多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶6（GALNT6）可抑制焦亡反应，并促进结直肠癌细胞的免疫逃逸

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Polypeptide N-Acetylgalactosaminyltransferase 6 (GALNT6) inhibits pyroptosis and promotes immune escape of colorectal cancer cells

　　秦武廖|陈圆圆|翁慧斌|林晓华|陈大俊
温州医科大学衢州附属医院胃肠病学系，衢州市人民医院，浙江衢州324000

**摘要**
**目的**
多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶6（GALNT6）与恶性肿瘤的发展有关。需要确定GALNT6在结直肠癌（CRC）中的表达情况；其在促进肿瘤增殖和迁移、调节细胞焦亡以及CRC细胞免疫逃逸中的作用仍不清楚，我们将探讨这些问题。

**方法**
首先确定了CRC中GALNT6的表达模式，然后构建了过表达和敲低GALNT6的细胞系。接着测量了这些细胞的增殖和侵袭能力。利用Elisa、Western blot（WB）和免疫荧光技术检测与细胞焦亡相关的指标和免疫状态。通过流式细胞术检测CD8+T细胞的凋亡情况。最后，通过体内模型研究GALNT6的生物学功能。

**结果**
GALNT6在CRC样本和细胞系中的表达水平升高。GALNT6的上调可能促进CRC的发展，而下调可能抑制其发展。研究发现GALNT6抑制CRC细胞的焦亡过程。GALNT6上调显著增加了PD-L1的表达，并抑制了CD8+T细胞的效应功能及细胞因子的产生。体内实验数据表明，GALNT6过表达会促进肿瘤形成，抑制增殖，并与CD8+T细胞减少相关；而在动物模型中敲低GALNT6表达后，抗肿瘤免疫增强。

**结论**
GALNT6可增强CRC细胞的增殖和侵袭能力，抑制细胞焦亡，促进免疫逃逸等，在致癌过程中起重要作用；因此，GALNT6是一个值得进一步研究的潜在治疗靶点。

**1. 引言**
全球结直肠癌（CRC）的负担仍然很重，近年来发病率持续上升，已成为全球第四大致命癌症，严重威胁人类生命和健康（Dekker等，2019）。根据权威统计数据，在发达国家，随着人口老龄化加剧，CRC的发病率在恶性肿瘤中名列前茅（Klimeck等，2023）。尽管目前CRC的治疗方法多种多样，但患者的治疗效果仍不尽如人意（Connell等，2017）。患者的术后复发和转移率很高，免疫逃逸可能在此过程中起关键作用（Fan等，2021）。免疫逃逸使肿瘤细胞能够逃避免疫系统的严密监测和有效杀伤，最终导致肿瘤持续进展和治疗失败。因此，识别驱动CRC发展的基本生物学和结构过程对改善患者的生活质量和延长寿命具有重要意义（Underwood等，2024）。

多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶6（GALNT6）作为GALNT家族的成员，是一种特定的N-乙酰半乳糖胺转移酶。该酶对蛋白质O-糖基化途径至关重要，可将N-乙酰半乳糖胺添加到丝氨酸或苏氨酸位点形成O-连接糖基化。研究发现GALNT6在恶性组织中异常表达，并与癌症转移密切相关（Kong等，2023）。GALNT6在乳腺浸润性导管癌中过表达，可能促进肿瘤生长和发展（Al Zein等，2023；Deng等，2018）。GALNT6诱导的异常O-糖基化会促进膀胱癌的进展和免疫逃逸，表明GALNT6可能成为膀胱癌的免疫治疗靶点（Peng等，2024）。GALNT6过表达可促进癌细胞增殖，而低表达则使这些细胞对药物更敏感；因此，提高了药物疗效（Peng等，2021）。GALNT6在CRC中的具体机制尚待阐明（Peng等，2021）。

细胞焦亡是一种由gasdermin蛋白家族成员介导的特异性溶细胞和炎症性细胞死亡方式。NLRP3/ASC通路驱动细胞焦亡，在肿瘤免疫学中起关键作用（Xu等，2022）。这种细胞死亡方式有助于分泌肿瘤相关抗原和危险分子，从而激活先天性和适应性免疫反应，增强抗癌免疫监视（Hu等，2023）。此外，细胞焦亡还能触发恶性细胞的凋亡，抑制肿瘤生长和转移扩散（Fang等，2024）。越来越多的数据表明，与细胞焦亡相关的因子表达模式与CRC的临床特征高度相关。通过触发细胞焦亡，可能提高CRC对化疗和免疫治疗的反应性（Wang等，2024）。刺激细胞焦亡是治疗CRC的一种有前景的新策略（Huang等，2023）。然而，GALNT6是否抑制细胞焦亡并诱导CRC中的免疫逃逸的具体机制尚不清楚（Wang等，2024）。我们研究了GALNT6在CRC中的作用，这可能为CRC的管理提供新的治疗靶点和思路。

**2. 材料与方法**
2.1. 生物信息学分析
从癌症基因组图谱（TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov）获取了泛癌临床数据（Tomczak等，2015）。使用TIMER 2.0工具（http://timer.cistrome.org/）测量了多种恶性肿瘤中GALNT6 mRNA的表达情况（Li等，2020）。此外，还使用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）平台评估了CRC标本与相应健康对照组中的GALNT6表达（Chandrashekar等，2022）。
2.2. 细胞培养
人原代上皮细胞系（FHC、BNCC339288、Bena，江苏）和结直肠癌（CRC）细胞模型（包括Caco-2（CL-0050）、SW480（CL-0223）、Lovo（CL-0144）、HCT116（CL-0096）以及小鼠CRC细胞MC38（CL-0972）由Pricella（武汉，中国）提供。外周血单核细胞来自一家提供捐赠者伦理同意书的供应商，我们的机构伦理委员会批准将其用于本研究。使用含有10%胎牛血清（FBS，PM150110B，Pricella）的RPMI-1640培养基培养细胞。在37°C和5%二氧化碳的培养箱中培养细胞。通过STR分析确定基因型特征，并通过支原体检测确认细胞未被支原体污染。
2.3. 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
按照Trizol试剂（15596018CN，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德）的操作说明分离总RNA。获取RNA后，使用逆转录试剂（RR037A；Takara，北京）进行逆转录反应合成cDNA链。通过2?ΔΔCt方法，使用β-actin作为对照进行qRT-PCR扩增cDNA样本。
2.4. Western blot（WB）
使用P0013B试剂盒（Beyotime，上海，中国）提取蛋白质，并进行SDS-PAGE电泳。每孔加入10 μl蛋白质样品和2.5 μl标记物，凝胶在80 V恒压下浓缩30分钟，然后在120 V恒压下将分离凝胶距离底部提升至1 cm。PVDF膜用甲醇活化30秒后放入预冷的电转移溶液中。在冰浴中以300 mA恒电流进行电转移2小时。电转移后，膜与GALNT6抗体（1:1000，ab151329，Abcam，美国）、Caspase-1抗体（1:1000，ab241237，Abcam，美国）、Caspase-4抗体（1:1000，MABF265，Sigma-Aldrich，美国）和GSDMD-N抗体（1:1000，ab215203，Abcam，美国）共孵育过夜（4°C），随后与二次抗体（1:2000，ab97051和ab6728，Abcam，美国）孵育1小时，再次洗涤。最后使用ECL显影剂和荧光图像分析仪（5200，Tanon，上海，中国）进行显色观察。
2.5. GALNT6的过表达和敲低
从DDX CELL（上海，中国）获取含有GALNT6过表达质粒或短发夹RNA（shRNA）的重组慢病毒，用于稳定基因表达或敲低。根据制造商的方案将慢病毒感染目标细胞。感染48小时后，使用2 μg/mL嘌呤霉素筛选成功感染的细胞。随后进行qRT-PCR和WB分析，确认GALNT6基因表达的有效过表达或沉默。
2.6. Cell Counting Kit-8（CCK-8）
向细胞中加入10 μL CCK-8试剂（CK04，Dojindo，熊本，日本），孵育2小时后，在96孔板中分别孵育24、48和72小时。使用微孔板读数仪（Varioskan Lux，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）测量每个样本的光密度。
2.7. 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）检测
通过EdU增殖检测细胞增殖能力（C0071S-1，Beyotime，上海，中国）。将细胞暴露于EdU 2小时后，用DAPI染色。然后使用荧光显微镜（APX100，Olympus，东京，日本）识别EdU阳性细胞。
2.8. 细胞克隆形成实验
将细胞接种到6孔板中。当对照组细胞生长到可见质量时，停止培养，弃去培养基，用PBS轻轻冲洗，加入甲醛和结晶紫溶液。用PBS洗去多余染料后进行后续拍照操作。
2.9. Transwell
在Transwell上室底部铺上50 μl稀释的Matrigel（注意不要产生气泡），然后放入培养箱过夜。第二天取出培养箱，小心吸出下室未固化的液体（注意不要触碰底部胶水）。下室填充完整培养基，上室加入重悬的细胞。培养48小时后，弃去培养基，固定细胞，进行染色，并拍摄三个随机视野的照片。
2.10. 免疫荧光（IF）检测
细胞用多甲基醛固定，并用0.2% Trition-X100试剂渗透10分钟，然后用5% BSA封闭30分钟。接着与ASC抗体（1:250，GTX55818，GeneTex，美国）或PD-L1抗体（1:200，GTX635975，GeneTex，美国）孵育12小时，加入荧光标记的二次抗体（1:200，A23220，Abbkine，美国）孵育1小时。孵育后用Hoechst 33342（C1029，Beyotime，上海，中国）染色30分钟。
2.11. HCT116细胞与T细胞的共培养系统建立
使用CD8+T细胞富集试剂（19053，STEMCELL，加拿大）从PBMC中分离CD8+T细胞，并在RPMI-1640培养基中培养。稳定转染的HCT116细胞通过Transwell膜与CD8+T细胞间接共培养。
2.12. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
共培养48小时后，收集培养基并离心获得上清液。使用ELISA试剂盒（R&D Systems，明尼阿波利斯，MN，美国）测定LDH（NBP3-24510）、IFN-γ（QK285）、TNF-α（MTA00B）、IL-1β（DY-201）和IL-18（SPCKB-PS-000502）的浓度。
2.13. 流式细胞术
使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（AP101C，MultiSciences，杭州，中国）检测程序性细胞死亡。按照产品说明，将一定量的样本置于黑暗环境中约30分钟。随后进行流式细胞术分析（BD，新泽西州，美国）。
2.14. 小鼠肿瘤模型的建立
体内异种移植模型的建立遵循既定方案。简要来说，从Vital River（北京，中国）获取C57BL/6小鼠（4-5周龄），适应7天（Haoyue等，2025）。每只小鼠接种MC38细胞，每天监测肿瘤生长。肿瘤形成后，在14天处死前记录肿瘤的大小和质量。
2.15. 免疫组化染色（IHC）
石蜡切片依次在新鲜二甲苯和梯度乙醇中脱蜡。为了抗原恢复，将切片放入预热的1x柠檬酸钠抗原修复溶液（pH 6.0）中，在微波炉中加热4分钟，然后在室温下冷却20分钟。切片放入含有适量过氧化物酶阻断剂的湿盒中10分钟，再用PBS洗涤。接着加入CD8（RMA-0514，MXB Biotechnologies，福州，中国）或PD-L1（66248-1，Proteintech，武汉，中国），放置过夜。次日去除后，逐滴加入二次抗体（ab205718，Abcam，美国），孵育30分钟，再用PBS洗涤三次。滴加DAB染色液反应15分钟，然后依次用hematoxylin和乙醇盐酸染色，脱水，用二甲苯透明处理，用中性橡胶封片。数据分析所有数据均以Graph Pad Prism 9.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥）的形式呈现。每组数据表示为平均值±标准差。两组独立样本使用非配对t检验进行比较，随后通过Tukey的事后检验进行多组比较。统计显著性标准设定为P<0.05。

3.1. CRC中GALNT6表达上调
为了检测CRC中GALNT6的表达，我们首先通过在线TIMER数据库分析了TCGA数据库中34种癌症的GALNT6表达差异。结果显示，在34种常见人类癌症中GALNT6的表达水平存在不一致性，其中14种癌症的表达存在显著差异，包括CRC [图1a]。此外，还通过UALCAN在线数据库分析了TCGA CRC数据库中41个正常样本和286个CRC患者肿瘤样本的GALNT6表达情况。结果同样显示GALNT6在CRC中过表达 [图1b]。在不同细胞系中也检测了GALNT6的表达水平。结果显示，CRC细胞系的GALNT6水平显著升高，其中HCT116细胞中的表达最高 [图1c–e]。因此，后续研究选择了HCT116细胞。

3.2. GALNT6过表达促进了CRC细胞的增殖和侵袭
为了研究GALNT6对CRC细胞的影响，我们生成了GALNT6过表达或敲低的安全细胞系。研究发现，OE-GALNT6组的GALNT6水平高于对照组和OE-NC组，而sh-GALNT6-2（5′-GCACTGTGTCAATGCCTTT-3′）组的GALNT6表达最低，因此被选为后续研究的对象 [图2]。CCK-8检测显示GALNT6过表达显著提高了CRC细胞的存活率，而GALNT6敲低则有效抑制了细胞活力 [图3a和b]。EdU检测表明GALNT6过表达增强了DNA复制能力并加速了细胞增殖速度。相反，GALNT6敲低减少了DNA合成并减缓了细胞增殖速度 [图3c和d]。菌落形成实验表明，GALNT6过表达的CRC细胞产生的菌落数量和大小显著增加，表明其增殖能力显著增强。然而，在GALNT6沉默后，CRC细胞的菌落数量显著减少，菌落大小缩小，增殖潜力受到抑制 [图3e和f]。这些发现通过CCK-8和EdU检测得到验证，并进一步明确了GALNT6的功能。Transwell侵袭实验表明，GALNT6的异位表达促进了细胞侵袭；相反，沉默GALNT6则抑制了这种能力 [图3g和h]。

3.3. GALNT6过表达抑制了CRC细胞的焦亡
为了评估GALNT6对CRC细胞焦亡的影响，我们检测了与焦亡相关的指标。GALNT6过表达显著降低了所有细胞组中的IL-1β和IL-18水平，而其敲低则提高了这些细胞因子的水平 [图4a和b]。WB结果显示，OE-GALNT6组细胞中的caspase-4、GSDMD-N和caspase-1显著减少。相反，当GALNT6被敲低时，与焦亡相关的蛋白质显著增加 [图4c和d]。ASC的检测验证了GALNT6对炎性小体的影响。结果显示，GALNT6敲低显著提高了ASC表达，而其过表达则显著降低了ASC表达 [图4e和f]。LDH测试结果表明，当GALNT6基因过表达时，LDH的释放会减少；而当该基因被敲除时，LDH的释放会增加 [图4g]。

3.4. GALNT6促进了CRC细胞的免疫逃逸
为了确定GALNT6是否有助于CRC细胞逃避免疫细胞，我们通过免疫荧光检测了PD-L1的水平。研究发现，GALNT6过表达增强了PD-L1的表达，而GALNT6沉默则抑制了PD-L1的水平 [图5a和b]。基于细胞毒性测试的数据，GALNT6过表达的样本中IFN-γ和TNF-α的浓度降低。GALNT6敲低后，这些促炎分子的量显著增加 [图5d和e]。流式细胞术数据显示，GALNT6过表达诱导了CD8+ T细胞的凋亡，而GALNT6沉默则减少了这种促凋亡效应 [图5f和g]。

4. 讨论
在本研究中，我们试图阐明GALNT6在CRC中的生物学功能。通过分析TCGA数据库，我们发现CRC组织中的GALNT6含量显著升高，表明GALNT6在CRC中起着重要作用。进一步实验表明，GALNT6过表达促进了CRC细胞的恶性活动。这与现有文献关于GALNT6在多种癌症中的促肿瘤作用一致，例如，GALNT6通过糖基化促进骨肉瘤的生长、迁移和侵袭（Tong等人，2025年）。GALNT6通过增加α2M的黏糖基化促进乳腺癌转移（Liu等人，2020年）。因此，GALNT6可能通过介导异常糖基化促进结直肠癌的发展。在分析焦亡现象时，GALNT6过表达抑制了焦亡途径，而GALNT6敲低则促进了焦亡。这一发现通过形态观察和蛋白质表达分析得到证实，表明GALNT6调节了焦亡过程。在胰腺导管腺癌细胞中，GALNT6还通过NF-κB/NLRP3途径调节焦亡。GALNT6可以通过O-糖基化修饰抑制NF-κB的核转位，从而转录下调NLRP3和GSDMD。它还可以直接糖基化GSDME以促进其降解，从而双重阻断细胞中的焦亡途径（Ding等人，2023年）。这些结果为揭示肿瘤细胞如何通过GALNT6逃避焦亡提供了新的线索，这可能与炎性小体的激活和焦亡蛋白的糖基化有关。此外，我们的研究表明，GALNT6过表达显著增强了CRC细胞中的PD-L1表达，并抑制了T淋巴细胞介导的细胞毒性反应，表明GALNT6通过上调免疫检查点分子促进癌细胞逃避免疫监视（Jiang等人，2019年）。与GALNT6过表达的CRC细胞共培养时，T淋巴细胞杀伤靶细胞的能力减弱，炎症因子的分泌显著减少，表明GALNT6可能通过分泌抑制性微环境促进CRC的免疫逃逸。其他研究也报告了这种免疫抑制现象，发现肿瘤组织中的异常糖基化与肿瘤微环境中的免疫抑制因子密切相关（Wang等人，2024年）。这可能是由于GALNT6在CRC细胞中引起了异常糖基化。CD8+ T细胞的凋亡谱进一步支持了这一点，GALNT6过表达增加了凋亡，而GALNT6敲低减少了细胞死亡并增强了免疫反应。Sun等人发现，GALNT6表达显著抑制了CD8+ T细胞的存活和抗肿瘤活性（Sun等人，2024年）。GALNT6表达与皮肤鳞状细胞癌中CD8+ T细胞的浸润程度呈负相关，表明GALNT6在肿瘤微环境中起着重要作用（Shao等人，2024年）。在小鼠模型中，我们的结果显示GALNT6过表达促进了肿瘤生长，而GALNT6敲低抑制了肿瘤增殖。这与细胞实验和其他肿瘤研究的结果一致。GALNT6加速了体内和体外透明细胞肾癌的生长和迁移（Sun等人，2024年）。GALNT6沉默还减少了肺腺癌的转移并延长了小鼠的生存期（Song等人，2020年）。这些结果为GALNT6在CRC发展中的致癌作用提供了体内实验证据。同时，肿瘤组织中焦亡相关蛋白的变化表明GALNT6在调节焦亡和免疫微环境中的重要作用（Shen等人，2024年）。我们的发现显示GALNT6显著上调，它抑制了焦亡并上调PD-L1表达，抑制了免疫细胞功能，最终促进了CRC的免疫逃逸。GALNT6可能是CRC免疫治疗的一个有前景的目标。

5. 结论
研究发现，GALNT6在CRC中显著上调，促进了细胞增殖、侵袭和免疫逃逸。通过抑制焦亡和增强PD-L1表达，它影响了CD8+ T细胞的功能，突显了其作为重要治疗目标的潜力。

致谢
作者贡献声明：
廖秦武：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、方法学、数据管理。
陈园园：资源获取、调查、正式分析。
翁慧斌：监督、软件使用、项目管理。
林晓华：验证、方法学、概念构建。
陈大军：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、数据管理、概念构建。

伦理批准
本研究已获得衢州市人民医院伦理委员会的批准（批准编号：ZFY20251348）。

资金
作者声明本文所述工作未涉及任何资金支持。