在以惊人的速度增加，因此抗抑郁药物的使用量也与日俱增。然而，这些药物对葡萄糖稳态的影响尚不明确。我们研究了抗抑郁药物氟哌噻醇-米曲森联合使用对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）葡萄糖水平及相关基因表达的影响。实验中，果蝇被饲养在含有标准食物和药物处理食物的对照组和处理组中。葡萄糖氧化酶检测结果显示，处理组果蝇的葡萄糖水平显著降低。通过qPCR技术对黑腹果蝇胰岛素样肽（DILP）基因DILP5和DILP6进行了相对定量分析，并使用2^-ΔΔCT方法处理了Ct值。尽管DILP基因的表达在统计学上没有显著差异，但DILP5基因在抗抑郁处理组中的表达略高。本研究提示，抗焦虑药和抗抑郁药物可能与胰岛素信号通路有关，而胰岛素信号通路对生长、葡萄糖调节及其他基本代谢过程至关重要。需要进一步研究以确定所有DILP基因及其他可能影响葡萄糖稳态的基因的表达模式。

**1. 引言**

抑郁症是全球主要的精神疾病之一，已成为一个公共卫生问题。该病的特征包括绝望、悲观情绪以及对曾经喜欢的活动失去兴趣。任何年龄的人都可能受到影响，导致生活困难、激素失衡和遗传倾向[1]。抑郁症患者的发病率正在迅速上升，估计在大约三十年间从1.72亿增加到2580万[2]。抑郁症和焦虑症经常同时存在，患者常常表现出另一种疾病的症状[3]。抗抑郁药物是治疗各种精神健康状况（主要是抑郁症和焦虑症）的常用药物。然而，这些药物的快速使用带来了许多副作用，包括恶心、消化问题、性功能障碍、体重增加或减少以及睡眠障碍。尽管有这些副作用，药物的使用量仍在不断增加[4]。抗抑郁药物通过改变调节情绪的特定脑化学物质（如血清素和去甲肾上腺素）的比例来发挥作用[5]。抗抑郁药物有多种形式，包括三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性血清素再摄取抑制剂（SSRIs）和血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂。这些药物的作用机制各不相同，对不同个体的效果也可能有所不同[6]。虽然SSRIs通常被认为是首选抗抑郁药，但氟哌噻醇-米曲森组合已被证明对轻至中度抑郁症和焦虑症患者有效[7]。一些证据表明，这种药物组合比许多常见的抗抑郁药（如SSRIs）更能快速缓解抑郁或焦虑症状[7]。氟哌噻醇通过阻断多巴胺D2受体的活性来发挥作用，从而限制大脑中的多巴胺活动。多巴胺调节愉悦感、动机和情绪；多巴胺的减少可能导致幻觉和妄想等精神病症状[8]。氟哌噻醇还能激活血清素5-HT2受体，从而增强其抗抑郁效果[9]。米曲森则阻断神经元突触前末端血清素和去甲肾上腺素的再摄取[10, 11]。血清素通过触发PI3K-Akt-TOR信号通路在胰岛素分泌中起调节作用[12, 13]。此外，它还可能影响目标组织上葡萄糖转运蛋白和受体的表达或敏感性，从而影响细胞葡萄糖摄取和整体葡萄糖稳态[14]。氟哌噻醇（0.5 mg）和米曲森（10 mg）的组合是一种抗焦虑药和抗抑郁药，常用于治疗混合性焦虑-抑郁状态和心身疾病，尤其是在需要快速稳定情绪或患者对SSRIs反应不佳的情况下[7, 11]。尽管其临床疗效得到认可，但关于这种药物组合如何影响代谢过程（包括葡萄糖调节）的了解仍然有限。果蝇作为抑郁症研究的潜在模型[15]，已被广泛用于遗传学、生理学和神经生物学等领域的科学研究[16, 17]。在果蝇中，胰岛素生成细胞（IPCs）类似于脊椎动物的胰腺β细胞，在高血糖时分泌胰岛素；而心脏体（Corpus Cardiacum，CC）则类似α细胞，产生类胰高血糖素激素。由于IPCs和CC的功能与α细胞和β细胞相似，它们被视为果蝇体内的哺乳动物胰腺类似物[18]。黑腹果蝇胰岛素样肽（DILPs）是一类与人类胰岛素具有强烈进化和功能相似性的蛋白质[19–21]。已从果蝇物种中鉴定出8种DILP基因（DILP1–8）[19–21]。其中7种肽（DILP1–7）与果蝇胰岛素受体（dInR）结合，而DILP8与富含亮氨酸的重复序列G蛋白偶联受体3（Lgr3）结合。这些肽与特定受体相互作用后，维持储存和循环碳水化合物之间的平衡，并触发信号级联反应[20]。它们还参与发育和繁殖等其他功能[20]。这8个基因的表达模式不同，并在不同细胞中对不同条件作出反应[20, 21]。有趣的是，这些基因在功能上具有冗余性[21]。DILP基因敲除突变体的功能由其他DILP基因维持。含有DILP基因敲除突变的果蝇表现出多种生长缺陷。此外，去除IPCs会产生类似人类1型糖尿病的表型[22]。多项研究表明，血清素能信号通路可调节果蝇中的IPCs，这一点在FlyBase中有相关证据[23–26]。一些流行病学研究表明，抑郁症患者患2型糖尿病的风险更高[27]，具体来说，抑郁症患者的风险增加了60%[28]。这两种疾病之间存在双向关系：其中一种疾病的存在显著增加了另一种疾病的风险[29, 30]。抑郁症通过行为因素（如减少体力活动、不良饮食和药物依从性差）对代谢健康产生负面影响[31, 32]。尽管已有这种关联，但抗抑郁药物治疗对葡萄糖稳态的影响仍不清楚。在这项研究中，我们从8个与哺乳动物胰岛素调节葡萄糖稳态基因相似的基因中选择了DILP5和DILP6两个代表性基因[21, 28, 29]，探讨了氟哌噻醇-米曲森组合如何影响黑腹果蝇的葡萄糖水平及相关胰岛素基因的表达。通过这一模型，我们试图揭示抗抑郁治疗与葡萄糖调节之间的潜在联系，从而更好地理解这类药物如何影响代谢过程。

**2. 实验程序**

**2.1. 顶点终点的测量及相应的葡萄糖浓度**

2023年6月，我们从达卡大学的动物园使用香蕉诱饵收集了野生果蝇。果蝇在半粒小麦-酵母培养基中饲养，生命周期为3周。每3-4天更换一次食物。每个培养瓶中包含20-25只果蝇。所有饲养工作均在温度为25°C ± 1°C、相对湿度为65%、光照周期为12:12的封闭环境中进行。实验使用的是第三龄幼虫来测量抗抑郁药物的顶点终点。抗抑郁药物Frenxit（由Beximco Pharmaceuticals Ltd.（孟加拉国）生产，含有0.5 mg氟哌噻醇和10 mg米曲森）从当地药店购买，并研磨以确保其在蒸馏水中完全溶解。去除药片的外层色素后称重，以确定半数致死浓度（LC50），然后将药物压碎并与5%糖水溶液混合。考虑了6个处理浓度：100、200、300、400、500和600 mg/L。同时设置了一个对照组（0 mg/L）。将15只第三龄幼虫分别转移到每个处理组和对照组培养瓶中，观察24小时。处理后回收幼虫，记录存活数量以确定终点。该实验进行了6次生物重复。收集的数据用于计算LC50，以评估最大药理压力而不引起过度毒性[33]。根据此实验确定的剂量作为后续葡萄糖浓度测量的唯一处理组。为了测量葡萄糖浓度，我们修改了标准培养基的配方[34]，在烹饪的最后阶段加入所需浓度的药物，从而在固化前形成均匀混合物。对照组果蝇在标准培养基中饲养，对照组使用与处理组相同体积的蒸馏水。每个处理组和对照组共使用了15个培养瓶（每个含30 ± 2只果蝇）。成虫在培养瓶中饲养48小时以促进产卵，之后将其丢弃。孵化后，幼虫继续在处理培养基或对照培养基中进食和发育。当幼虫达到第三龄阶段（96小时）时，将其收集并测量葡萄糖水平。选择第三龄幼虫是因为它们代表果蝇中最活跃的代谢阶段，这与之前的胰岛素信号通路研究一致[35, 36]。从每个培养瓶中取出3只第三龄幼虫，转移到1.5 mL微量离心管中，加入50 μL PBS，然后压碎以获得全身匀浆液。离心后（13,000 rpm，1分钟）沉淀细胞碎片。取10 μL匀浆液进行比色法测试以检测葡萄糖水平。实验进行了20次生物重复。葡萄糖浓度使用Glucose MR试剂盒（Linear Chemicals，西班牙）进行测量[37]。在光谱仪（Spectrophotometer 721，中国）中，500 nm波长下测量吸光度以分析对照组和处理组的葡萄糖水平。

**2.2. 人类葡萄糖相关基因及其在果蝇中的同源基因的鉴定**

我们的文献搜索发现了几种与葡萄糖和胰岛素相关的基因。我们在果蝇基因组中进行了BLAST和双向BLAST搜索，发现DILP基因在结构和功能上与人类葡萄糖和胰岛素相关基因密切相关。我们参考了modENCODE：Drosophila转录组、发育阶段数据集，并将重点缩小到两个DILP基因，这两个基因在所有幼虫阶段均表现出一致的表达模式。为了研究系统发育和结构相似性，分别从FlyBase和NCBI中提取了8个DILP基因及其人类同源基因（IGF1、IGF2和INSL5）的最长蛋白质序列，使用MAFFT v7.2.1.5进行比对[38]。比对后的FASTA文件用于IQ-Tree[39]，该软件基于ML算法进行了最优统计模型和自举分析（使用默认的1000次自举重复）。树状图使用iTool web服务器v. 6.9.1可视化[40]。对于结构相似性分析，比对后的文件作为输入在MEME web服务器[41]中运行（访问日期为2024年9月9日），并设置为经典模式， motifs数量设为5个。根据相似性和位置对鉴定出的motifs进行命名和编号。为了预测保守结构域，蛋白质序列在NCBI保守结构域数据库（包含19,902个位置特异性评分矩阵）中进行了搜索（e值< 0.01，最大命中次数为500）[42–44]。

**2.3. 两个DILP基因的基因表达分析**

由于基因表达研究较为敏感，我们选择了Hikone-H品系的黑腹果蝇（DGRC编号：109-146），这是一种雌性同型品系，适用于敏感的实验室检测。果蝇在如上所述的相同实验室条件下饲养。实验设置包括一个处理组和一个对照组。使用Trizol-based RNA提取试剂盒（Tiangen，中国）从10只第三龄幼虫中提取总RNA。每个对照组和处理组各进行了3次生物重复。提取的RNA立即使用First Standard Synthesis Kit（Abclonal，美国）转化为cDNA。然后将20 μL cDNA用无核酸酶的水稀释4倍，用于后续的qPCR检测。使用基于染料的试剂（TaKaRa TB Green，中国）在qPCR机器（Analytic Jena：qTOWER3G）中分析两个DILP基因的表达。在本研究中，核糖体蛋白RPL11被用作内参基因。这两个基因的表达是通过三个对照组和三个处理组的cDNA（三个生物学重复样本）进行分析的。每个反应都进行了三次。本研究中使用的引物对列在表1中。热循环条件包括：95°C下5分钟进行初始变性，95°C下30秒变性，60°C下30秒退火，60°C下20秒延伸，以及15秒最终延伸。这些步骤重复了35次。目标基因的相对表达是通过2?ΔΔCT方法[45]进行分析的。表1显示了用于qPCR实验的引物序列。

2.4 统计分析
所有可视化和统计分析都是在R Studio（版本2024.04.0）中进行的，使用了ggplot2包[46]。为了估计不同剂量反应下的平均存活率，我们拟合了一个线性回归模型来量化抗抑郁剂剂量浓度（毫克/升）与平均幼虫存活率之间的关系。模型参数包括斜率、截距和决定系数（R2）。LC??被定义为对应于50%存活率的浓度。为了比较对照组和处理组之间的葡萄糖浓度测量值，使用了Shapiro–Wilk检验（通过shapiro.test()函数）来评估正态性。由于浓度不符合正态分布（p < 0.05），因此使用了非参数的Wilcoxon秩和检验（Mann–Whitney U检验）来比较各组。同样，为了评估DILP5和DILP6基因的原始Ct值和相对表达模式，在对照组和处理组之间也进行了正态性检验，随后进行了Wilcoxon秩和检验。对于所有情况，统计显著性定义为p < 0.05。可视化使用ggplot2（v.3.5.2）和ggpubr（v. 0.6.1）R包生成。

3 结果
3.1 存活率的顶端终点
通过施加不同浓度的药物，确定了抗抑郁药物对果蝇第三龄幼虫的致死浓度，即LC50剂量。图1中的数据点显示了观察到的存活率，其中一些变化围绕着由阴影置信区间表示的回归线（图1）。总体而言，我们的结果显示存活率与抗抑郁剂剂量之间存在强烈的负相关（y = 78 ? 0.071x，R2 = 0.83）。在当前的实验情景下，存活率（y）从78%开始，每增加一个剂量单位（毫克/升），存活率降低0.0071%。当剂量约为400 mg/L时，存活率约为50%，此时趋势线与水平红线（代表LC50）相交；而在500 mg/L和600 mg/L时，存活率分别为47.78%和24.44%。后续研究中使用的剂量为400 mg/L，低于LC50。

3.2 葡萄糖浓度测量
从对照组和处理组中取第三龄幼虫来测量葡萄糖水平。对照组和处理组的平均葡萄糖浓度分别为75.02（±40.13）和36.54（±21.79）。非参数Wilcoxon检验显示p值较低（p < 0.005），表明两组之间的葡萄糖浓度存在统计学上的显著差异。我们的结果表明，处理组（400 mg/L）的葡萄糖浓度低于对照组。此外，我们观察到对照组的数据点四分位数范围（IQR）更宽，数据点分布更分散（图2），表明对照组中的葡萄糖浓度变异较大。处理组的IQR较窄，表明葡萄糖浓度更加一致。处理组中没有极端异常值且变异较小，这表明处理可能有效降低了葡萄糖水平。

3.3 在黑腹果蝇中选择人类胰岛素样基因的同源物
我们的综合生物信息学和文献搜索在黑腹果蝇中识别出几个重要的人类胰岛素样基因的同源物。我们发现了几个DILP基因，它们与至少一个人类胰岛素生长因子（IGF1和IGF2）或胰岛素（INSL5）基因有很强的同源性。例如，DILP1–3、DILP5和DILP6与人类IGF1和IGF2基因有很强的同源性。DILP4仅与人类胰岛素基因（INSL）有相似性。DILP7和DILP8没有检测到人类同源物。这种差异提醒我们进一步对所有DILP基因进行后续的表达分析。这些基因产物的系统发育和结构相似性为我们缩小了研究范围提供了线索。系统发育树显示两个主要簇：DILP4、DILP6和DILP7与人类INSL5蛋白聚在一起，而其余的DILP蛋白（除了DILP1蛋白）与人类IGF1和IGF2聚在一起（图3）。尽管DILP8与人类IGF形成了一个簇，但分支长度较长，表明蛋白质的多样性。我们的基序发现图显示在研究的11个蛋白质中存在五个不同的基序。基序的大小从13aa（M-5）到44aa（M-4）不等。M-1（14aa）和M-2（19aa）基序出现在所有果蝇和人类蛋白质中，表明它们在进化上是保守的，并可能在两种生物的结构和功能中发挥重要作用。此外，还检测到一些独特的基序，例如DILP5和INSL5中的M-5基序；IGF2和DILP8中的M-3（17aa）基序；以及DILP7和DILP8中的M-4基序，这些基序表明它们与特定功能或谱系特异性适应有关。

3.4 基因表达分析
我们的基因表达研究首先进行了生物测定，涉及用400 mg/L的Frenxit处理黑腹果蝇Hikon-H品系的同雌性对照组。我们进行了基于Sybr-green的qPCR分析，针对DILP5和DILP6基因，包括内参基因。总体而言，对于DILP5和DILP6基因，我们没有发现处理组和对照组之间的原始Ct值有显著差异（Wilcoxon检验的p值分别为0.13和0.47）（图5a）。Ct值的分布显示出组内变异很小，反映了qPCR测量的均匀放大效率和可靠性。同样，我们也未检测到这两组之间这些基因的相对表达有显著差异（图5b）。处理组的DILP5基因表达略高（1.69 ± 1.03），而对照组为1.09 ± 0.49（图5b），但高p值（p = 0.37）表明两组之间没有显著差异。另一方面，处理组的DILP6基因相对表达略有下降（0.95 ± 0.26），而对照组为1.08 ± 0.52，但仍未达到显著性（p = 0.72）。总体而言，我们的分析表明，无论是DILP5还是DILP6的表达都没有因处理而发生显著改变，这一点通过原始Ct值和相对表达数据得到了证实。

4. 讨论
慢性压力和长期暴露于抑郁状态会破坏胰岛素信号通路，导致胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损。这种代谢紊乱是与肥胖和2型糖尿病发展相关的关键风险因素[47–50]。然而，用于治疗抑郁和其他精神健康状况的联合抗抑郁剂flupentixol–melitracen对葡萄糖稳态的作用尚不清楚。探索这些药物影响代谢通路的机制对于理解其潜在副作用至关重要。本研究评估了这些药物对黑腹果蝇中葡萄糖代谢和两个DILP基因DILP5和DILP6表达的影响。

4.1 抗抑郁剂组合Flupentixol–Melitracen降低醋蝇中的葡萄糖含量
在人类中，抗抑郁剂已被证明可以通过缓解共存的抑郁症状来改善2型糖尿病（T2D）患者的葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。长期使用抗抑郁剂与非糖尿病个体的高血糖和2型糖尿病风险增加有关[51, 52]。本研究表明，该药物显著降低了果蝇幼虫的葡萄糖水平。在果蝇中，血淋巴中的主要循环糖是海藻糖而不是葡萄糖。来自饮食和肠道中消化食物的葡萄糖在脂肪体中转化为海藻糖。昆虫的脂肪体类似于哺乳动物的肝脂肪组织[53, 54]。Frenxit药物对海藻糖水平的影响值得研究。在人类中，主要的循环碳水化合物是葡萄糖。当前研究表明，抗抑郁剂Frenxit显著改变了葡萄糖水平，具体来说是降低了葡萄糖水平。当血液中的葡萄糖充足时，昆虫会分泌胰岛素样肽以促进更多的葡萄糖吸收；当葡萄糖不足时，其分泌减少，导致吸收减少。胰岛素样肽的活性类似于哺乳动物的胰岛素[20]。压力和负面环境因素已被证明会提高果蝇的葡萄糖水平[65]并破坏人类的葡萄糖稳态，可能导致2型糖尿病[47]。临床研究也强调了抗抑郁剂使用与人类高血糖之间的显著关联[66]。有趣的是，压力条件与果蝇[65]和人类[47]中发展出类似2型糖尿病的表型有关。在这项研究中，抗抑郁治疗似乎降低了血糖水平，可能是通过刺激胰岛素的产生来实现的。这使得果蝇成为研究人类相关现象的理想模型。在高糖饮食下，果蝇体内的葡萄糖和海藻糖水平显著升高，并导致胰岛素抵抗或2型糖尿病表型的出现[55]。另一项研究表明，由高糖饮食引起的2型糖尿病果蝇具有较高的海藻糖水平和DILP5基因的低表达[56]。高糖饮食、压力或抑郁以及抗抑郁药物都会影响碳水化合物的代谢。

4.2. 人类葡萄糖和胰岛素相关基因的直系同源物
抗抑郁药物会导致许多基因表达的显著变化[57]。在一项全基因组关联研究中，重度抑郁症患者和接受抗抑郁治疗的患者表现出显著的基因表达差异[57]。然而，这些药物对葡萄糖稳态基因的影响尚不明确。DILP基因是哺乳动物胰岛素的类似物，胰岛素调节葡萄糖代谢、生长、发育、应激反应等功能。果蝇中的DILP基因具有保守的结构域（图3）。据报道，DILP5和DILP6参与胰岛素受体结合和碳水化合物稳态的调节[19, 60]。DILP6还与饥饿反应有关[60, 63-64]。因此，研究与哺乳动物调节葡萄糖稳态的胰岛素基因最相似的果蝇DILP5和DILP6基因可能具有价值[21, 58, 59]。

4.3. DILP5和DILP6基因在抗抑郁药物引起的血糖降低中不起主要作用
在本研究中，我们发现调节葡萄糖的基因DILP5和DILP6没有发生显著变化。因此，无法确定DILP5和DILP6在降低血糖水平中的作用。尽管在处理组中DILP5的表达水平略有升高，但这种变化并不具有统计学意义。然而，在小鼠模型中，已经证明DILP5可以与人类胰岛素受体结合并降低血糖水平[60]。本研究中对照组和处理组的DILP6表达模式相似，这可能是由于第三龄幼虫的表达水平较低。DILP6在肠道中的表达量较低[19]，但在从幼虫到蛹的转变期间以及蛹期其表达量较高。因此，为了进一步研究药物对DILP6基因表达的影响，应在实验中包含蛹阶段。讨论表明，DILP5和DILP6可能在抗抑郁药物引起的血糖降低中不起主要作用。尽管存在一些基因表达的差异，仍不能排除这些基因对葡萄糖稳态的次要影响。对所有DILP基因进行全面研究可能是有价值的。此外，获取并分析处理组和对照组的转录组数据有助于揭示这一现象的分子基础。

4.4. 果蝇中胰岛素信号传导的5-羟色胺调节
氟哌噻醇和美利曲森的联合使用可能通过5-羟色胺调节胰岛素样肽来影响果蝇的葡萄糖代谢。药物Fenxit可以改变5-羟色胺的水平，而5-羟色胺已知会影响果蝇大脑中胰岛素样肽（IPCs）的活性[23, 24]。这些IPCs分泌的胰岛素样肽可以与外周组织中的dInR结合。dInR的激活会触发经典的PI3K-Akt-TOR通路，从而调节碳水化合物代谢、葡萄糖/海藻糖转运蛋白的表达以及糖原储存[61, 62]。因此，氟哌噻醇-美利曲森引起的5-羟色胺信号传导变化可能会增加DILP的分泌，激活胰岛素受体，进而促进葡萄糖代谢，最终导致血糖浓度降低。这种机制联系为研究中观察到的血糖浓度和DILP基因表达变化提供了合理的解释。

5. 结论
氟哌噻醇-美利曲森联合药物的使用会导致果蝇的血糖水平发生显著变化。这些药物对DILP5的表达有轻微影响，而DILP6的表达似乎没有变化。本研究表明，抗抑郁药物可能会影响胰岛素信号传导通路，这是影响生长、葡萄糖稳态和其他基本代谢过程的途径。需要进一步研究以探讨八个DILP基因的表达和功能。此外，这可以为抗抑郁药物在抑郁症、焦虑症和2型糖尿病患者治疗中的应用提供重要见解。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

资助
本研究部分由孟加拉国大学拨款委员会（2020-21年度生物科学项目，M.S.A.担任首席研究员）和孟加拉人民共和国科学技术部（通过A.I.B.获得的国家科学技术奖学金）资助。

致谢
我们感谢Jannatun Naher、Setu Mallick、Popy Rani Das和Md Mahfuzur Rahman在实验工作中提供的帮助。

数据可用性声明
数据可应要求提供。