电离辐射对乳腺癌患者放疗后miR-99b-5p表达的影响

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：The influence of ionizing radiation on miR-99b-5p expression in patients with breast cancer following radiotherapy

　　索马耶·达武迪（Somaye Davoudi）、阿里·沙贝斯塔尼·蒙法雷德（Ali Shabestani Monfared）、哈莱·阿克哈万·尼亚基（Hale Akhavan Niyaki）、达尼亚尔·法齐拉特帕纳（Daniyal Fazilatpanah）、库鲁什·易卜拉欣·内扎德（Kourosh Ebrahim Nezhad）、萨德格·法塔希（Sadegh Fatahi）、阿里·比扎尼（Ali Bizhani）、巴哈尔·扎加里（Bahar Zargari）
伊朗巴巴尔医科大学学生研究委员会

**摘要**
**引言**
乳腺癌是女性中最常见的癌症之一，每年新发病例占比超过10%。在过去二十年里，微小RNA（miRNAs）被证实是乳腺癌发病机制、进展、预后和治疗中的关键调节因子。其中，miR-99b-5p参与了癌细胞的分化、迁移和增殖过程。此外，miRNAs还能通过多种分子途径调节细胞对电离辐射的反应，从而影响细胞的放射敏感性或抗辐射性。本研究旨在评估电离辐射对乳腺癌患者放疗后miR-99b-5p表达的影响。

**方法**
研究分为实验组（30名乳腺癌患者）和对照组（13名健康个体）。实验组在放疗前后两个时间点采集静脉血样，对照组仅采集一次样本。分离血清后提取miRNA，并使用特异性引物合成cDNA。随后通过实时PCR技术量化miR-99b-5p的表达水平。

**结果**
实时PCR分析显示，放疗前乳腺癌患者的miR-99b-5p表达水平显著高于对照组（p < 0.0001）。放疗后，miR-99b-5p表达水平下降，但仍比对照组高出14.07倍（p < 0.0001）。这些发现表明miR-99b-5p可能作为乳腺癌的潜在诊断生物标志物。

**结论**
初步研究结果表明，乳腺癌患者的miR-99b-5p表达水平高于健康对照组，并且在放疗后降低。这些结果提示循环中的miR-99b-5p可能成为乳腺癌诊断和放疗反应监测的候选生物标志物。然而，需要更大规模的前瞻性研究来验证这些发现。

**1. 引言**
乳腺癌已成为一个紧迫的全球健康问题，其高发病率和女性死亡率令人担忧（DeSantis等人，2016；Torre等人，2016）。大约每8名女性中就有1人在其一生中会患上这种疾病（Siegel等人，2019）。该癌症表现出显著的病理生理异质性，并根据激素受体表达模式分为不同的分子亚型（ER+、PR+、HER2+和TNBC）。每种亚型具有独特的生物学行为和临床表现（Shaath等人，2021）（见表1–4、图4–1、图1-3、图2-3、图3-3）。

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**图4–1. 箱线图：**每个箱内的水平线代表中位数，箱体代表四分位数范围（IQR），箱须代表排除异常值的范围。

**图1-3. 不同研究组间miR-99b-5p基因表达变化的倍数比较。**

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**图2-3. 放疗前后miR-99b-5p基因表达的降低。**

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**图3-3. 曲线下面积（AUC）为0.87（95% CI：0.81-0.93，p < 0.0001），在最佳临界值下敏感性约为82%，特异性约为80%，表明诊断准确性较高。**

乳腺癌的标准治疗方法包括手术、放疗、化疗和激素治疗（Czajka & Pfeifer，2023）。放疗显著降低了乳腺手术后的局部复发率，但抗辐射性仍是治疗的主要限制因素（Darby等人，2011）。最近的研究发现微小RNA是细胞对放疗反应的关键调节因子。

微小RNA（miRNAs）是短的非编码RNA（约22个核苷酸），通过降解目标mRNA或抑制其翻译为蛋白质来调节基因表达（Bartel，2004），并在包括发育、分化、增殖、凋亡和基因组稳定性维持在内的多种细胞过程中发挥重要调节作用（O’Brien等人，2018）。miRNA表达模式的异常，无论是通过表观遗传修饰、生物合成缺陷、基因突变还是染色体异常，都与癌症发展和治疗抵抗密切相关（Li等人，2009）。miRNAs通过多种机制精确地决定细胞的放射敏感性，包括增强辐射敏感性或促进抗辐射性：调节DNA修复效率、控制细胞周期检查点、调控凋亡途径、重塑肿瘤微环境、改变氧化应激反应（Wang等人，2019；Zhao等人，2013）。放疗通过激活DNA损伤反应途径（由ATM和p53介导）和影响miRNA生物合成酶来改变miRNA表达。这些变化取决于辐射剂量和细胞类型（Park等人，2025）。

在miRNAs中，miR-99b-5p在癌症中具有双重调节作用，根据细胞环境和组织类型的不同，它既可以作为癌基因也可以作为肿瘤抑制因子（Eniafe & Jiang，2021）。在乳腺癌中，miR-99b-5的过度表达通过失调关键通路（如TGF-β信号通路和上皮-间充质转化（EMT）促进肿瘤进展和侵袭性（Oshi等人，2022；Turcatel等人，2012）。Noyan和Gür Dedeo?lu报告称，乳腺癌组织中的miR-99b-5表达显著上调，高表达水平与不良预后相关（Noyan & Gür Dedeo?lu，2025）。最近关于胰腺癌的研究表明，miR-99b-5表达降低可能通过增强mTOR表达来诱导细胞对电离辐射的抗性（Wei等人，2013）。

鉴于miR-99b-5在乳腺癌发病机制中的关键作用及其在放疗反应中的潜在作用，本研究旨在探讨电离辐射对乳腺癌患者放疗后miR-99b-5表达水平的影响。与以往基于组织表达或体外模型的研究不同，这是首次在同一患者放疗前后评估循环中miR-99b-5水平的研究。阐明这一关系可能有助于开发新的策略，以提高治疗反应并克服抗辐射性。

**2. 材料与方法**
2.1. 研究设计和参与者
本研究招募了73名40-60岁的女性参与者，包括60名乳腺癌患者（30名在放疗前进行评估，另外30名在放疗后进行评估）以及13名年龄匹配的健康对照组。纳入标准包括：组织学确诊的乳腺癌、无其他恶性肿瘤、完成标准AC-T化疗方案。

2.2. 放疗方案
所有患者均接受外照射放疗（EBRT）：
- 辐射系统：Varian直线加速器
- 光子束能量：6 MV
- 野布置：切向野
- 标准方案：总剂量50 Gy，分25次照射（每次2 Gy）
- 增强方案：选定的保乳手术病例额外接受5次10 Gy照射（每次2 Gy）
根据QUANTEC（临床正常组织效应定量分析）的耐受剂量对风险器官进行剂量限制。所有患者接受相同的治疗技术，因为每位患者既是自己的对照（放疗前后的比较），个体解剖差异不影响结果。

2.3. 样本采集与处理
从所有参与者（包括乳腺癌患者放疗前和放疗后一个月的随访）以及年龄匹配的健康对照组中采集10 mL外周血样。离心后，血清样本在-80°C下冷冻保存以供后续分析。

2.4. 分子分析
使用RNX-plus溶液从血清样本中提取miRNAs，包括裂解、氯仿介导的相分离、乙醇沉淀和洗涤等步骤。使用NCBI Primer-BLAST和Oligo Analyzer工具设计miR-99b-5p及参考基因RNU6的特异性引物（表1–2），合成后储存在-20°C。cDNA合成使用MMLV逆转录酶和茎环引物，在含有RNA模板、缓冲液和dNTP的反应混合物中进行。热循环条件为：25°C孵育10分钟，42°C孵育60分钟，70°C孵育5分钟，生成的cDNA产品储存在-80°C以供后续分析。

**表1–2. cDNA合成所用引物序列。**
| 基因 | 引物序列（5' → 3'） |
|------|-----------------|
| RNU6 | GTCGTATCCAGTGCTGCGACCGTATGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATGCACTGGATACGACGTGTCATCCTTGC |
| miR-99b | GTCGTATCCAGTGCTGCGACCGTATGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATGCACTGGATACGACCGCAAGR |

**表2–2. 实时PCR反应中使用的特异性引物和通用引物序列。**
| 基因 | 引物序列（5' → 3'） |
|------|-----------------|
| RNU6 | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC |
| miR-99b | ATAGCACCCGTAGAACCGAC |
| Reverse-Universal | GTATCCAGTGCTGCGACCGT |
| Probe-Universal | FAM TGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCAT BHQ-1 |

**表3–2. 实时PCR反应的温度条件和循环次数。**
| 循环 | 温度 | 时间 |
|------|------------|------|
| 1 | 95°C | 15分钟 | 酶激活 |
| 2 | 95°C | 30秒 | 变性 |
| 3 | 60°C | 1分钟 | 延伸 |

**表1–4. 乳腺癌患者的临床病理特征（n = 30）。**
| 特征 | 患者数量 | 百分比（%） |
|------|-----------|--------|
| 肿瘤分期 | I期 | 8 | 26 |
| II期 | 9 | 30 |
| III期 | 13 | 44 |
| 分子亚型 | 激素受体阳性（ER+和/或PR+） | 23 | 77 |
| HER2阳性 | 5 | 17 |
| 三阴性 | 2 | 6 |

**表2–4. 乳腺癌患者中miR-99b-5的相对表达。**
| 组别 | 倍数变化（平均值±标准差） | 95%置信区间 | P值 |
|------|-----------------|-----------------|---|
| 对照组 | 13 | 1.00 ± 0.00 | -- |
| 放疗前 | 30 | 43.00 ± 12.00 | 32.64 - 56.64 | <0.0001 |
| 放疗后 | 30 | 14.07 ± 3.86 | 10.73 - 18.45 | <0.0001 |

使用NanoDrop评估RNA纯度，所有实时PCR反应均重复三次以确保技术可重复性。

**2.5. 统计分析**
相对miR-99b-5表达使用2^(-ΔΔCt)方法计算。统计分析采用配对t检验（SPSS v26），所有qPCR结果均通过三次技术重复验证。

**3. 结果**
本研究比较了30名乳腺癌患者（平均年龄49.73 ± 6.64岁）和13名年龄匹配的健康对照组（48.92 ± 4.57岁）。患者评估在放疗前和治疗后一个月进行。如方法部分所述，所有研究组的样本均用于实时PCR分析。miR-99b-5的表达水平（标准化至RNU6）通过RT-qPCR技术在标准化循环条件下进行量化。

**3.1. 激素治疗和靶向治疗**
重要的是，所有患者在放疗后均开始激素治疗和靶向治疗。因此，这些治疗并未影响放疗后一个月测量的miR-99b-5表达水平。
比较分析显示：放疗前患者的miR-99b-5水平显著高于对照组（p < 0.0001）。放疗后，miR-99b-5表达显著降低（p < 0.01），但仍高于健康对照组（p < 0.0001）。这些发现表明miR-99b-5可能作为乳腺癌的潜在双重用途生物标志物：用于诊断和监测放疗反应。

**3.1.1. 患者与对照组比较**
我们的分析显示，乳腺癌患者的miR-99b-5表达显著上调。与健康对照组相比，放疗前患者的miR-99b-5表达高出43.00倍（范围32.64至56.64，p < 0.001）。尽管放疗后表达水平下降，但仍比对照组高出14.07倍（范围10.73至18.45，p < 0.05）。这些发现强调了miR-99b-5作为乳腺癌诊断生物标志物的潜力。

**3.1.2. 放疗对miR-99b表达的影响**
- 73.3%的患者在放疗后miR-99b-5表达下调
- 下调程度在不同患者间存在差异，表明：
- 治疗反应的异质性
- 患者间可能存在不同的分子亚型
- 这些动态变化表明miR-99b-5可能预测治疗反应。

**4. 讨论与结论**
本研究探讨了微小RNA（特别是miR-99b-5）在乳腺癌发病机制中的关键作用。作为全球最常见的恶性肿瘤之一（Alkabban & Ferguson，2022），乳腺癌的治疗策略因疾病阶段、组织病理特征和分子谱型而异，采用多模式方法，包括手术、化疗、放疗和内分泌治疗（Gradishar等人，2022）。在过去二十年里，miRNAs作为关键的基因表达调节因子，其在乳腺癌的起始和进展、疾病预后和预测以及治疗反应调节中的作用日益受到重视（Grillone等人，2020）。由于miRNAs能够靶向癌基因或肿瘤抑制基因，它们既可以作为肿瘤促进因子也可以作为抑制因子。它们的组织和疾病特异性表达模式使其成为癌症诊断和监测的理想候选生物标志物（Sharma & Gupta，2020）。此外，miRNAs还赋予肿瘤关键特征，包括抗放疗和化疗的抵抗力、癌症干细胞的维持以及增强的血管生成潜力（Soheilifar等人，2022）。

本研究使用qRT-PCR评估了乳腺癌患者放疗前后的miR-99b-5表达与健康对照组的情况。我们观察到放疗前患者的miR-99b水平显著高于对照组，表明其潜在的致癌作用和作为诊断生物标志物的效用。放疗后，miR-99b-5表达显著降低，这与临床改善和肿瘤消退相关，表明治疗有效性和miR-99b-5对辐射的反应性。放疗后循环中miR-99b-5水平的降低可能由多种生物学机制解释。Noyan和Gür Dedeo?lu发现miR-99b-5调节ESR1表达和ER/HER2相互作用，从而促进治疗抵抗（Noyan & Gür Dedeo?lu，2025）。放疗诱导的miR-99b-5下调可能通过破坏这种抵抗机制来提高治疗效果。此外，miR-99b-5靶向AKT/mTOR信号通路，这是细胞存活和DNA损伤反应的关键调节因子。Wei等人表明，miR-99b-5表达降低可增强mTOR表达，影响胰腺癌的放射敏感性（Wei等人，2013），这一机制可能在乳腺癌中也存在。miR-99b-5还参与TGF-β信号通路和上皮-间充质转化（EMT）（Turcatel等人，2012），这些过程与抗辐射性相关。治疗后miR-99b-5p水平显著降低，这表明放疗可能通过调节这些通路来提高治疗效果。值得注意的是，虽然治疗后其水平相比治疗前大幅下降，但仍然高于健康对照组，这突显了即使在治疗后这些分子改变仍然存在，因此需要持续监测。这项研究强调了miR-99b-5p在乳腺癌个性化放疗中的潜力。由于不同患者的放疗反应存在显著差异，监测miR-99b-5p的表达（其与肿瘤行为密切相关：增殖/侵袭时水平升高，治疗反应时水平降低）可以帮助优化临床决策。我们的发现支持在术前预后评估和放疗后监测中使用miR-99b-5p定量分析，从而实现从诊断到治疗评估的精准医疗方法。我们的结果与之前关于miR-99b-5p在癌症中的研究一致。Torrisi等人发现miR-99b-5p属于与转移性乳腺癌不良预后相关的miRNA谱系，并且与无进展生存期呈显著负相关（Torrisi等人，2024年），这支持了我们观察到的miR-99b-5p水平升高与肿瘤侵袭性行为相关的结论。在放疗反应方面，Wang等人研究了miR-99b-5p家族在癌症中的作用，指出它参与了细胞增殖、凋亡和治疗抵抗（Wang等人，2025年）。此外，Campayo等人证明miR-99b-5p与miR-21和miR-375结合可以预测直肠癌患者对术前化疗放疗的反应（Khalil & Feltovich，2018年），表明miR-99b-5p在多种癌症类型中的放疗反应中具有普遍作用。关于对放疗有反应的miRNA，我们选择一个月后的采样时间点得到了Marczyk等人的支持，他们发现了乳腺癌患者在接受放疗一个月后的miRNA变化（Cha?ubińska-Fendler等人，2023年），以及Kopcalic等人发现放疗后一个月内癌症患者的miRNA发生显著变化（Kopcalic等人，2019年）。据我们所知，这是首次专门评估接受放疗的乳腺癌患者体内循环miR-99b-5p纵向变化的研究。

使用RNU6作为血清样本中的唯一参考基因可能存在一定的局限性。然而，Rice等人评估了10个候选参考基因，在血浆样本中确定RNU6是两个最稳定的内源性对照基因之一（另一个是miR-520d-5p），适用于循环miRNA的标准化，证明了其适用于生物流体分析（Rice等人，2015年）。尽管如此，相对较小的样本量限制了我们的研究结果的普遍性，未来需要更大规模的研究来验证这些发现。我们的初步结果显示，乳腺癌患者的miR-99b-5p表达水平高于健康对照组，并且在放疗后下降。这些结果表明，循环miR-99b-5p可能是一个有潜力的生物标志物，可用于乳腺癌的诊断和放疗反应监测。然而，需要更大规模的前瞻性研究来验证这些发现。

4.1 研究局限性
本研究存在几个局限性。首先，由于经济不稳定和货币波动导致研究成本大幅增加，限制了我们的样本量和进行额外实验室测试的能力。其次，较短的随访时间（放疗后一个月）无法评估长期临床结果，包括无病生存期和总生存期。第三，由于缺乏生存分析，我们无法确定miR-99b-5p水平与患者预后之间的直接关联。

对于未来的研究，我们建议：
(1) 进行更大规模的研究，采用更完善的实验方案以验证现有发现。
(2) 研究细胞miRNA提取方法，以提高检测准确性。
(3) 探讨放疗诱导的miR-99b-5p调节机制如何影响乳腺肿瘤细胞的放射敏感性。
(4) 研究miR-99b-5p与其他非编码RNA（特别是LncRNA）在乳腺癌发病机制中的相互作用。

作者贡献声明：
Somaye Davoudi：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、资金获取、概念构思。
Ali Shabestani Monfared：监督、资源提供。
Hale Akhavan niyaki：数据可视化、结果验证。
Daniyal Fazilatpanah：项目管理。
Kourosh Ebrahim Nezhad：撰写、审稿与编辑、数据可视化、监督。
Sadegh Fatahi：数据分析、数据整理。
Ali Bizhani：数据分析。
Bahar Zargari：撰写、审稿与编辑。

伦理考虑
该研究方案已获得机构审查委员会的伦理批准（IR.MUBABOL.REC.1401.194）。所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书。