《British Journal of Pharmacology》：Toll-like receptor 4 mediates lipopolysaccharide-induced emesis
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背景与目的： 脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）通过激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）诱导炎症和脓毒症。常见的实验动物不表现出呕吐，但在小猪、猫和狗中给予LPS可通过外周机制诱导呕吐。然而，尚无研
背景与目的： 脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）通过激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）诱导炎症和脓毒症。常见的实验动物不表现出呕吐，但在小猪、猫和狗中给予LPS可通过外周机制诱导呕吐。然而，尚无研究证实TLR4是否参与此过程，或TLR4拮抗剂是否具有作为止吐药的临床效用。实验方法： 研究人员将雄性小家鼠（Suncus murinus，麝香家鼠）植入无线电遥测发射器，以检测TLR4是否介导LPS诱导的呕吐及 indicative of ‘恶心’的生理变化（Physiological changes indicative of ‘nausea’, PCIN）。由于小家鼠非常规实验物种，研究人员首先表征了TLR4在脑和外周的分布，以及TLR4拮抗剂瑞沙托维（Resatorvid）在离体回肠上的效能。关键结果： TLR4 mRNA首先在脑干和胃肠道中发现，与人类TLR4有68.94%的同源性。瑞沙托维非竞争性拮抗离体回肠中LPS的抑制作用。行为学研究表明，LPS剂量依赖性地诱导呕吐、增加排便、减少摄食、引起体温过高，并增加脑干中c-Fos和Iba1的表达。LPS增加了胃慢波的主频率（Dominant Frequency, DF），并使缓波（bradygastria）的功率百分比发生偏移。瑞沙托维减少了呕吐、排便和高热反应，以及c-Fos和Iba1免疫反应性的相关增加。瑞沙托维还拮抗了LPS诱导的摄食变化和慢波效应。结论与意义： 这些研究表明，TLR4以及可能的胶质细胞和神经元激活参与了LPS诱导的呕吐和其他行为变化的机制。
论文解读：Toll样受体4在小家鼠脂多糖诱导呕吐中的作用及机制研究
本研究由Luping Liu、Zengbing Lu、Julia Yuen Hang Liu、Man Piu Ngan、Kai-Hei Tse及John Anthony Rudd等研究人员完成，发表于《British Journal of Pharmacology》。研究旨在阐明Toll样受体4（TLR4）在脂多糖（LPS）诱导的呕吐反应中的具体作用及其潜在神经机制，并评估TLR4拮抗剂瑞沙托维（Resatorvid）作为新型止吐药物的临床应用前景。
研究背景与科学问题
革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖（LPS）是引发食物中毒及脓毒症的关键病原体相关分子模式（PAMP），其通过结合LPS结合蛋白（LBP）并转运至TLR4/髓样分化因子2（MD-2）受体复合物激活下游信号通路，导致促炎细胞因子释放及疾病状态。尽管啮齿类动物是研究LPS诱导炎症反应和疾病行为（如厌食、发热）的经典模型，但它们缺乏呕吐反射，这限制了针对LPS诱导的恶心与呕吐（Emesis）机制的深入研究。虽然早期在猪、猫和狗的研究表明LPS可诱导呕吐，但其具体受体机制尚不明确。小家鼠（Suncus murinus）作为一种能够发生呕吐的物种，结合无线电遥测技术，为解决这一科学难题提供了理想的实验平台。本研究的核心问题在于验证TLR4是否介导LPS在小家鼠中的致呕作用，并探究其对外周胃肠道功能及中枢脑干核团神经元活动的影响。
主要关键技术方法
研究人员采用了多种先进技术手段。首先，利用无线电遥测技术结合整体体积描记法（Whole-Body Plethysmography, WBP）同步记录动物的胃肌电活动（Gastric Myoelectric Activity, GMA）、核心体温及呼吸参数，以此量化呕吐事件及 indicative of ‘恶心’的生理变化（PCIN）。其次，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫荧光染色技术，分别在mRNA水平和蛋白水平检测TLR4在组织中的分布以及c-Fos（神经元激活标志物）和Iba1（小胶质细胞标志物）在脑干核团的表达。此外，研究还包括离体器官浴槽实验以评估LPS对回肠电场刺激（EFS）诱导收缩的影响，以及通过腹腔注射LPS建立体内呕吐模型，并结合瑞沙托维进行药理学拮抗实验。样本来源于香港中文大学提供的成年雄性小家鼠。
研究结果
3.1 小家鼠组织中tlr4 mRNA的表达及与人鼠TLR4的同源性
研究人员通过常规PCR分析发现，小家鼠的tlr4 mRNA在脑干、胃、回肠和结肠中均有表达。序列比对显示，小家鼠TLR4氨基酸序列与人类和小鼠的同源性分别为68.94%和61.17%。通过Phyre2.2引擎预测的三维结构模型显示，小家鼠TLR4具有保守的富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeats），这是识别病原体相关分子模式的关键区域，且与人和鼠的TLR4在细胞外域和细胞内域高度相似。
3.2 瑞沙托维非竞争性拮抗LPS对离体回肠EFS诱导收缩的抑制作用
在离体回肠实验中，LPS（0.01至10 μg ml?1）浓度依赖性抑制EFS诱导的收缩，最大抑制率为36.79%。瑞沙托维使LPS的浓度反应曲线右移并降低最大效应，双倒数分析显示其pKb值为6.19，表明其为非竞争性拮抗剂。
3.3 LPS诱导干呕、呕吐、排便及摄食减少
体内行为学观察显示，腹腔注射LPS（2–10 mg kg?1）可剂量依赖性地诱发小家鼠干呕和/或呕吐，并伴有潜伏期缩短。同时，LPS显著减少了动物24小时内的累积摄食量，并在给药后早期（2–4小时）增加了排便频率。值得注意的是，迷走神经切断术并未改变LPS诱导的呕吐反应，提示可能存在非迷走神经依赖的通路。
3.4 LPS诱导高热并改变胃肌电活动，但不影响呼吸
LPS注射后引起了持续约5小时的剂量依赖性高热（体温升高约1.9°C）。在胃肌电活动方面，LPS增加了胃慢波的主频率（DF），提高了缓波（bradygastria）的功率百分比，降低了正波（normogastria）和速波（tachygastria）的功率百分比。在整个观察期内，LPS未显著改变呼吸参数。
3.5 瑞沙托维拮抗LPS诱导的干呕、呕吐、摄食减少及排便增加
预处理瑞沙托维（3和10 mg kg?1）显著减少了LPS（5 mg kg?1）诱导的干呕/呕吐次数和发作频率，缩短了潜伏期，并逆转了LPS引起的摄食抑制和早期排便增加。
3.6 瑞沙托维拮抗高热、增加DF及改变胃肌电功率分布，但不影响呼吸
瑞沙托维有效阻断了LPS引起的高热反应，恢复了被LPS扰乱的胃慢波主频率（DF）及各波段（缓波、正波、速波）的功率百分比分布。与LPS单独处理组相比，瑞沙托维处理组的胃肌电活动更接近基线水平，且呼吸参数未受影响。
3.7 LPS在给药后4小时诱导脑干c-Fos和Iba1表达
免疫荧光结果显示，LPS处理后4小时，在脑干的最后区（Area Postrema, AP）、孤束核（Nucleus Tractus Solitarius, NTS）和迷走神经背侧运动核（Dorsal Motor Nucleus of the Vagus, DMNV）中，Iba1阳性细胞（小胶质细胞）和c-Fos阳性细胞（神经元）的数量显著增加。瑞沙托维预处理能有效抑制LPS在上述核团诱导的Iba1和c-Fos表达上调。
结论与讨论
研究人员在讨论中指出，本研究首次证实了TLR4在小家鼠LPS诱导的呕吐机制中起关键作用。尽管迷走神经切断未能阻断呕吐反应，提示可能存在中枢介导的非迷走神经途径，但瑞沙托维对离体回肠的作用表明外周机制亦参与其中。研究观察到LPS诱导了脑干关键核团（AP、NTS、DMNV）中小胶质细胞和神经元的激活，且这一过程可被瑞沙托维阻断，这揭示了胶质细胞可能作为新的止吐治疗靶点。此外，LPS导致的胃肌电活动紊乱（如DF升高和功率重分布）与恶心感（PCIN）的生理指标高度吻合。综上所述，该研究不仅确立了TLR4作为LPS致呕的关键受体，还提出了TLR4拮抗剂（如瑞沙托维）有望成为治疗炎症性恶心和呕吐的一类新型止吐药物，具有重要的转化医学意义。
