《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Divergent host cell protein profiles during special purification of biologics from prokaryotic versus eukaryotic systems dictate the need for tailored ELISA assay development
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张冉|岳宇|周祖霞|邹冰|刘传雷|尹振浩|张峰|叶红燕|胡曦|王青敏|李道远|安振明齐鲁制药有限公司生物制药研究所，中国山东省济南市250100摘要治疗性抗体通过宿主系统表达，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大肠杆菌（菌株B / BL21-DE3，E.coli BL21），随后通
张冉|岳宇|周祖霞|邹冰|刘传雷|尹振浩|张峰|叶红燕|胡曦|王青敏|李道远|安振明
齐鲁制药有限公司生物制药研究所，中国山东省济南市250100
摘要
治疗性抗体通过宿主系统表达，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大肠杆菌（菌株B / BL21-DE3，E.coli BL21），随后通过纯化去除宿主细胞蛋白（HCPs），从而避免免疫原性、抗体降解和蛋白质聚集等风险。在监管申报过程中，通常需要使用针对空转染收获细胞培养液（HCCF）定制开发的药物特异性HCP ELISA试剂盒来确保HCP的准确定量。在一种由大肠杆菌表达抗体的案例中，最初仅基于HCCF的HCP ELISA试剂盒显著低估了纯化中间产物（阳离子交换色谱组分CEX1）中的HCP水平。添加抗CEX1 HCP抗体后，检测能力显著提高。随后的高分辨率质谱（HRMS）分析显示HCCF和CEX1之间的HCP组成和丰度存在显著差异。相比之下，对于CHO细胞来源的抗体（真核系统），HCCF和类似纯化中间产物之间的HCP谱没有观察到显著变化。这种差异为优化特殊纯化抗体治疗药物的HCP分析策略提供了关键见解。
引言
治疗性蛋白质主要使用宿主细胞表达系统生产，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大肠杆菌。在生产过程中，这些宿主细胞会释放出目标治疗蛋白以外的复杂内源性蛋白质混合物。这些HCPs被认为是关键的过程相关杂质，因为它们可能影响药物的安全性、有效性和稳定性[1, 2, 3]
作为外源性物质，HCPs具有显著的免疫原性风险。它们可能被患者的免疫系统识别为抗原，从而引发抗药抗体（ADAs）或过敏反应[4]。某些HCPs，如蛋白酶、磷脂酶和伴侣蛋白，即使在微量残留水平下也表现出较高的免疫原性或酶活性，带来额外的风险。例如，残留的蛋白酶会降解治疗蛋白，导致其失活或产生有害降解物；早期红细胞生成素（EPO）生产中的HCP污染就曾引发纯红细胞再生障碍（PRCA），这突显了控制HCPs的关键重要性。
因此，在下游纯化过程中有效去除HCPs对于确保产品质量[5]和患者安全[6,7]至关重要。然而，这项任务具有挑战性，因为HCPs通常与目标治疗蛋白具有相似的物理化学性质（如等电点、疏水性、分子量），这使得通过常规纯化步骤（如色谱和过滤）分离它们变得复杂[8,9]。监管指南（如美国药典USP）规定，残留HCP的水平应控制在适当敏感方法的检测限（LOD）以下，行业普遍目标是在最终药物中的残留量为<100 ppm[10, 11, 12]
酶联免疫吸附测定（ELISA）长期以来一直是监测总HCP清除量的金标准方法，因为它具有高通量、高灵敏度和适用于监管环境的优势[13,14]。HCP ELISA试剂的选择通常遵循与产品开发同步的分阶段方法。在早期阶段（临床前到II期），市售的通用试剂盒可以提供快速和便捷的检测。然而，随着产品进入后期开发和商业化阶段（III期及以后），监管要求和最佳实践建议转向更具体的检测方法——要么是平台试剂盒，要么是定制的、特定于工艺的ELISA。这种转变是必要的，因为市售试剂盒并不针对制造商独特的细胞系和生产过程进行优化，这可能导致无法准确检测特定生成的HCP谱[15,16]
尽管传统ELISA具有实用性，但它存在固有的局限性。依赖多克隆抗HCP抗体的检测方法可能无法检测到低丰度、高风险的个别HCPs，并且无法提供物种特异性鉴定[8,17, 18]。相比之下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术越来越多地被用作强大的正交工具[19]。LC-MS/MS提供了更高的分辨率和准确性，能够全面识别HCPs、对其进行谱型分析，并对特定高风险物种进行定量。包括USP在内的监管机构鼓励使用该技术进行表征和补充测试，详见USP <1132.1> [12]
本研究利用了一个原核表达系统的案例来提出一种正交方法。我们认为质谱（MS）最适合全面分析HCP谱并识别特定的高风险杂质，而ELISA则对于高通量、定量监测总HCP水平仍然至关重要。这种互补策略为HCP控制提供了坚实的基础，适用于原核和真核表达平台。
部分摘录
商业HCP ELISA与工艺特异性HCP ELISA性能的比较
为确保患者安全和产品质量，通过宿主系统表达的治疗性抗体必须经过多步纯化以去除杂质，包括HCPs、截断和聚集的成分以及其他过程相关杂质。在本研究中，mAb1（一种在大肠杆菌 BL21中表达的重人源化单克隆抗体Fab片段）通过多步骤正交色谱过程从HCCF中纯化出来。下游纯化流程首先进行CEX1处理
讨论
在基于抗体的治疗药物的监管申报中，需要定制设计的HCP ELISA试剂盒，这是为了保障患者安全和确保产品质量[18]。由于HCP谱具有高度的工艺特异性，会因细胞系、克隆和制造工艺的不同而变化，市售的ELISA试剂可能无法提供足够的覆盖范围，可能无法针对在下游纯化过程中仍然存在的特定HCP杂质亚群产生免疫反应
结论
本研究表明，下游纯化过程对宿主细胞蛋白（HCP）谱有显著影响，原核和真核表达系统之间存在根本性的差异。对于大肠杆菌表达的mAb1，阳离子交换色谱（CEX1）作为主要清除步骤，去除了超过97.6%的HCPs，并显著改变了HCP的组成。CEX1组分中富集了一组来自收获细胞培养液的低丰度HCPs
WuXi AppTec（苏州）有限公司的大肠杆菌HCP试剂盒（目录号：EK24003）包含大肠杆菌HCP参考标准品、HRP标记的抗大肠杆菌抗体、TMB底物、停止溶液和浓缩洗涤缓冲液（20 ×）。
根据制造商的说明，将不同浓度的参考标准品用Milli-Q水稀释至标记浓度（0、3、10、25、50、100和150 ng/mL）。测试样品也按相应的稀释比例进行稀释
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
