基于机制的评估：高浓度单克隆抗体在灌装-完成过程中颗粒形成的影响因素——泵材、表面相互作用及系统架构的作用

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Mechanism-informed evaluation of particle formation in high-concentration monoclonal antibodies during fill–finish: Impact of pump materials, surface interactions, and system architecture

　　亚当·哈特曼（Adam Hartman）| 迪普·巴塔查里亚（Deep Bhattacharya）| 李明月（Mingyue Li）| 琳维基（Vicky Lin）| 埃达·费内尔乔格鲁（Eda Fenercioglu）| 帕特里斯·安莱特纳（Patrice Anleitner）| 阿德瓦伊特·巴德卡尔（Advait Badkar）| 帕拉格·科尔赫（Parag Kolhe）
生物治疗药物科学部，辉瑞制药研发中心，美国马萨诸塞州安多弗

**摘要**
在灌装-终末处理过程中，颗粒的形成对高浓度单克隆抗体药物产品的质量和可制造性构成了关键风险。本研究使用一种模型IgG配方，系统地评估了泵材料、间隙容忍度和流路结构对不可见颗粒和可见颗粒生成的影响。通过控制模拟，比较了在静止和循环条件下使用陶瓷泵和不锈钢旋转活塞泵的情况，其中包括一个三通阀的配置以及故意添加金属颗粒的情况。不可见颗粒分析显示，颗粒生成主要由表面介导的机制驱动：不锈钢部件、更小的泵间隙（5 μm）和更复杂的流路结构产生了最高的颗粒水平，而具有中等间隙的陶瓷旋转活塞泵产生的颗粒数量显著较少，并且避免了泵的堵塞。只有在包含三通阀和故意添加金属颗粒的不锈钢旋转活塞泵系统中观察到了可见颗粒。正交表征（FTIR、拉曼光谱、SEM-EDX）证实，这些颗粒主要是蛋白质性质的，并且经常含有嵌入的金属杂质，在故意添加颗粒的配置下，这与高能界面处的异质成核现象一致。

相比之下，DSC、DSF、MM-IR、DLS衍生的kD和wNMR分析表明，在所有条件下，热稳定性、二级结构和蛋白质-蛋白质相互作用行为均未发生变化，批量稳定性指标也没有可测量的变化。从机制上讲，静止-重启设计和正交颗粒表征支持了一种表面介导的途径，即蛋白质在静态保持期间在高能界面处积累，随后在流动过程中脱落，而金属杂质提供了异质成核位点，而批量IgG的稳定性在所有条件下保持不变。

数据支持了工艺开发策略，强调了对泵材料接触情况的评估，避免过小的间隙，减少循环，并简化阀门几何形状。这一基于机制的框架为设计稳健的、以患者为中心的灌装-终末处理过程提供了实际指导，符合质量设计原则。尽管本研究使用的是单一模型IgG1，但观察到的表面介导的趋势与关于固液界面处吸附诱导颗粒形成的广泛文献一致。

**引言**
灌装-终末处理是生物药品（包括单克隆抗体和其他蛋白质治疗药物）制造中的关键单元操作。在此阶段，配制的药品在无菌条件下转移到最终容器中。尽管这一过程是常规的，但它引入了多种机械和界面应力，这些应力可能通过诱导蛋白质聚集和颗粒形成来影响产品质量。2–100 μm范围内的不可见颗粒（SVPs）尤其令人关注，因为它们具有潜在的免疫原性和对产品质量的影响。监管机构对注射产品中的颗粒物质设定了严格的限制，而蛋白质颗粒的存在被视为一个关键的质量属性。了解颗粒形成的机制并实施有效的控制策略对于确保产品安全和合规性至关重要。

最近的研究表明，灌装-终末处理过程中的颗粒形成是一个多因素现象。已经证明，蛋白质在陶瓷旋转活塞泵（RPP）表面的吸附会导致多层膜的形成，这种膜在泵送过程中会被破坏，从而将蛋白质颗粒释放到溶液中。同样，其他研究表明，尽管蠕动泵在剪切力方面较为温和，但通过管材-表面相互作用也可能诱导颗粒形成，特别是在使用某些基于硅的材料时。配方成分（特别是表面活性剂）在减轻单克隆抗体配方中的颗粒形成方面的作用已被广泛研究。研究表明，如聚山梨酯20和80、泊洛沙姆188以及Brij型表面活性剂等表面活性剂可以通过限制蛋白质在界面处的吸附和减弱界面应力来减少聚集和颗粒形成。Hawe等人进行的系统强制降解研究表明，适当的表面活性剂选择可以显著抑制mAb中的应力诱导聚集途径，即使在恶劣的机械和热应力条件下也是如此。

为了应对这些挑战，已经开发了先进的分析技术。作者们使用拉曼显微镜、CLSM和成像流式细胞术来检测传统光遮蔽方法无法识别的混合蛋白质-硅颗粒。这些高分辨率工具对于表征低丰度、高风险的颗粒以及在工艺开发过程中进行法医调查至关重要。

除了泵的机械特性和配方组成外，蛋白质本身的物理化学性质也在其灌装-终末处理过程中的聚集敏感性中起着关键作用。构象稳定性低、表面疏水性高或等电点接近配方pH值的蛋白质更容易发生界面吸附和随后的聚集。例如，Roffi等人观察到一种敏感蛋白质（Protein X）在陶瓷泵表面上形成了多层膜，这些膜在活塞移动过程中被破坏，导致不可见颗粒显著增加。相比之下，具有稳定配方的强健单克隆抗体在相同条件下表现出最小的吸附和颗粒形成。这些发现强调了在工艺开发过程中进行特定蛋白质风险评估的重要性，特别是在选择泵类型和操作参数时。

此外，生物制品中颗粒组成的复杂性促使了先进分析工作流程的发展，以更好地表征颗粒物质。在先前的研究中，已经证明单克隆抗体药物产品中的可见和不可见颗粒通常不仅包含治疗性蛋白质，还包含宿主细胞蛋白质，这些蛋白质可能由于共同的物理化学特性（如低净电荷和高疏水表面积）而共聚集。这些共聚集物可能逃避传统方法（如光遮蔽）的检测，需要LC-MS/MS和拉曼光谱等正交技术进行准确识别。蛋白质颗粒中存在宿主细胞蛋白质（HCPs）引发了关于免疫原性的额外担忧，并突显了在开发和质量控制过程中进行全面颗粒表征的必要性。

尽管在理解配方和蛋白质特定因素对颗粒形成的影响方面取得了显著进展，但在高浓度蛋白质灌装-终末处理过程中，泵材料组成、间隙容忍度和流路结构的相对影响仍不够明确。现有研究通常单独评估这些因素，限制了从机制角度了解材料表面、几何约束和动态界面如何共同驱动不可见和可见颗粒的生成。对于高浓度mAb而言，由于粘度升高、蛋白质-蛋白质相互作用增强和界面敏感性增加，表面介导的应力后果更为严重，这些知识空白对可制造性和产品质量构成了实际风险。因此，需要系统地进行并行评估，以区分泵设计、材料磨损、间隙依赖的界面暴露和流路复杂性的贡献，并区分真正的批量稳定性效应和表面驱动的成核机制。

更广泛地说，已经报道了在各种治疗蛋白质和接触材料（例如不锈钢、弹性体、管材、注射器）的固液界面处发生的吸附诱导聚集和颗粒形成，这表明即使批量溶液稳定性不变，界面现象也可能是颗粒风险的主要驱动因素。

在这项研究中，我们通过在受控的静止和循环条件下，评估蠕动泵、陶瓷旋转活塞泵和不锈钢系统中的颗粒形成情况，包括具有紧密间隙、增加的表面复杂性和故意添加金属颗粒的配置，来填补这一空白。我们假设高浓度mAb灌装-终末处理过程中的颗粒生成主要由高能界面处的异质成核驱动，而不是由蛋白质本身的不稳定性驱动，并且使用具有中等间隙的惰性陶瓷材料和简化的流路将显著减少颗粒负担，相对于不锈钢和更严格间隙的设计而言。

**部分摘录**
**单克隆抗体配方**
在辉瑞全球供应站点，使用超滤和渗滤工艺生成了一种药用级模型IgG1单克隆抗体，以达到目标辅料组成。然后将该配方运送到辉瑞研发设施，在那里将其稀释至最终组成：100 mg/mL mAb，含有组氨酸、降粘剂、糖、表面活性剂和金属螯合剂，pH值为5.8。该单克隆抗体的等电点为8.75。

**泵设备**
使用了三种类型的泵。

**泵模拟**
为了系统地评估灌装-终末处理过程中的颗粒形成机制，我们使用IgG单克隆抗体配方进行了一系列控制模拟。这些实验包括了不同类型的泵，包括不锈钢旋转活塞泵、间隙为5 μm的陶瓷旋转活塞泵、间隙为15 μm的陶瓷旋转活塞泵以及蠕动泵。实验设计旨在紧密模拟实际条件，特别关注机械因素的作用。

**结果与讨论**
由于体积精度高和处理高浓度、高粘度单克隆抗体配方（>～100 mg/mL；>～15 cP）的能力，旋转活塞泵在无菌灌装-终末处理操作中被广泛使用。这些高浓度mAb配方通过减少注射体积实现了皮下给药，但它们本身更容易受到蛋白质-蛋白质相互作用、界面吸附和剪切诱导应力的影响。因此，灌装-终末处理单元操作特别容易……

**局限性与普遍性**
本研究的局限性在于实验使用的是单一模型IgG1配方；因此，不同表面特性（如疏水性、电荷分布）、构象稳定性和配方基质的单克隆抗体之间的颗粒生成量和接触材料的相对敏感性可能会有所不同。尽管如此，这里观察到的主要定性趋势——表面介导的颗粒形成……

**综合机制信息解释**
总体而言，多模态数据表明，这些灌装-终末处理模拟中的颗粒形成是由表面驱动的设备介导机制引起的，而不是高浓度IgG本身的内在不稳定性，其热谱、高阶结构和相互作用参数在所有泵条件下保持不变。不锈钢旋转活塞泵由于容易发生机械磨损，产生了最高的不可见和可见颗粒水平。

**结论**
本研究系统地评估了高浓度单克隆抗体配方在灌装-终末处理过程中的颗粒形成情况，分离了泵材料、间隙容忍度和流路结构的单独和综合效应。在所有泵配置中，颗粒生成都是由表面介导的机制驱动的，而不是由蛋白质本身的不稳定性驱动的，这一点通过热稳定性、高阶结构和蛋白质-蛋白质相互作用行为的不变性得到了证实。

**利益冲突声明**
无利益冲突需要报告。

**致谢**
作者感谢Nicolas Dobrosielski提供微流成像支持，以及Adrien DeLeon提供DSC和DSF分析支持。