推进环境DNA技术，用于监测湖泊中斑马贻贝和斑马纹贻贝的繁殖情况

《Aquaculture, Fish and Fisheries》：Advancing Environmental DNA Methods for Monitoring the Reproduction of Quagga and Zebra Mussels in Lakes

　　摘要

入侵性外来贻贝通过破坏食物网和营养循环，对全球的淡水生态系统构成威胁。因此，有效监测这些种群对于评估其扩散和生态影响至关重要。本研究展示了环境DNA（eDNA）方法在监测两种此类物种——Dreissena polymorpha（斑马贻贝）和Dreissena rostriformis bugensis（夸格贻贝）的繁殖期方面的适用性。这两种物种的幼体（面盘幼虫）在形态上难以区分，难以准确监测。我们开发了新的引物和探针，用于多重滴式数字PCR（ddPCR），从而能够区分这两种物种。我们在四个阿尔卑斯山周边的深湖中比较了三种eDNA采样方法——综合水样（0至50米深度）、次表层水样和浮游生物批量样本——与传统的面盘幼虫显微镜计数方法。所有eDNA方法的结果都与面盘幼虫计数呈正相关。综合水样和浮游生物批量样本在量化面盘幼虫和识别繁殖期方面比次表层水样更有效。浮游生物批量采样方法在定性检测方面表现优异，仅在存在幼虫时显示出正的eDNA信号，并且是唯一在日内瓦湖检测到斑马贻贝的方法。然而，该方法在一个湖泊中高估了冬季的繁殖情况。综合水样方法在定量反映幼虫动态方面表现良好，但有时会出现假阳性结果（尽管未观察到幼虫仍检测到eDNA）。这些方法揭示了这两种物种在不同湖泊中的繁殖动态。在阿尔卑斯山周边湖泊中，夸格贻贝全年都能繁殖，并且是优势物种，而斑马贻贝主要在温暖季节繁殖。值得注意的是，该研究首次提供了夸格贻贝存在于安纳西湖和艾格贝莱特湖的证据。尽管我们建议进一步改进本研究中评估的eDNA方法，但这些方法已经可以用于更好地了解这些入侵物种在湖泊中的生态情况。

1 引言

入侵性淡水贻贝是全球最具破坏性的水生入侵者之一。Dreissena polymorpha（斑马贻贝）和Dreissena rostriformis bugensis（夸格贻贝）是来自里海-黑海地区的两种入侵性外来物种（IAS），它们通过快速扩张、高繁殖率、大量过滤消耗浮游植物、生物污染基础设施以及干扰营养循环来威胁湖泊生物多样性和生态系统功能（参见Nalepa和Schloesser 1992；Karatayev等人2002, 2015年的综述）。斑马贻贝于19世纪入侵西欧，20世纪60年代入侵阿尔卑斯山/阿尔卑斯山周边湖泊（Pollux等人2010），而夸格贻贝则是在21世纪中叶之后入侵的（Bij de Vaate等人2013），大约在2015年到达阿尔卑斯山周边湖泊（例如日内瓦湖；Haltiner等人2022）。斑马贻贝建立种群峰值的速度更快（2.5±0.2年），而夸格贻贝则需要12.2±1.5年（Karatayev等人2011）。然而，在深湖中，由于夸格贻贝在生长和繁殖方面的能量效率更高，它们通常在共存9年或更长时间后取代斑马贻贝（Karatayev等人2015；Nalepa等人2010；Mills等人1999）。为了全面了解夸格贻贝和斑马贻贝在湖泊中的殖民过程，对其繁殖动态的详细分析是必要的，包括繁殖周期和幼体扩散。全球范围内对斑马贻贝的繁殖特征研究比夸格贻贝更多（Karatayev和Burlakova 2025）。Dreissenid贻贝通过有性繁殖，每只雌性每个繁殖期可释放超过30,000个卵（Stanczykowska 1977）和每年超过100万个卵母细胞（Walz 1978；Borcherding 1991）。受精卵迅速发育成面盘幼虫（2-9天）（Ackerman等人1994），并在水流中漂浮5天到5周（Pollux等人2010的综述）。Dreissenid面盘幼虫通常集中在水体的上层（Bially和MacIsaac 2000；Sprung 1993；Wacker和Von Elert 2003），但增加的混合或下沉作用可以将它们输送到更深的水层（Wacker和Von Elert 2003），或者导致更均匀的垂直分布（Barnard等人2003）。斑马贻贝通常在春季和秋季有两个年度繁殖高峰（Claudi和Mackie 1993），而夸格贻贝可以在一年中的较早时间、更深的水域繁殖，并且在最佳条件下可能全年繁殖（Claxton和Mackie 1998；Karatayev等人2015；Mills等人1996；Nalepa等人2010；Ram等人2011；Roe和MacIsaac 1997）。尽管在基因上有所不同（Stepien等人1999, 2002；Gelembiuk等人2006），但从形态上很难区分夸格贻贝和斑马贻贝（例如，Grigorovich等人2008）。基于DNA的方法，包括环境DNA（eDNA）分析，因此可以准确识别这些物种（例如，Baldwin等人1996；Claxton等人1997；Stepien等人1999）。eDNA方法彻底改变了生物多样性监测，特别是在水生生态系统中，并已被广泛用于检测各种入侵物种，包括甲壳类动物（Geerts等人2018）、鱼类（例如，Adrian-Kalchhauser和Burkhardt-Holm 2016；Takahara等人2013）、两栖动物（例如，Everts等人2022；Lin等人2019）以及如Dreissenid贻贝这样的软体动物。许多研究利用水样中的eDNA有效检测了夸格贻贝和斑马贻贝（例如，Pe?arrubia等人2016；Amberg和Merkes 2016），使得能够早期发现入侵前沿（Gingera等人2017）并检测低丰度种群（例如，Blackman等人2020；de Ventura等人2017）。de Ventura等人（2017）证明了视觉观察与qPCR信号质量之间的强相关性，用于估计莱茵河流域的实地密度。由于这两种物种的幼体阶段在形态上无法区分（Grigorovich等人2008），eDNA方法对于描述它们共存环境中的繁殖情况尤为重要（这在被殖民的湖泊中很常见）。在这里，我们研究了eDNA方法在监测湖泊中斑马贻贝和夸格贻贝繁殖期的有效性，据我们所知，这之前尚未使用eDNA方法进行过研究。采样是实施eDNA分析的关键步骤，对于每个新的应用来说，确保采样设计能够最大化检测目标物种DNA的可能性是至关重要的（例如，Ruppert等人2019；Wilcox等人2018）。eDNA研究主要集中在从水中收集和分离DNA以检测大型生物的eDNA（例如，Diaz-Fergusson等人2014；Ficetola等人2008；Foote等人2012）。然而，批量采样方法，特别是可以收集大量生物材料的方法，可能更适合检测某些分类单元（例如，Choi等人2024；Doloiras等人2023；Suter等人2020），包括根据Miller等人（2024）的结论，也可以用于检测斑马贻贝。因此，我们比较了三种eDNA采样策略，以评估它们在检测面盘幼虫存在和丰度方面的有效性，从而推断湖泊中Dreissenid贻贝的繁殖活动。eDNA采样策略包括综合水样（0-50米深度，这是传统生物监测中收集面盘幼虫的地方）、次表层水样，以及一种简单且常用的监测大型生物多样性的方法（例如，Peixoto等人2023；Spear等人2021），尽管存在争议，更深层的样本可能与表层样本相比产生不同的生物多样性结果（例如，Turner等人2015；Sahu等人2025），以及使用浮游生物网收集的浮游生物批量样本（0-50米深度），这些样本对应于用于显微镜计数的面盘幼虫采样协议。滴式数字PCR（ddPCR）是一种强大的技术，用于检测和量化稀有DNA目标（例如，Brys等人2020；Doi等人2015；Wood等人2019）。尽管eDNA方法已被用于研究Dreissenid贻贝（例如，Amberg和Merkes 2016；Pe?arrubia等人2016），但ddPCR之前尚未用于此目的。因此，我们假设结合ddPCR敏感性的eDNA方法可以用来描述湖泊中夸格贻贝和斑马贻贝的繁殖动态，正如某些鱼类物种所展示的那样（Vautier等人2023）。这三种eDNA方法在四个阿尔卑斯山周边湖泊中进行了测试：日内瓦湖和布尔盖湖（长期被斑马贻贝殖民，最近被夸格贻贝殖民）以及艾格贝莱特湖和安纳西湖（根据当前知识，仅被斑马贻贝殖民）。

2 材料与方法

2.1 采样地点

采样在北阿尔卑斯山的四个深湖中进行——日内瓦湖（莱曼湖）、布尔盖湖、安纳西湖和艾格贝莱特湖——从2022年8月到2023年7月，共1年时间（布尔盖湖和安纳西湖12个采样日期；日内瓦湖11个，艾格贝莱特湖6个，详见下文）。这些湖泊虽然地理位置相近，但在生态特征和斑马贻贝（D. polymorpha）及夸格贻贝（D. r. bugensis）的殖民历史方面存在差异。斑马贻贝至少从19世纪就存在于这些湖泊中（Beisel和Lévêque 2010），而夸格贻贝的入侵时间较晚。值得注意的是，夸格贻贝首次在2015年在日内瓦湖被观察到（估计引入时间约为2013年），并自此成为优势贻贝物种（Lods-Crozet和Chevalley 2018；Labbat 2020）。夸格贻贝从2019年起在布尔盖湖被观察到（CISALB，个人交流，2022）。在进行本研究时，艾格贝莱特湖和安纳西湖尚未记录到夸格贻贝的存在。在每个湖泊中，采样地点与已建立的长期生态监测点对齐，即由OLA-Lake Observatory监测的浮游层的代表性采样点（Rimet等人2020）。这些采样点代表每个湖泊的最深处，历史上被选为监测的参考点（图1和表1）。图1展示了采样地点和策略。（A）日内瓦湖、布尔盖湖、安纳西湖和艾格贝莱特湖的地图，改编自Navionics。红星代表每个湖泊的采样地点（水样和浮游生物网采样）。（B）从每个湖泊收集的四种类型的样本：（i）综合水样，每个样本过滤1.2–3.1升水（41个样本），从2022年8月到2023年7月；（ii）次表层水样，每个样本过滤1.2–2升水（18个样本），从2023年3月到2023年7月；（iii）浮游生物批量样本，每个样本过滤5250升水（41个样本），从2022年8月到2023年7月；（iv）从浮游生物批量样本中视觉计数面盘幼虫，每个样本过滤5250升水（41个样本），从2022年8月到2023年7月。布尔盖湖、安纳西湖和日内瓦湖每月采样一次，持续1年（2022年8月到2023年7月），日内瓦湖因天气条件不佳在11月未采样。艾格贝莱特湖每年仅采样六次（该湖泊的常规监测频率）。表1. 湖泊信息和样本数量。

2.2 采样方法

在每个采样日期，收集了四种类型的样本：（i）进行了两次网捕采样，一次用于视觉计数面盘贻贝幼虫，另一次用于分析网捕收集的所有生物量的eDNA；（ii）另外两次采样用于从水中提取eDNA，一次是综合水样（0至50米深度），使用Hydro-Bios公司的Integrating Water Sampler IWS III设备，另一次是次表层（约10–20厘米）样本，用手使用瓶子采集（图1）。采样从2022年8月持续到2023年7月，除了次表层水样，后者仅在2023年3月开始。

2.3 eDNA水过滤

水样存储在之前用实验室洗碗机用酸循环清洗过的容器中，然后用10%过氧化氢消毒，并用Milli-Q水冲洗三次。容器在返回实验室前保存在冷藏箱中（最长4小时），在那里立即过滤或在4°C的冷室中放置后再进行过滤。虽然优先选择立即过滤，但在某些情况下，由于从现场返回晚，过滤不得不推迟到第二天早上。在4°C下过滤的最大保存时间约为14小时。总共处理了59个水样（41个综合水样和18个次表层水样）。样品的过滤在实验室中使用Sterivex MILLIPORE过滤单元（0.45微米孔径）根据Vautier（2024）的详细协议进行。过滤单元在不添加保护缓冲液的情况下直接冷冻在-80°C。每个过滤单元过滤的水量在1.2到3.1升之间。同时，还处理了被称为“现场对照”的对照样本。这些是经过消毒的无DNA水瓶，在采样现场打开后密封，并与其他样本一起放置在冷却器中。对照样本的处理方式与其他水样本相同。在不同的采样活动中，定期采集对照样本，总共收集了8个对照样本（每个湖泊2个）。

2.4 浮游生物总量的采样
使用孔径为64微米、直径为36.5厘米的垂直网具，在0到50米深度范围内采集浮游生物总量样本（每次网具采样过滤的水量为5250升）。每个采集的样本被储存在250毫升的玻璃瓶中，然后放入冷却器中，直到带回实验室，在实验室中将其冷冻至-80°C。浮游生物总量的体积在178到245毫升之间。每次采样都会收集两个垂直网具样本，一个用于显微镜观察和计数，另一个用于eDNA分析。总共收集了82个浮游生物总量样本，其中41个用于显微镜计数，41个用于eDNA分析。通过对浮游生物总量样本进行eDNA分析，可以实现对两种贻贝的物种特异性鉴定（斑马贻贝与河马贻贝）以及幼虫密度的量化，从而与显微镜观察结果进行直接比较。

2.5 拟态幼虫的计数
对于每个样本（网具采样），使用双筒放大镜在大约10倍的放大倍数下计数拟态幼虫的数量，并从含有整个网具内容物的250毫升瓶子中取出200微升的子样本（体积从3到15毫升不等）。子样本在显微镜下依次检查，直到观察到拟态幼虫。如果没有观察到幼虫，则对整个样本体积进行计数。在41个用于显微镜计数的样本中，有10个样本进行了完整计数。对于其他样本，平均每个样本取出3个200微升的子样本（根据幼虫密度的不同，子样本数量从1到22个不等）。在分析的子样本中，共计数到0到67个个体（幼虫）。然后将幼虫数量表示为每过滤升水中的个体数量（考虑到通过网具过滤的总水量，即5250升水）。

2.6 从水中提取eDNA
使用NucleoMagDNA/RNA Water Kit（Macherey Nagel）和MagnetaPure 32核酸纯化系统（Dutscher）从过滤单元中提取DNA。提取过程按照Vautier等人（2024a）的详细协议进行。提取的DNA用50微升无DNA的水洗脱，使用Nanodrop分光光度计进行定量，并在-20°C下保存，以备后续的ddPCR分析。还进行了提取对照实验，即将用于初始提取的裂解液替换为NucleoMagDNA/RNA Water Kit中的C1缓冲液。共制备了四个提取对照样本。

2.7 从浮游生物总量中提取eDNA
在-80°C下冷冻的样本在4°C下解冻，然后进行倾倒步骤以浓缩样本中的生物量。漏斗事先用10%过氧化氢消毒，并用Milli-Q水冲洗三次。随后，将生物量以5000×g的离心力离心一分钟，以去除尽可能多的上清液。因此，不同样本中的生物量总量各不相同（0.3–5.9毫升）。提取使用的是这个总量的100微升。随后对ddPCR结果进行了校正，以考虑从不同样本中取出的100微升生物量总量有所不同（见第2.10节）。使用Macherey-Nagel的NucleoSpin Tissue试剂盒按照制造商的协议进行提取。首先用蛋白酶K进行预处理2小时。接着，DNA用100微升的BE洗脱缓冲液洗脱，并用Nanodrop分光光度计进行定量。然后DNA在-20°C下保存，以备ddPCR分析。同样也进行了提取对照实验，此时将100微升的生物量替换为100微升无DNA的水。共制备了六个提取对照样本。

2.8 引物和探针的开发和选择
我们开发了新的引物和探针组合，优化了它们在ddPCR中的多重使用，并验证了它们区分两种贻贝的有效性和特异性。根据Vautier等人（2023）的协议，开发并验证了针对D. polymorpha和D. r. bugensis的引物和探针。这两种贻贝的COI基因的DNA序列是从Barcode of Life数据库（Ratnasingham和Hebert 2007）中获取的。使用Primer3软件（Untergasser等人2012）设计了针对斑马贻贝和河马贻贝COI基因的PCR引物-探针序列。通过计算机模拟选择了理论上不会扩增其他物种（即在NCBI数据库中没有完全匹配）并且在斑马贻贝和河马贻贝之间显示出最多核苷酸差异的引物-探针组合。然后在研究中湖泊中存在的各种软体动物、腹足类和甲壳类动物（Anodonta cygnaea, Sphaerium corneum, Ampullaceana balthica, Lymnaea stagnalis, Gammarus spp., Hemimysis anomala, Orconectes limosus和Pacifastacus leniusculus）的组织中提取的DNA上测试了所选引物的特异性。所选引物和探针在表2中列出。斑马贻贝和河马贻贝的扩增子大小分别为97个和153个核苷酸。

2.9 ddPCR引物和探针的验证
使用ddPCR在研究湖泊中同时存在的软体动物、腹足类和甲壳类动物（A. cygnaea, S. corneum, A. balthica, L. stagnalis, Gammarus spp., H. anomala, O. limosus, P. leniusculus）的组织提取的DNA上测试了引物的特异性，以及Dreissena两种目标物种的特异性。方法的灵敏度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）是根据Dreissena组织DNA的五个连续稀释液（起始浓度为10 pg μL?1，每个浓度重复10次）的六个DNA浓度（10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 pg μL?1）确定的（详细协议：Vautier等人2023）。LOD定义为至少有一个阳性重复的结果的最低浓度。LOQ是根据Deprez等人（2016）的基于精确度的标准确定的。

2.10 ddPCR分析
ddPCR以双链形式进行，同时针对两种贻贝的线粒体基因组。选择的荧光标记物对于河马贻贝是FAM（约517纳米），对于斑马贻贝是HEX（约556纳米）。从每个样本中提取的eDNA分别进行分析。阴性对照包括现场对照、提取对照和无DNA水，而阳性对照是从每种目标物种的组织材料中提取的DNA。
ddPCR使用Bio-Rad QX600 ddPCR系统（Bio-Rad，比利时泰姆瑟）进行，总体积为20 μL，遵循Vautier等人（2024b）的协议。每个反应包含1x Bio-Rad ddPCR supermix（不含dUTP）、每种引物900 nM、每种探针250 nM、4 μL的模板DNA和5 U的AflII限制性内切酶，并用二乙基焦碳酸酯水（DEPC，Sigma-Aldrich，比利时奥弗赖塞）补充。将20微升的DNA/反应介质混合物转移到Droplet Generator DG8试剂盒（Bio-Rad，目录号1864008）的样本室中，并向相应的孔中加入70 μL的Droplet Generation Oil for Probes（Bio-Rad，目录号186-4005）。随后使用QX600 droplet reader（Bio-Rad）分析液滴。所有液滴都使用QX Manager Software 2.0进行荧光分析。用于区分阳性液滴和阴性液滴的荧光幅度阈值由分析师手动确定为阳性液滴组和阴性液滴组平均荧光幅度的中点。相同的阈值应用于给定PCR板的所有孔。接受的液滴平均数量约为17,000个。为了估计eDNA浓度（以每过滤升水的拷贝数表示），采用了Vautier等人（2023）提出的公式。对于从浮游生物总量中获得的eDNA样本，浓度计算还考虑了倾倒和离心后的浮游生物总量。这个体积在不同样本之间是变化的（0.3–5.9 mL），但用于DNA提取的浮游生物总量是固定的（100 μL）。所有原始数据和调整后的数据都可以在表S1中找到。

2.11 统计分析
为了测试不同eDNA采样方法（浮游生物总量、综合水、表层水）在每个湖泊×目标组合中的eDNA浓度是否存在差异，使用成对的Student's t检验比较了对数转换后的eDNA浓度（n = 8组，总共24次比较）。对数转换是为了达到正态性（Shapiro-Wilk p > 0.05，在22/24组转换后）。在每个组内使用p.adjust（方法 = “bonferroni”）进行Bonferroni校正，以控制α = 0.05时的家族I型错误（表S1）。分析在R 4.4.1中使用dplyr、purr和broom包进行。使用Spearman的等级相关系数（`cor.test(method = “spearman”）评估基于eDNA的估计值与拟态幼虫计数之间的关系。首先计算了斑马贻贝和河马贻贝的形态计数与每种采样方法获得的eDNA浓度之间的相关性（i），然后分别计算了所有湖泊合并和每个湖泊单独的情况（日内瓦、布尔热、阿讷西、艾格贝莱特）。统计显著性在α = 0.05的水平上进行测试。分析在R 4.4.1中进行。

3 结果
3.1 引物和探针的灵敏度和特异性测试
从新设计的引物/探针组合提取的组织DNA的稀释液中估计了LOD和LOQ。两种引物组的LOQ均为0.4 pg DNA，河马贻贝的平均每个反应拷贝数为1.49个，斑马贻贝的平均每个反应拷贝数为3.21个。在不同的DNA量下获得了LOQ，河马贻贝的LOQ为0.08 pg DNA，平均每个反应拷贝数为0.30个；斑马贻贝的LOQ为0.016 pg DNA，平均每个反应拷贝数为0.19个（图2）。
引物组的灵敏度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）是通过使用六种不同量的DNA（10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 pg）来评估的，这些DNA量是从河马贻贝和斑马贻贝的最高DNA量（10 pg）的五个连续稀释液中获得的，每个稀释液重复10次。黑色三角形表示基于从最高DNA量获得的基因拷贝数对每个ddPCR孔的理论估计值。河马贻贝引物（蓝色圆圈），斑马贻贝引物（绿色方块）。通过使用从研究湖泊中存在的其他物种（软体动物、腹足类和甲壳类动物）的组织中提取的10 pg DNA进行ddPCR来确定引物的特异性，这些物种包括河马贻贝和斑马贻贝。没有观察到非特异性扩增，因此得出结论，新设计的引物对目标贻贝具有特异性。

3.2 四个湖泊中两种贻贝的eDNA浓度比较
对三种采样方法获得的eDNA浓度进行比较后发现，浮游生物总量方法和综合水方法得到的浓度相似，而表层水方法始终产生较低的值（图3）。经过Bonferroni校正后，这些差异在统计上显著（p < 0.01），特别是在布尔热湖的河马贻贝中，浮游生物总量方法和综合水方法的表现优于表层水方法；在阿讷西湖的斑马贻贝中，浮游生物总量方法的结果优于表层水方法（p < 0.05）。其他湖泊×目标组合没有显示出显著差异，尽管浮游生物总量方法和综合水方法通常显示出较高的值，但艾格贝莱特湖的斑马贻贝除外，其中综合采样未能检测到eDNA，而表层水采样成功检测到了。值得注意的是，在日内瓦湖，只有浮游生物总量方法能够检测到斑马贻贝的eDNA；而在阿讷西湖和艾格贝莱特湖，表层水分析未能检测到河马贻贝的eDNA（图3）。
四个湖泊中获得的eDNA浓度，以及两种贻贝（斑马贻贝（A）和河马贻贝（B）的eDNA浓度，以ddPCR的拷贝数表示，并进行了对数转换。大量eDNA方法以深灰色显示，水体整合eDNA以中灰色显示，次表层水eDNA以浅灰色显示。在同一湖泊内对不同的eDNA方法进行了学生t检验，显著差异的p值分别为**< 0.01和*< 0.05。

3.3 四个湖泊中eDNA浓度和veliger幼虫数量的月度动态
视觉计数显示所有四个湖泊中都存在veliger幼虫。在其中两个湖泊Geneva和Bourget，我们全年都观察到了幼虫的存在，而在Annecy和Aiguebelette湖泊中，从1月到5月没有观察到幼虫。在所有四个湖泊中，幼虫数量在“温暖”时期（6月至10月）达到峰值。
eDNA分析在每个湖泊中至少检测到了一次quagga贻贝和zebra贻贝（图4）。quagga贻贝的信号出现在Bourget和Geneva湖泊的所有样本中，而在Annecy湖泊的29个样本中只有7个样本有信号，在Aiguebelette湖泊的15个样本中只有5个样本有信号。zebra贻贝的eDNA信号仅在Geneva湖泊的27个样本中的2个样本中被成功检测到，并且仅出现在大量eDNA样本中。对于Bourget湖泊，29个样本中有12个样本显示zebra贻贝的存在，主要发生在温暖时期。图4在图查看器中打开

四个研究湖泊（Geneva、Bourget、Annecy和Aiguebelette）中eDNA浓度和veliger幼虫数量的月度动态。三种eDNA方法分别标记为：0-50米深度之间的水体整合（I）、次表层水（S）和浮游生物大量（B），并针对两种贻贝进行了展示。浮游生物大量中的veliger幼虫的显微镜计数未区分两种贻贝。结果以相对eDNA浓度或幼虫数量表示，参考值（100%）为每种方法全年观察到的最高值（即该方法的最高eDNA浓度或最高幼虫数量）。如果没有圆圈，则表示没有采集样本。在Geneva湖泊中，所有eDNA方法在温暖时期显示出更强的quagga和zebra贻贝eDNA信号。在Bourget湖泊中，只有基于水的eDNA遵循这一趋势，而大量eDNA在寒冷月份检测到更强的quagga贻贝信号。将82个整合水体eDNA样本与82个大量DNA样本的ddPCR结果进行比较，发现61个样本的结果相同，即74%的情况。大量eDNA检测到了整合水体未检测到的12个阳性样本，而整合水体捕获了大量eDNA未捕获的9个阳性样本。两种方法的效率相当，仅在罕见信号（< 10%的最大值）下存在差异。由于次表层水的采样周期有限，我们将其排除在分析之外。整合水体eDNA显示了假阳性（测量到eDNA信号但未观察到幼虫），而大量eDNA没有这种情况。关于检测率（即，对两种贻贝之一或至少观察到一个幼虫的样本百分比），我们发现整合水体eDNA、幼虫计数和大量eDNA得出的结果非常相似，分别为82.9%、85.5%和80.5%。次表层水eDNA的值较低，所有样本中只有66.7%检测到任一贻贝物种。在两个湖泊中，两种贻贝的阳性信号主要发生在温暖时期。

3.4 eDNA方法与veliger幼虫显微镜计数之间的相关性
我们将形态计数与两种贻贝的累积eDNA浓度进行了比较，因为视觉识别无法区分它们。所有方法都显示出强烈的显著相关性（p < 0.001）（图5）。对于quagga贻贝，所有方法的相关性都显著，p < 0.001，除了视觉计数与次表层水eDNA之间的相关性，其p值< 0.01。zebra贻贝的相关性较弱，eDNA与视觉计数之间没有显著相关性。对于zebra贻贝，eDNA方法仍然显示出显著相关性，但相关系数低于quagga贻贝的相关系数。在所有湖泊中，veliger的存在与quagga贻贝eDNA的相关性比与zebra贻贝eDNA的相关性更强。

4 讨论
本研究在检测入侵性dreissenid贻贝的技术方法及其在阿尔卑斯山周边湖泊中的生态学理解方面取得了重大进展。

4.1 湖泊中dreissenid贻贝监测的技术进步
本研究提出了两种使用eDNA识别和监测入侵性dreissenid贻贝的显著技术进步。首先，我们开发了特定于物种的多重ddPCR引物/探针，以克服缺乏独特形态特征的幼虫的识别挑战。这些引物表现出高特异性和敏感性，通过计算其LOD和LOQ，使得通过ddPCR获得的结果分析更加稳健。与我们研究中使用的传统qPCR方法相比，ddPCR具有优势，因为传统方法已被证明可以有效检测dreissenid贻贝（例如，Blackman等人2020年；de Ventura等人2017年；Gingera等人2017年）。ddPCR的优势包括无需标准曲线即可进行绝对定量（Vogelstein和Kinzler 1999年）、更低的检测限、更高的灵敏度、准确性和可重复性（Hindson等人2013年）以及对抑制剂的更大耐受性（Hoshino和Inagaki 2012年）。此外，ddPCR能够在大量非目标核酸的背景下有效检测稀有DNA（Pohl和Shih 2004年），从而提高了eDNA方法检测稀有水生生物的灵敏度（Doi等人2015年）。这些优点使ddPCR成为未来入侵物种监测计划的理想工具，允许早期检测，增加成功根除或控制的机会，并降低成本，因为不需要标准曲线或重复实验。其次，我们比较了三种不同的eDNA采样方法来监测湖泊中quagga和zebra贻贝的繁殖期：水体整合样本、次表层水样本和浮游生物大量样本。eDNA峰值可能是由于精子释放和产卵聚集造成的，这些峰值被用来确定鱼类产卵的时间（Bylemans等人2017年；Takeuchi等人2019年；Tsuji和Shibata 2021年；Vautier等人2023年）。这种eDNA峰值表明这一生活史阶段特别适合通过eDNA进行监测。在本研究中，我们假设在贻贝的繁殖周期中也会观察到类似的eDNA峰值，并且主要归因于水中veliger幼虫的存在。我们的结果表明，这三种eDNA采样方法在估计湖泊中贻贝的繁殖期方面是有效的。据我们所知，这是首次证明eDNA可用于监测贻贝繁殖的研究，并且能够区分quagga和zebra贻贝的产卵信号。所有三种eDNA采样方法与四个研究的阿尔卑斯山周边湖泊中的veliger计数显示出显著的正相关。然而，不同方法获得的结果有显著差异。次表层水eDNA在检测频率和信号强度方面始终表现较差。这种低效率在弱eDNA信号时尤为明显，即次表层水eDNA在Annecy和Aiguebelette湖泊中未能检测到quagga贻贝，而其他两种eDNA方法检测到了弱信号。这些结果与Miller等人（2024年）的报告一致，他们证明使用大量eDNA样本比次表层水eDNA样本更有效地检测湖泊中的zebra贻贝eDNA信号。虽然次表层采样最容易实施，但使用此处应用的协议时，它在量化湖泊中dreissenid贻贝繁殖信号方面效果最差。方法上的优化，例如增加过滤体积，可以提高次表层方法的性能（例如，Govindarajan等人2022年；Peres和Bracken-Grissom 2025年）。整合水体eDNA和大量eDNA都与幼虫计数显示出显著的正相关，并且产生了较高的贻贝eDNA浓度。这证实了我们的假设：贻贝繁殖期间的eDNA峰值反映了幼虫的释放，可以通过大量eDNA样本检测到——如果网眼大小与veliger幼虫的大小相匹配（70-300 μm）——或者通过在幼虫存在的扩散区域直接采集的整合水体eDNA样本检测到。然而，尽管基于大量的eDNA方法在定性判断veliger幼虫的存在/缺失方面很稳健（只有在观察到幼虫时才有正eDNA信号），但我们观察到两次整合水体eDNA的假阳性（在没有观察到幼虫的情况下也有eDNA信号）。这并不意外，因为基于水的eDNA同时反映了幼虫和持续存在的成体DNA（自由或结合在颗粒eDNA上）。大量eDNA的阳性信号几乎可以肯定地表明前几周存在幼虫，因此表明了繁殖活动（Pollux等人2010年的综述），而基于水的eDNA的阳性信号则不一定如此。尽管两种方法在所有四个湖泊中都与幼虫计数显著相关，但在Bourget湖泊中，大量eDNA未能显示出这种相关性（支持信息材料S1）。在那里，大量样本在寒冷月份（12月至2月）显示出quagga贻贝的峰值，与视觉计数和其他eDNA方法的结果相反。这种差异可能反映了从浮游生物网中收集的大量样本的固有偏差。这种偏差可能是因为冬季浮游生物密度低，增加了在大量样本中捕获veliger的概率，从而高估了幼虫eDNA信号（夏季大量样本中的信号强度是冬季的20倍）。我们通过总浮游生物体积调整了eDNA数据，但进一步的改进可以包括从整个网拖曳生物量中提取DNA或在分样前裂解整个样本。在Bourget湖泊中，整合水体eDNA方法与视觉计数显著相关，并且比大量eDNA更好地捕捉到了繁殖动态。大量eDNA是唯一在Geneva湖泊中检测到zebra贻贝的方法，而整合水体eDNA在样本中更频繁地检测到quagga贻贝。浮游生物网过滤体积超过5000升（而整合水体样本为5升），提高了幼虫捕获概率，但错过了< 64 μm的自由或结合在颗粒上的eDNA。网和过滤器的孔隙率对水生环境中eDNA检测的成功至关重要（例如，Kumar等人2022年；Jo等人2020年）。大量eDNA在检测quagga贻贝方面表现较差，可能是因为它们主要的< 64 μm（非幼虫）eDNA部分逃过了浮游生物网。quagga贻贝通常占据更深层的浮游生物栖息地（Claxton和Mackie 1998年；Nalepa等人2010年；Roe和MacIsaac 1997年），因此它们释放的eDNA更容易到达中心采样点。相比之下，zebra贻贝通常栖息在沿岸区域，导致中心采样点的非幼虫eDNA较少。然而，它们的veliger可能广泛扩散（Orlova等人2004年；Stoeckel等人2004年），从而有可能在浮游生物大量样本中检测到它们。此外，硬壳生物释放的eDNA量较少（Adams等人2019年；Andruszkiewicz和Allan等人2021年；Sansom和Sassoubre 2017年）。它们的eDNA降解速率与其他水生生物相当（Ruiz-Ramos等人2024年），限制了远距离检测。本研究中测试的协议表明，大量eDNA方法提供了关于贻贝幼虫存在/缺失的更高质量信息，并且是唯一在Geneva湖泊中检测到zebra贻贝的方法。然而，整合水体eDNA方法在量化湖泊中贻贝繁殖动态方面表现更好（73.2%对比68.3%），而大量eDNA在检测zebra贻贝方面表现更好（43.9%对比26.8%）。

4.2 关于湖泊中dreissenid贻贝生态学的知识进展
本研究首次表明Annecy和Aiguebelette湖泊中存在quagga贻贝。先前的研究已经证明了环境DNA（eDNA）在湖泊/河流中早期检测dreissenid贝类的有效性（例如，Blackman等人2020年；de Ventura等人2017年；Gingera等人2017年）。早期检测使得成功根除了澳大利亚的一种黑条纹入侵贻贝（Mytilopsis sallei）种群（Bax等人2002年），这凸显了开发和实施有效入侵物种早期检测工具的迫切需求。Quagga贻贝会显著改变湖泊生态系统，包括提高水质透明度（Budd等人2001年）、改变浮游植物组成（Vanderploeg等人2010年）以及损坏基础设施（Connelly等人2007年）。在Annecy湖和Aiguebelette湖中早期检测到Quagga贻贝后，需要制定特定的管理计划以防止其他种群入侵。杂交可能会产生更强壮、适应性更强的后代（Marescaux等人2016年；Roman和Darling 2007年）。此外，对未受侵扰区域的持续监测仍然至关重要。该研究揭示了Quagga贻贝和斑马贻贝之间的明显繁殖模式：在Quagga贻贝占主导地位的日内瓦湖和Bourget湖中，我们全年都能检测到浮游幼虫，并通过eDNA确认了这些幼虫属于Quagga贻贝。相反，在Annecy湖和Aiguebelette湖中，斑马贻贝占主导地位，从1月到5月没有检测到幼虫。由于dreissenid贝类的幼虫在定居前最多只能在水中长期存活五周（Sprung 1989年），我们的结果表明Quagga贻贝可以在高山湖泊中全年繁殖，而斑马贻贝似乎仅限于温暖的月份繁殖。这与先前的研究结果一致，即Quagga贻贝更能耐受低温，能够在9°C的温度下发育（Claxton和Mackie 1998年），甚至在低至4.8°C的温度下也能繁殖（Roe和MacIsaac 1997年），而对于斑马贻贝来说，其生存温度上限似乎要高得多，大约为12°C（Claxton和Mackie 1998年；Sprung 1995年）。Quagga贻贝较长的繁殖期以及较低的冬季死亡率（D'Hont等人2018年）可能使其在高山湖泊中相对于斑马贻贝具有竞争优势。在Annecy湖和Aiguebelette湖中，幼虫仅出现在6月至12月期间，这与斑马贻贝的温暖繁殖期相匹配。eDNA分析，尤其是基于体积的方法，证实了这一模式。在所有四个湖泊中，幼虫数量和eDNA信号在“温暖”时期（4月至10月）达到峰值，这表明两种贝类都偏好这一繁殖窗口（Claudi和Mackie 1993年）。Quagga贻贝的eDNA浓度与浮游幼虫数量之间的强相关性，相比之下斑马贻贝的相关性较弱，进一步支持了Quagga贻贝在日内瓦湖和Bourget湖中的优势地位。这种物种组成的变化对生态系统管理具有重要意义，并强调了需要采用特定于物种的监测方法。由于Quagga贻贝在大约9年后几乎完全取代了斑马贻贝（Karatayev等人2015年；Nalepa等人2010年），eDNA检测结果也反映了这一动态：Quagga贻贝于2015年首次出现在日内瓦湖（Haltiner等人2022年），随后在2019年出现在Bourget湖（CISALB个人通讯，2022年）。eDNA方法能够准确追踪这两种贝类之间的动态变化，未来的监测可以检测12年后Quagga贻贝密度的稳定情况（Karatayev等人2011年）。

**5. 前景**

随着dreissenid贝类的持续扩散并对淡水生态系统造成影响，本研究获得的工具和知识对于制定有效的监测计划以及支持受侵扰和未受侵扰湖泊的管理工作将具有不可估量的价值。为了进一步推进这些发展，未来的研究应重点优化eDNA采样和分析方法，以解决当前在检测和量化方面的局限性。在本研究中，eDNA采样是在湖泊最深区域进行的，结果显示水中的斑马贻贝比Quagga贻贝更难以被检测到。由于斑马贻贝主要分布在较浅的区域，因此在更靠近岸边的区域进行采样可以提高捕获斑马贻贝释放的eDNA的机会，从而提高其检测率。关于基于体积的eDNA方法，观察到了一个可能的偏差，因为总体积会随季节变化。提取过程是从固定体积的子样本中进行的，因此在冬季捕获浮游幼虫的概率较高，而在夏季则较低。为了减少这种偏差，可以在整个样本上进行DNA提取，或者在取样前将全部生物量进行裂解，从而在用于提取的各部分样本中均匀分布目标DNA。本研究中开发的ddPCR方法也可以用于监测其他入侵水生物种，有可能提高其早期检测和繁殖周期的特征分析，从而帮助我们更好地了解和管理入侵物种。

**作者贡献**

Marine Vautier：概念化、研究设计、资金筹集、初稿撰写、方法论制定、验证、数据可视化、审稿和编辑、软件使用、数据分析、数据管理、监督及资源协调。Isabelle Domaizon：概念化、资金筹集、审稿和编辑、验证、项目管理、监督、资源协调、方法论制定及研究实施。

**致谢**

作者感谢OLA服务部门——ANAEE-France在野外采样方面的协助，特别是Pascal Perney、Jean-Christophe Hustache和Philippe Quetin的支持。我们还要感谢Leslie Laine在显微镜下进行幼虫计数的工作。同时，我们也感谢Jean-Nicolas Beisel在日内瓦湖进行的关于Quagga贻贝量化方法比较项目中的贡献，尤其是他整理的文献综述，这为我们的研究提供了起点。最后，我们感谢日内瓦自然历史博物馆的Isabel Blasco-Costa提供了用于引物特异性测试的无脊椎动物样本。

**资金情况**

作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**

本研究生成或分析的所有数据都包含在发表的文章及其支持信息材料中（表S1）。