琥珀酸通过GPR91-HIF-1α-TGF-β1-Smad信号通路激活成纤维细胞

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Succinate activates fibroblasts through GPR91-HIF-1α-TGF-β1-Smad signaling

　　张子源|王子文|孙海梅|周德山|马伟
首都医科大学基础医学院组织学与胚胎学系，北京，100069，中国

**摘要**
**目的**
探讨琥珀酸在年龄相关性心脏纤维化中的作用及其机制。

**方法**
在本研究中，我们建立了三个实验模型：自然衰老的小鼠、通过饮用水给予琥珀酸的年轻小鼠以及暴露于琥珀酸的NIH/3T3成纤维细胞。测定这些样本中血清和心肌组织中的琥珀酸浓度。同时测量GPR91、HIF-1α和纤维化相关标志物的蛋白水平，以及TGF-β1的分泌和Smad2/3的磷酸化。通过过表达和抑制实验来验证信号通路。

**结果**
衰老小鼠和通过饮用水接受琥珀酸的小鼠的血清和心脏组织中琥珀酸水平均显著升高，且琥珀酸受体GPR91的表达也增加。向年轻小鼠口服琥珀酸后，出现了类似衰老过程的心肌纤维化变化。在培养的NIH/3T3细胞中，琥珀酸暴露促进了纤维化表型的形成。进一步研究发现，琥珀酸首先增加了GPR91的表达，随后促进了HIF-1α的表达，导致TGF-β1的分泌和Smad2/3的磷酸化。阻断GPR91或HIF-1α可以防止这些纤维化变化；然而，当加入TGF-β1时，被GPR91抑制的细胞中的纤维化表型会恢复。值得注意的是，一种Smad通路抑制剂完全消除了琥珀酸诱导的纤维化。

**结论**
总之，琥珀酸通过GPR91-HIF-1α-TGF-β1-Smad信号通路诱导心脏纤维化。

**1. 引言**
心脏纤维化是多种心血管疾病进展的共同病理特征（Zhang等，2021；Frangogiannis，2021），如心肌梗死（Chen等，2022）、高血压性心脏病（Zhang等，2022）和扩张型心肌病（Lu等，2021），最终导致心力衰竭。其病理特征是成纤维细胞的过度激活和增殖，这些细胞会转化为产生基质的肌成纤维细胞[5]，导致胶原沉积增加、心肌硬度增加和电传导异常，最终引发心力衰竭并严重损害心脏功能（Czubryt & Hale，2021）。尽管目前用于治疗心血管疾病的药物（如肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）阻滞剂和β-肾上腺素能受体拮抗剂）可以在一定程度上减缓心力衰竭的进展（Patel等，2021；Strauss等，2023；B?uf-Gibot等，2021），但直接针对和缓解心肌纤维化的有效策略仍需进一步探索，这是在心血管领域面临的主要挑战。

值得注意的是，心肌纤维化的发生和发展与衰老呈正相关。即使在没有原发性心脏疾病（如明显的心肌缺血或压力负荷）的老年人中，心脏间质中也会出现胶原沉积增加和间质纤维化，这种现象称为“年龄相关性心脏纤维化”（Chen等，2022；Ma & Wang，2022；Ko等，2022）。这种与衰老相关的纤维化变化是老年人心脏舒张功能障碍的重要结构基础（Yamada等，2025；Tuleta等，2024）。因此，阐明年龄相关性心脏纤维化的机制对于开发治疗老年心脏衰老和心力衰竭的方法至关重要。

近年来，代谢紊乱在器官纤维化发病机制中的作用日益突出（Man等，2023；Sofias等，2021）。除了能量代谢外，细胞代谢物现在被认为是基因表达、细胞增殖和分化等基本过程的关键信号调节因子（Wang等，2025a）。琥珀酸作为三羧酸循环中的关键中间体，其传统作用已被充分理解（Shen等，2025；Wei等，2023）。最近的研究表明，在包括缺血、缺氧和炎症在内的病理条件下，线粒体功能障碍会促进琥珀酸在细胞内的积累及其向细胞外环境的释放（Zhang & Lang，2023；Xu等，2025）。在细胞外，琥珀酸与其特异性受体GPR91结合，参与免疫炎症、血压稳态和纤维化的调节（Peace & O'Neill，2022；Le等，2023；Khamaysi等，2023）。特别是在肾脏（Tao等，2025）和肝脏（Pu等，2024）纤维化的研究中，已经初步证实了琥珀酸-GPR91信号通路的促纤维化作用。尽管已有研究证实衰老心脏中琥珀酸的异常积累（Wang等，2025a），但它是否作为上游信号直接驱动年龄相关性心脏纤维化，以及其在分子水平上的作用机制仍有待阐明。

TGF-β1被广泛认为是最强大的纤维化驱动因素（Mills等，2021）。其促纤维化作用的核心是Smad（特别是Smad2/3）通路的激活（Aashaq等，2022），这又促进了成纤维细胞的激活和细胞外基质（ECM）的合成。有趣的是，一些研究表明GPR91的激活可能与HIF-1α的稳定有关（Chen等，2024a）。HIF-1α在缺氧感知中起关键作用，可直接诱导TGF-β1基因的表达（Chen等，2024b）。这使我们提出了一个科学假说：衰老心脏中异常积累的琥珀酸可能激活GPR91受体，进而上调HIF-1α的表达。HIF-1α随后会进一步促进TGF-β1的产生并激活Smad信号通路，最终导致纤维化的发生。

为了回答这个问题，我们采用了三种方法：衰老小鼠、接受琥珀酸的年轻小鼠和细胞培养。我们旨在确定琥珀酸是否在衰老心脏中积累，如果确实积累，它是否通过GPR91-HIF-1α-TGF-β1-Smad通路驱动纤维化。

**2. 材料与方法**
2.1. 细胞培养和实验处理
美国典型培养物保藏中心（ATCC，编号CRL-1658）提供了NIH 3T3细胞。使用含有10%胎牛血清（编号04-001-1ACS，Biological Industries）和1%青霉素/链霉素（编号15140122，Gibco）的DMEM（编号C11995500BT，Gibco）在37°C、5% CO2环境中培养细胞。将细胞以2×10^5个细胞/孔的密度接种到六孔板中，然后让细胞在无血清和无抗生素的DMEM中过夜饥饿。

为了研究琥珀酸的作用，细胞被暴露于20 mM的琥珀酸中48小时。在给予琥珀酸之前，细胞进行了以下预处理：（1）通过质粒转染过表达GPR91（Lipofectamine 3000，Invitrogen，编号L3000015）或通过siRNA转染敲低GPR91；（2）用20 μM的HIF-1α抑制剂KC7F2（Narita等，2009；MCE，HY-18777）处理；（3）用5 ng/mL的TGF-β1（R&D Systems，7666-MB-005）处理；（4）用10 μM的Smad抑制剂SB431542（Halder等，2005；MCE，HY-10431）处理。

2.2. 动物和模型
小鼠在受控条件下饲养（12小时光照/黑暗周期，22±2°C，55±5%湿度），可自由获取食物和水。所有实验方案均得到了动物护理和使用委员会的批准。所有实验均使用体重20–25克的雄性C57BL/6小鼠进行。

为了研究琥珀酸在年轻小鼠中促进器官纤维化的作用，建立了两组：对照组（Ctrl）和对照组+琥珀酸组（Ctrl + SA）。两个月大的雄性C57BL/6小鼠被给予含有或不含1.5%（重量/体积）琥珀酸钠的水（Wang等，2025b；编号224731，Sigma-Aldrich），持续三个月，以模拟衰老小鼠心肌中的琥珀酸水平，水每隔一天更换一次。治疗期结束后，小鼠被安乐死，并采集组织进行后续固定和分析。

治疗期结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。通过心脏穿刺采集血液并转移到离心管中。血液在室温下静置30–60分钟使其凝固，然后在4°C下以1500–2000×g离心15分钟。收集的血清小心保存在-80°C以备后续测量琥珀酸浓度。血液采集后，迅速切除心脏组织，用冰冷的PBS冲洗以去除残留血液，然后按以下步骤处理：一部分心脏组织立即用4%的甲醛固定24小时用于石蜡包埋和组织学分析；另一部分快速冷冻在液氮中，然后保存在-80°C用于蛋白质提取和Western blot分析。在深度麻醉下，通过颈椎脱位对小鼠进行安乐死。

2.3. Western blot分析
使用RIPA裂解缓冲液（编号C1053，Applygen，中国），加入蛋白酶抑制剂混合物（编号P8340，Sigma-Aldrich）和磷酸酶抑制剂混合物（编号P5726，Sigma-Aldrich）进行总蛋白质提取。使用BCA蛋白测定试剂盒（编号P1511，Applygen）进行蛋白质定量。SDS-PAGE分离等量的蛋白质样本后，将蛋白质转移到PVDF膜上。然后用5%的非脂肪牛奶或TBST中的BSA（含0.05% Tween-20）封闭膜。膜在4°C下与抗α-SMA（Abcam，ab220935，1:1000）、抗FN1（Abcam，ab272488，1:1000）、抗Col1（Abcam，ab260043，1:2000）、抗Col3（Proteintech，22734-1，1:500）、抗HIF-1α（CST，36169，1:1000）、抗TGF-β（CST，49728，1:1000）、抗p-Smad2/3（CST，8828，1:1000）和抗β-actin抗体（Abcam，ab8226，1:5000）孵育过夜。膜在室温下用二次抗体孵育1小时。使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad，编号1705060）显色，并用Fusion FX（Vilber Lourmat，法国）捕捉图像。蛋白质水平以β-actin为基准进行归一化。

2.4. RNA提取和实时PCR
使用Trizol（Life Technologies，15596026）制备RNA，并使用All-In-One RT Master Mix（ABM，G486）在Veriti热循环仪（Applied Biosystems）中生成cDNA。qPCR在ABI 7500（Life Technologies）上进行，使用SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，A25742）。引物根据GenBank序列设计并由Sangon Biotech合成。β-actin的正向引物为5′-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3′，反向引物为5′-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′。扩增程序包括95°C预热10分钟，然后是40个循环：95°C 10秒、60°C 10秒和72°C 40秒。使用2-ΔΔCt方法将基因表达水平归一化到β-actin。

2.5. HE和Picro-Sirius Red
组织切片用苏木精和伊红（HE）染色进行组织学评估，并根据制造商的方案用Picro-Sirius Red（Abcam，ab150681）在偏振光显微镜下评估胶原沉积。

2.6. 免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）
IHC在用4% PFA固定的石蜡包埋切片上进行。柠檬酸缓冲液抗原修复后，切片被封闭（20分钟，ZSGB-BIO，PV-6001），并在4°C下与抗GPR91（Novus，NLS3315，1:300）孵育过夜，然后在室温下与二次抗体（ZSGB-BIO，PV-6001）孵育1小时。显色检测使用DAB试剂盒（ZSGB-BIO，ZLI-9019）。

IF通常在石蜡包埋切片上进行，非特异性结合用1% BSA（Sigma-Aldrich，V900933）阻断，随后与抗α-SMA（Abcam，ab220935，1:1000）、抗FN1（Abcam，ab272488，1:1000）、抗Col1（Invitrogen，PA1-26204，1:200）、抗Col3（Proteintech，22734-1，1:300）和抗GPR91（Novus，NLS3315，1:300）孵育。用PBS洗涤后，切片在室温下与适当的Alexa Fluor标记的二次抗体（例如Alexa Fluor 488或594，1:500，Invitrogen）孵育1小时。细胞核用DAPI（Sigma-Aldrich，D9542）复染5分钟。

2.7. 琥珀酸测量
使用商业试剂盒（Abcam，ab204718）根据制造商的方案测定血浆和组织中的琥珀酸浓度。

2.8. 统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示，并使用GraphPad Prism 9.0可视化。每组的样本量显示在散点图中或相应的图例中。统计显著性在图例中用?P< 0.05、??P< 0.01和???P< 0.001表示，与相应对照组相比。P< 0.05的差异被认为具有统计学意义。组间比较使用Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验进行多重比较。

**3. 结果**
3.1. 琥珀酸刺激成纤维细胞激活
为了确定琥珀酸在心脏纤维化中的作用，我们将小鼠分为三组：年轻组、老年组和接受琥珀酸的年轻组。然后，我们测量了它们心脏和血液中的琥珀酸浓度。如图1A和B所示，与年轻小鼠相比，衰老小鼠的两种组织中的琥珀酸水平显著升高。这些结果表明琥珀酸水平与心脏衰老之间存在正相关。放大倍数：×20。 (F) 对年轻、老年和经琥珀酸处理的小鼠心肌组织中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行Western blot分析。 (G) 对对照组和经琥珀酸处理的NIH/3T3细胞中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行代表性的免疫荧光成像。放大倍数：×20。 (H) 对对照组和经琥珀酸处理的NIH/3T3细胞中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行Western blot分析。 ?P< 0.05，??P< 0.01，???P < 0.001。接下来，我们检查了心脏中的纤维化程度。使用HE和Picro-Sirius Red对组织进行染色后发现，与年轻对照组相比，老年小鼠表现出明显的心肌紊乱和广泛的胶原沉积，主要发生在间质空间（图1C和D）。值得注意的是，接受三个月琥珀酸饮水的年轻小鼠表现出与老年小鼠相似的纤维化表型，胶原阳性区域显著增加（图1D）。我们还通过免疫荧光检测到了纤维化标志物（α-SMA、FN、Col1和Col3）。心肌切片的免疫荧光染色（图1E）显示，与年轻对照组相比，老年小鼠中所有四种纤维化标志物的荧光信号显著增强。接受琥珀酸处理的年轻小鼠也显示出类似的增加，进一步证实了琥珀酸在体内的促纤维化作用。Western blot分析（图1F）定量确认了这些观察结果：α-SMA、FN、Col1和Col3的蛋白质水平在老年小鼠和经琥珀酸处理的年轻小鼠中均显著升高。

为了研究琥珀酸的作用机制，我们转向了培养的NIH/3T3成纤维细胞。将细胞分为经琥珀酸预处理的组和未处理的对照组。免疫荧光染色显示，经琥珀酸预处理的细胞显示出α-SMA、FN1、Col1和Col3的荧光信号显著增强（图1G）。通过Western blot，我们确认琥珀酸预处理上调了FN1、Col1和Col3，并显著增加了肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达（图1H）。总之，这些发现表明琥珀酸在体内和体外都能促进成纤维细胞的激活和ECM的产生。

3.2. 琥珀酸通过GPR91促进成纤维细胞激活并加剧心脏纤维化
我们研究了琥珀酸发挥其作用的受体机制。Western blot分析（图2A–B）显示，老年小鼠中的GPR91蛋白水平约为年轻对照组的2.0倍（P < 0.0001）。同样，接受三个月琥珀酸处理的年轻小鼠与未处理的年轻对照组相比，GPR91蛋白也有所增加（P < 0.001）。qRT-PCR分析（图2C）证实这些变化发生在转录水平：老年小鼠中的GPR91 mRNA增加了约2.3倍，经琥珀酸处理的年轻小鼠增加了约1.8倍（两者均P < 0.0001），这与蛋白质数据一致。这些结果表明，自然衰老和外源性琥珀酸给药都会导致GPR91表达增加。

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图2. 琥珀酸通过GPR91促进成纤维细胞激活并加剧心脏纤维化。 (A-B) 对年轻、老年和经琥珀酸处理的小鼠心肌组织中的GPR91进行Western blot分析（A）和定量分析（B），n = 3。数据使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验。 (C) 对年轻、老年和经琥珀酸处理的小鼠心肌组织中的GPR91 mRNA进行qPCR分析，n = 3。数据使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验。 (D-E) 对年轻、老年和经琥珀酸处理的小鼠心肌组织中的GPR91进行代表性的IHC（D）和IF（E）成像。放大倍数：×40（D），×20（E）。 (F) 显示年轻、老年和经琥珀酸处理的小鼠心肌组织中GPR91共定位的代表性IF图像。放大倍数：×40。 (G-H) 对对照组和经琥珀酸处理的NIH/3T3细胞中的GPR91进行WB（G）和定量分析（H），n = 3。数据使用非配对双尾Student's t检验。 (I) 对对照组和经琥珀酸处理的NIH/3T3细胞中的GPR91 mRNA进行qPCR分析，n = 3。数据使用非配对双尾Student's t检验。 (J) 显示对照组和经琥珀酸处理的NIH/3T3细胞中α-SMA阳性细胞中GPR91共定位的代表性IF图像。放大倍数：×20。 ?P< 0.05，??P< 0.01，???P < 0.001。

通过IHC和IF在组织原位观察GPR91的表达。这些分析同样显示老年小鼠的心肌中GPR91阳性信号更强，经琥珀酸处理组也有类似的结果（图2D和E）。为了确定哪些细胞表达GPR91，我们对心脏组织进行了GPR91和α-SMA的染色。在老年和经琥珀酸处理的小鼠的心肌中观察到GPR91和α-SMA信号的共定位，表明GPR91主要在活化的成纤维细胞中表达（图2F）。这表明活化的成纤维细胞是琥珀酸的关键靶点。

在NIH/3T3细胞实验中，Western blot（图2G）和qRT-PCR（图2I）分析确认，琥珀酸处理显著上调了GPR91蛋白和mRNA的表达。双免疫荧光染色显示，在经琥珀酸预处理的NIH/3T3细胞中，GPR91信号显著增强，并与α-SMA（活化的成纤维细胞标志物）明显共定位。这种共定位模式也在老年和经琥珀酸处理的小鼠的心肌组织中观察到（图2F），表明活化的成纤维细胞是琥珀酸在心脏纤维化中的主要细胞靶点。这些结果表明GPR91是琥珀酸的功能受体，而琥珀酸本身可以正向反馈以促进其受体的表达。

3.3. GPR91介导的TGF-β1/Smad信号通路对琥珀酸诱导的成纤维细胞激活至关重要
为了验证GPR91及其下游信号通路的功能，我们在NIH/3T3细胞中进行了进一步实验。我们将细胞分为三组：对照组、经琥珀酸处理的组和经琥珀酸处理并敲低GPR91的组。IF和Western blot分析显示，经琥珀酸处理的细胞显示出α-SMA、FN1、Col1和Col3的表达显著高于对照组细胞。然而，当GPR91被敲低时，琥珀酸诱导的这些蛋白质的上调被显著抑制（图3A和B）。

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图3. GPR91介导的TGF-β1/Smad通路对琥珀酸诱导的成纤维细胞激活至关重要。 (A) 对对照组、经琥珀酸处理的组和经琥珀酸+GPR91敲低组的NIH/3T3细胞中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行代表性的IF成像。放大倍数：×20。 (B-C) 对对照组、经琥珀酸处理的组和经琥珀酸+GPR91敲低组的NIH/3T3细胞中的GPR91、FN、α-SMA、Col1和Col3进行Western blot分析（B）和定量分析（C），n = 3。数据使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验。 (D-E) 对对照组、经琥珀酸处理的组、经琥珀酸+GPR91敲低组的NIH/3T3细胞中的HIF-1α、TGF-β1和p-Smad2/3进行Western blot分析（D）和定量分析（E），n = 3。数据使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验。 (F) 对对照组、经琥珀酸处理的组、经琥珀酸+GPR91过表达组、经琥珀酸+GPR91敲低组以及经琥珀酸+GPR91敲低+TGF-β1补充组的NIH/3T3细胞中的HIF-1α和p-Smad2/3进行Western blot分析。 (G) 对对照组、经琥珀酸处理的组、经琥珀酸+GPR91过表达组、经琥珀酸+GPR91敲低组以及经琥珀酸+GPR91敲低+TGF-β1补充组的NIH/3T3细胞中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行代表性的IF成像。放大倍数：×20。 ?P< 0.05，??P< 0.01，???P < 0.001。

接下来，我们研究了潜在的信号通路分子。Western blot分析显示，琥珀酸刺激显著增加了HIF-1α、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白质表达。相比之下，GPR91沉默有效地抑制了琥珀酸介导的这些蛋白质水平的增加（图3D）。为了更精确地描绘该通路中分子的上游-下游关系，我们设计了更详细的实验设置，包括对照组、经琥珀酸处理的组、经琥珀酸+GPR91过表达组、经琥珀酸+GPR91敲低组以及经琥珀酸+GPR91敲低+TGF-β1组。Western blot分析显示，经琥珀酸+GPR91过表达组的靶蛋白水平最高。经琥珀酸处理的组和经琥珀酸+GPR91敲低+TGF-β1组的表达水平相当，而经琥珀酸+GPR91敲低组的表达水平仅略高于对照组（图3F）。免疫荧光检测如α-SMA和FN等标志物得到了一致的结果（图3G）。这些发现为信号通路的层次结构提供了关键证据。首先，GPR91过表达进一步增强了琥珀酸诱导的HIF-1α和p-Smad2/3的表达，证实GPR91位于这些分子的上游。其次，GPR91敲低显著抑制了琥珀酸诱导的HIF-1α和p-Smad2/3的上调，表明GPR91是琥珀酸激活这一信号级联反应所必需的。最重要的是，在GPR91敲低细胞中外源性补充TGF-β1完全恢复了p-Smad2/3水平和纤维化标志物的表达（图3F–G），尽管HIF-1α仍然受到抑制。这种恢复表明TGF-β1在GPR91和HIF-1α的下游起作用，并且外源性TGF-β1可以在GPR91水平上绕过阻断。总体而言，这些结果建立了线性信号级联：琥珀酸 → GPR91 → HIF-1α → TGF-β1 → p-Smad2/3 → 成纤维细胞激活。

3.4. 琥珀酸通过刺激GPR91介导的HIF-1α/TGF-β1/Smad信号通路诱导成纤维细胞激活
为了确定HIF-1α作为连接GPR91与下游信号的关键介质，并确定Smad激活是否构成纤维化进展的最终步骤，我们进行了一系列更深入的机制实验。我们假设如果HIF-1α确实是连接GPR91和TGF-β1的关键节点，那么在抑制HIF-1α后，即使上游信号仍然完整，下游的纤维化反应也应被阻断。此外，如果在这种情况下补充TGF-β1，它应该可以绕过HIF-1α的减少并恢复纤维化过程。

建立了五个细胞组以进行验证：(1) 未处理的细胞，(2) 经琥珀酸处理的细胞，(3) 先用HIF-1α抑制剂处理后再用琥珀酸处理的细胞，(4) 先用HIF-1α抑制剂处理后再补充外源性TGF-β1的细胞，以及(5) 先用HIF-1α抑制剂处理后再同时补充HIF-1α抑制剂和TGF-β1的细胞。结果与我们的假设一致，所有组中的GPR91水平没有变化（图4A）。这证实了药理干预针对的是下游信号。对下游信号分子的分析显示：与对照组（1）相比，经琥珀酸处理（2）的细胞中HIF-1α、TGF-β1和p-Smad2/3的水平增加。然而，这种上调被HIF-1α的抑制所消除（3），表明HIF-1α位于TGF-β1和Smad2/3的上游。

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图4. 琥珀酸通过刺激GPR91介导的HIF-1α/TGF-β1/Smad通路诱导成纤维细胞激活。NIH/3T3细胞组：对照组、经琥珀酸处理的组、经琥珀酸+HIF-1α抑制剂组、经琥珀酸+HIF-1α抑制剂+TGF-β1补充组以及经琥珀酸+HIF-1α抑制剂+TGF-β1补充组。 (A-B) 对所有NIH/3T3细胞组中的GPR91、HIF-1α、TGF-β1和p-Smad2/3进行Western blot（A）和定量分析（B），n = 3。数据使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验。 (C) 对所有NIH/3T3细胞组中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行代表性的IF成像。放大倍数：×20。 (D) 对所有NIH/3T3细胞组中的FN、α-SMA、Col1和Col3进行Western blot。 ?P< 0.05，??P< 0.01，???P < 0.001。

对(4)和(5)的分析提供了进一步的机制见解。当我们在HIF-1α被抑制的细胞中添加TGF-β1（4）时，p-Smad2/3和纤维化标志物的水平恢复到仅用琥珀酸（2）时的水平（图4A、C、4D）。这表明TGF-β1在HIF-1α的下游起作用并介导信号。在组4和5中，尽管存在外源性TGF-β1，Smad抑制剂处理抑制了成纤维细胞的激活并减少了纤维化标志物的表达（图4C和D）。这些发现表明Smad2/3的磷酸化是通过该信号通路诱导成纤维细胞激活的最终和必要步骤。正如预期的那样，所有实验组中的GPR91蛋白水平保持不变（图4A，顶部面板），证实HIF-1α抑制剂KC7F2和Smad抑制剂SB431542特异性地作用于下游靶点，而不影响上游受体。这些发现验证了本研究中使用的药理干预的特异性。

总之，这些数据确立了HIF-1α作为连接GPR91激活与TGF-β1产生及随后Smad依赖性纤维化的重要节点分子。没有HIF-1α，通过GPR91的琥珀酸信号无法诱导TGF-β1和下游的纤维化反应，从而将HIF-1α置于这一通路中的关键检查点。

4. 讨论
通过一系列体内和体外实验，这项工作证明了琥珀酸是心脏纤维化的关键驱动因素，并阐明了从代谢信号到纤维化表现的潜在分子通路。这一发现不仅将细胞代谢与组织纤维化的病理过程联系起来，还加深了我们对与年龄相关的心脏疾病机制的理解。其中，琥珀酸-GPR91轴在促进心脏纤维化中起着关键作用。这符合关于衰老如何导致线粒体功能障碍和代谢失衡的理论（Wei等人，2025年）。研究发现，琥珀酸可以激活GPR91，并且还能正向反馈增加其受体GPR91的表达（Yang等人，2023年）。这种正反馈循环一旦被触发，很可能会促进心脏纤维化的自我持续发展，并为解释为什么即使初始触发因素（如琥珀酸积累）被消除，纤维化仍可能继续进展提供了新的理论基础。因此，GPR91是一个有吸引力的治疗靶点，敲低GPR91可能同时抑制琥珀酸的直接信号效应并打破这一正反馈循环。本研究确定了HIF-1α作为中间链接分子；它是连接GPR91与经典TGF-β1/Smad通路的桥梁。尽管先前的研究表明，在缺氧条件下琥珀酸与HIF-1α相关，并且HIF-1α调节TGF-β1（Mortezaee, 2025；Zhang et al., 2024），但通过严格的功能实验，这种在成纤维细胞中的连续信号级联反应得到了证实。抑制GPR91或HIF-1α可以有效抑制TGF-β1/Smad的激活和纤维化，而外源性TGF-β1可以有效地绕过GPR91或HIF-1α缺乏引起的干扰，恢复下游信号转导。值得注意的是，我们观察到HIF-1α的激活并不需要低氧环境；代谢信号本身就可以激活它；我们在老化的心脏中观察到了这一点。可以说，这为我们对HIF-1α的理解增添了新的维度。这项研究有两个重要的临床意义：首先，测量血液或组织中的琥珀酸和GPR91水平可以帮助识别心脏纤维化的高风险个体及其进展程度；其次，我们可以针对其上游节点（如GPR91或HIF-1α）进行干预，而不是直接针对TGF-β1，因为后者容易产生副作用（Mitra et al., 2025；Yap et al., 2024；Han et al., 2024）。这些靶点可能具有更好的组织特异性并减少脱靶效应。

在这项研究中，我们使用NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞作为体外模型来研究琥珀酸的促纤维化效应。我们认识到，尽管NIH/3T3细胞由于其可重复的表型和易于基因操作而在纤维化研究中是一个成熟且广泛使用的模型，但它们并不能完全再现成年原代心脏成纤维细胞的特性。因此，从该细胞系获得的结果可能无法完全反映老化心脏中心脏成纤维细胞的生理反应。未来的研究应该使用从老化小鼠或琥珀酸处理的小鼠中分离出的原代心脏成纤维细胞来验证本研究的关键发现。这样的验证对于确认琥珀酸-GPR91-HIF-1α-TGF-β1-Smad信号轴在心脏纤维化中的转化相关性至关重要。在本研究中，我们使用了20 mM的琥珀酸，这高于生理水平。未来的研究应该探索更接近生理水平的琥珀酸浓度（例如0.1–5 mM），以更好地模拟体内条件。

这项研究有几个需要承认的局限性：首先，我们使用NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞作为体外模型来研究琥珀酸的促纤维化效应，尽管该细胞模型在纤维化研究中因其可重复的表型和易于基因操作而得到广泛应用，但它们并不能完全再现成年原代心脏成纤维细胞的特性。因此，从该细胞系获得的结果可能无法完全反映老化心脏中心脏成纤维细胞的生理反应。未来的研究应该使用从老化小鼠或琥珀酸处理的小鼠中分离出的原代心脏成纤维细胞来验证本研究的关键发现。其次，我们主要研究了与老化相关的纤维化以及直接给予琥珀酸的模型。然而，尚不清楚这一通路是否也参与其他类型的心脏纤维化，例如由压力过载（An et al., 2021）或心肌梗死（Chen et al., 2025）引起的纤维化。此外，我们没有探讨琥珀酸对心脏中其他细胞（心肌细胞（Meng et al., 2023）、内皮细胞（Fan et al., 2025）或免疫细胞（Rurik et al., 2021）的影响。此外，已知琥珀酸会触发巨噬细胞的炎症（P?lsson-McDermott & O'Neill, 2025；Trauelsen et al., 2021），而炎症会促进纤维化（Savin et al., 2022）。最后，我们需要弄清楚琥珀酸在老化心脏中积累的原因。本研究发现了琥珀酸在老化心脏中的积累，并初步将其归因于线粒体功能障碍和SDH活性的相对不足。然而，由于实验限制，我们无法直接评估老化心脏组织中的线粒体膜电位、呼吸链复合体的酶活性（尤其是复合体I、II、III和IV）或关键TCA循环酶（如SDH和α-酮戊二酸脱氢酶）的表达和功能状态。因此，上述上游机制主要是基于文献推断的，而不是由本研究的直接实验证据支持的。未来的研究应该系统地评估老化心脏中的线粒体功能，包括：①检测线粒体膜电位（例如使用JC-1染色或TMRM探针）以反映线粒体能量耦合状态；②测量呼吸链复合体I-IV的酶活性以确定功能障碍的关键节点；③检查SDH和其他TCA循环酶的蛋白质表达和活性水平，并结合代谢通量分析，以精确阐明琥珀酸代谢失衡的酶学基础。现有文献表明，衰老过程中NAD+水平的下降会导致去乙酰化酶SIRT3的活性降低，进而导致线粒体酶（如SDH）的过度乙酰化和失活（Goetzman et al., 2023；He et al., 2012），这可能是琥珀酸积累的上游分子事件之一。后续研究可以沿着这个方向进行深入验证。阐明上述上游机制不仅有助于完成从老化相关代谢重编程到心脏纤维化的理论链，还可能为早期干预提供新的代谢靶点。

需要指出的是，本研究纯属实验性，所有结论均来自动物模型和细胞培养系统。琥珀酸和GPR91作为心脏纤维化的生物标志物或治疗靶点的临床相关性尚未在人类样本中得到验证。因此，在将现有发现外推到临床实践时应谨慎行事。迫切需要设计良好的临床队列研究，以评估循环中的琥珀酸水平或心肌GPR91表达是否与老年人群中心脏纤维化的程度相关，并确定用于诊断的最佳检测阈值。这些研究对于弥合基础研究与临床应用之间的差距非常重要。

结论：我们确定琥珀酸激活GPR91，从而诱导HIF-1α/TGF-β1/Smad通路并导致心脏纤维化。这种代谢与组织重塑之间的联系可能提供新的生物标志物和治疗靶点。尽管本研究没有进行针对GPR91或HIF-1α的体内干预实验，但我们的发现为这类研究提供了强有力的理论基础。基于此处确定的信号轴，我们建议未来的实验使用经过特定GPR91拮抗剂或HIF-1α抑制剂处理的老化小鼠模型进行。这些抑制剂可以通过腹腔注射或口服给药，持续4到6个月，之后应评估心脏纤维化标志物（α-SMA、Col1、Col3）、胶原沉积（Sirius Red染色）和下游信号分子（TGF-β1、p-Smad2/3）。这样的体内干预研究将直接有助于验证针对琥珀酸-GPR91-HIF-1α信号轴治疗年龄相关心脏纤维化的治疗潜力。

作者贡献声明：
Ziyuan Zhang：撰写——原始草案、验证、方法学、数据管理、概念化。
Ziwen Wang：方法学、概念化。
Haimei Sun：验证、软件、资源。
Deshan Zhou：软件、资源。
Wei Ma：方法学、概念化。

伦理批准：本研究遵循赫尔辛基宣言，并获得了首都医科大学伦理委员会的批准（AEEI-2021-003）。

数据可用性声明：支持本研究发现的数据可在合理请求下从相应作者处获得。

资金声明：本研究由首都医科大学资助。