一种基于“ICT + ESIPT”机制的AIE活性近红外比率探针，用于线粒体单胺氧化酶（MAO）成像：区分细胞并可视化药物性肝损伤（DILI）

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：An AIE-active NIR Ratiometric probe based on “ICT?+?ESIPT” mechanism for mitochondrial MAO imaging: Distinguishing cells and visualizing DILI

　　

曹婷|李梦进|马红|范哲峰

教育部磁性分子与磁性信息材料重点实验室，山西师范大学化学与化学工程学院，太原030031，中国

摘要

鉴于单胺氧化酶（MAO）在维持胺类物质平衡和肝脏病理学中的关键作用，实时原位监测其活性对于阐明药物诱导的肝损伤（DILI）的机制至关重要。本研究设计并合成了一种基于“ICT + ESIPT”机制的比率型荧光探针AIE-1，该探针结合了聚集诱导发光（AIE）、近红外（NIR）发射和线粒体靶向功能。探针AIE-1利用MAO催化的氧化脱氨基反应触发分子内电荷转移和激发态质子转移过程，在518 nm和712 nm处产生显著的比率荧光信号。通过¹H NMR滴定、HOMO-LUMO能隙的DFT计算以及溶剂极性依赖性实验，彻底验证了这一传感机制，确认了ICT和ESIPT过程的发生。光谱实验表明，该探针对MAO的检测具有宽线性范围（0–140 μg/mL）、高灵敏度（0.23 μg/mL）、强选择性和抗干扰能力。细胞成像实验证实AIE-1能够成功区分正常肝细胞和肝癌细胞中的MAO活性差异，并评估抑制剂的效果。在药物诱导的肝损伤模型中，AIE-1实现了体内MAO活性的实时可视化监测，具有较高的灵敏度和特异性。这种探针为研究MAO在DILI等病理过程中的作用提供了新型且有效的工具。

引言

肝脏作为人体内物质代谢的核心器官，参与乙醇、药物及其他多种化学物质的生物转化过程[1]、[2]、[3]、[4]。由于肝脏在维持机体众多生理功能中不可替代的作用，一旦受损，常常会导致正常功能紊乱，进而引发严重疾病甚至死亡[5]、[6]、[7]。肝损伤的原因多种多样，研究表明酒精和药物是导致急性和慢性肝损伤的常见因素[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。特别值得注意的是，药物诱导的肝损伤已成为对人类健康的重要威胁，主要是因为大多数药物（包括用于治疗肝损伤的药物）都需要通过肝脏代谢。因此，药物诱导的肝损伤在临床诊断和评估中存在一定难度，这可能影响精准治疗的实施效果[10]、[13]、[14]、[15]、[16]。单胺氧化酶是一种广泛存在于肝细胞线粒体外膜的关键功能蛋白，主要负责催化多种内源性和外源性单胺物质的氧化脱氨基反应，在维持肝脏胺类代谢平衡中发挥重要作用[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。近年研究发现，在多种肝损伤模型中，MAO活性异常升高伴随着大量过氧化氢的产生，这会引发线粒体氧化应激、能量代谢紊乱，甚至导致肝细胞凋亡，从而参与并加剧肝脏的病理过程[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。值得注意的是，选择性抑制MAO活性可以显著减少肝组织中的氧化损伤和炎症反应，并在改善线粒体功能和延缓纤维化进展方面展现潜在的保护作用[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。因此，开发高灵敏度和选择性的MAO检测方法对于肝损伤的早期诊断和治疗评估具有重要的临床意义。

荧光成像技术因其高灵敏度、实时可视化和无创优势，已成为生物分子检测和疾病诊断的重要工具[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。然而，传统的有机荧光染料常常受到聚集诱导淬灭（ACQ）效应的影响，在高浓度或细胞聚集状态下荧光强度会急剧下降，严重限制了其在生物成像中的应用。聚集诱导发光（AIE）现象的发现为这一问题提供了革命性的解决方案[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。AIE分子在稀溶液中荧光较弱，但在聚集状态下荧光显著增强，完美克服了ACQ效应的限制。AIE材料在生物成像中具有显著优势：水溶液中的背景荧光极低，而在细胞内或与生物靶标结合后荧光显著增强，实现了高对比度和高信噪比的成像[37]、[42]、[43]、[44]。近红外（NIR）光因其强大的组织穿透能力、对生物组织的自荧光干扰小以及弱光散射特性，被认为是生物成像的“光学窗口”[45]、[46]、[47]、[48]。将AIE特性与近红外发光特性相结合，已成为实现高性能生物成像和分子检测的关键策略。此外，比率型荧光探针可以通过检测两种不同波长下的荧光发射强度并计算其比率，有效消除由于探针浓度差异、光漂白现象、激发光源波动和细胞内分布不均引起的误差，从而大大提高定量分析的准确性和可靠性[34]、[35]、[49]、[50]、[51]、[52]。为了更准确地探索MAO的生物功能，开发高特异性的MAO探针并实现精确的亚细胞定位（如靶向线粒体）对于深入研究MAO的功能具有重要意义。因此，新探针的设计旨在提高检测灵敏度、选择性和亚细胞定位精度，使其更适合用于体内原位监测和成像的实际应用。

基于上述分子设计原理和研究背景，本研究旨在利用双机制（ICT + ESIPT）指导探针设计。具体而言，分子内电荷转移（ICT）过程通过探针分子结构上的电子给体和电子受体基团的协同作用实现。激发态分子内质子转移（ESIPT）过程通过烯醇形式和酮形式之间的质子转移产生双发射特性的相反变化。这两种过程的协同作用使得探针与MAO反应时产生显著的比率荧光信号变化。因此，我们选择了三苯胺作为强电子给体，引入了不同强度的电子受体基团，并扩展了共轭体系。通过利用推拉电子效应和共轭效应的协同作用，我们设计并合成了一种具有聚集诱导发光（AIE）特性和线粒体靶向能力的新型近红外比率荧光探针AIE-1。同时，分子中保留了邻羟基亚胺结构作为ESIPT活性单元，以确保双发射特性。如图1所示，该探针在MAO催化的氧化脱氨基作用下表现出优异的光学性能：探针结构发生转变，调节ICT过程并改变ESIPT平衡，从而导致两个发射峰强度的相反变化。此外，近红外比率成像显著降低了信号与背景的比率，并提高了组织穿透深度。AIE-1成功且高效地实现了不同细胞系中线粒体MAO活性的半定量监测和可视化。更重要的是，该探针有效监测并准确成像了DILI斑马鱼中的MAO活性。

节片段

试剂和方法

实验中使用的所有化学品和试剂均为分析级，购自上海Macklin试剂公司。单胺氧化酶、氯胍和帕金因均购自Aladdin试剂公司。探针储备溶液（浓度为2 mM）在DMSO中配制。在荧光光谱测试中，激发波长为440 nm，发射光谱扫描范围为450 nm至850 nm。激发和发射狭缝宽度均为

在室温下，测试了AIE-1探针在PBS溶液系统中对MAO的紫外可见吸收光谱响应。如图2a所示，探针在约440 nm处表现出最大吸收。随着MAO不断加入反应体系，该峰处的吸光度逐渐增加，并伴随光谱的蓝移。

随后，测试了探针与MAO相互作用前后的荧光特性。

结论

总之，本研究成功开发了一种基于荧光双发射机制（ICT + ESIPT）的线粒体靶向近红外比率荧光探针AIE-1，用于高灵敏度和选择性地检测MAO活性。结合实验和理论方法（包括¹H NMR滴定、溶剂极性依赖性荧光测量和DFT计算）验证了传感机制。

曹婷：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据管理，概念化。李梦进：撰写 – 原稿，方法学，研究，正式分析，数据管理。马红：撰写 – 审稿与编辑，软件，数据管理。范哲峰：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。