利用适配体功能化的纳米器件增强小分子传感能力

《Advanced Materials Technologies》：Enhancing Small Molecule Sensing With Aptameric Functionalized Nano Devices

　　**摘要**

小分子生物标志物对生理和神经功能至关重要，然而在生物流体中可靠地量化它们仍然存在技术挑战。传统的光学和电化学传感器在皮摩尔水平上的灵敏度不足，在复杂介质中信号不稳定，容易受到化学性质相似物种的干扰，并且依赖于标记物或笨重的仪器，这限制了它们在快速、便携式生化传感中的应用。场效应晶体管（FET）生物传感器通过无标记的电学检测在传感器表面识别分子相互作用，提供了一个有吸引力的替代方案。在这里，我们展示了一种用血清素特异性DNA适配体功能化的纳米结构硅纳米线FET（SNF），用于灵敏且选择性地检测血清素。利用纳米结构通道的高表面积与体积比和可调的电子特性，该设备在1 pM的检测限下，响应范围覆盖了从1 pM到1 μM的测试浓度范围。测量是在人工汗液中进行的，这种环境具有高离子强度，代表了具有挑战性的生物流体条件，以评估设备在强离子屏蔽下的性能。通过原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）和水接触角测量对表面进行了表征，确认了探针的成功固定，而密度泛函理论（DFT）模拟提供了与适配体构象变化相关的电荷重新分布的定性见解。这项工作建立了一个用于高离子环境中小分子检测的概念验证纳米FET平台。

**1 引言**

准确检测小分子生物标志物对于理解生理过程和实现及时疾病诊断至关重要。血清素（5-羟色胺，5-HT）是一种单胺神经递质，参与调节情绪、认知、睡眠和食欲[1, 2]。血清素水平异常与多种神经和精神疾病有关，包括抑郁和焦虑，而过高水平可能导致血清素综合征[3, 4]。由于血清素在生物系统中的浓度通常非常低，其灵敏检测仍然是一个重要的分析挑战。传统的分析技术如荧光法、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）和酶联免疫吸附测定（ELISA）可以提供准确的量化，但通常需要复杂的仪器和实验室程序，这限制了它们在快速生化传感中的应用[5, 6]。

**2 结果与讨论**

**2.1 SNF的表征**

在液体门控配置下评估了SNF的电性能，其中使用Ag/AgCl参比电极在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中施加栅极电压，图2A。通过将漏源电压（VDS）从0.0扫描到?2.0 V（40 mV步长），同时调整栅极电压（VGS）从0.0到?1.0 V（100 mV步长），记录了设备的输出特性，图2B。观察到随着VGS变得更负，漏电流（IDS）增加，这是p型FET增强模式的典型特征[38]。图2C显示了在不同漏源电压（VDS）下SNF生物传感器的传输特性。当VDS从0 V扫描到?1.2 V，步长为?0.3 V时，IDS的负值反映了在负偏压下电流从源到漏的方向，这与p型FET的操作一致。在低|VGS|值时，IDS保持较低（在纳安范围内），表明通道传导较弱。随着栅极电压变得更负，IDS急剧上升，在VGS = ?3 V和VDS = ?1.2 V时达到约?8.5 μA。这种随着栅极偏压增加而急剧上升的漏电流确认了典型的p型FET行为，其中空穴传导受到施加的栅极电压的调节。亚阈值摆幅（SS）确定为约120 mV/dec。开-关漏电流比约为10^4，这对于SNF来说是典型的（图S1）。跨导Gm峰值在VDS = ?1.2 V时约为6 μS，并随着漏偏压的增加而增加，反映了从弱反转到强反转的转变，图2D。观察到一个低阈值电压（Vth = ?0.6 V），使得这些设备适合用于低功耗生物传感应用。此外，漏电流保持在亚纳安范围内（图S2），确认了设备的高质量和适用于液体测量的生物传感应用。

**2.2 pH测量**

为了评估SNF的pH敏感性，我们在pH值从4到10的缓冲溶液中测量了传输特性（IDS-VGS），覆盖了人类汗液的典型pH范围。当暴露在水环境中时，纳米线的SiO2表面会发生羟基化，形成硅醇（-SiOH）基团。这些基团在酸性条件下可以质子化（形成-SiOH2+），在碱性条件下可以去质子化（形成-SiO?），图3A。这种动态表面反应改变了表面电位，调节了FET的通道传导性。如图3B所示，pH值的增加导致传输曲线向右移动，表明阈值电压增加。在较高的pH值下，表面羟基的去质子化导致表面带负电荷增加，从而增强了p型SNF通道中的空穴积累，增加了漏电流。相比之下，在较低的pH下，质子化减少了表面负电荷，导致漏电流减少。

**2.3 血清素检测的生物功能化和表面表征**

表面修饰是在具有与SNF表面相同表面化学性质的参考SiO2/Si晶圆上进行的。然后将该过程以1:1的比例转移到SNF上。图4A–D展示了不同阶段SNF表面的AFM分析。SiO2表面显示出平滑的地形，均方根粗糙度（RMS）为0.42 ± 0.03 nm。经过(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）处理后，表面RMS粗糙度增加到0.55 ± 0.07 nm，确认形成了氨基硅烷单层。随后用MBS和适配体进一步功能化，粗糙度增加到0.61 ± 0.04 nm。在血清素结合后，RMS值显著增加到0.71 ± 0.06 nm，这归因于适配体-目标复合物的形成。这些表面形态的变化确认并验证了成功的顺序探针固定和目标识别。

**3 结论**

本工作开发了一种用于高离子环境中小分子检测的概念验证纳米FET传感平台。通过使用人工汗液作为控制的高离子强度电解质，该平台在1 pM到1 μM的测试浓度范围内展示了皮摩尔级别的血清素检测能力。表面表征（包括X射线光电子能谱（XPS）、原子力显微镜（AFM）和水接触角（WCA）确认了适配体的成功固定，而密度泛函理论（DFT）模拟提供了与适配体构象变化相关的电荷重新分布的定性见解。这些结果为在受控实验条件下小分子检测的纳米FET传感平台提供了概念验证。在血清素结合后，接触角略微增加至60.3°，这反映了适配体的构象变化。

2.4 密度泛函理论（DFT）建模

为了更详细地了解每个功能化步骤后SNF的结构，并说明生物传感机制，我们使用维也纳从头算模拟程序（VASP）[40, 41]进行了密度泛函理论（DFT）计算。在UV-Ozone（UVO）激活后，表面生成了亲水性官能团。图4H显示了经过UVO处理后的SNF结构，其表面羟基团的覆盖率高（称为SNF-UVO）。由于这些丰富的OH基团的存在，SNF表面变得高度亲水，从而增强了水在SNF-UVO上的吸附能力。结果，在SNF-UVO表面可以有利地形成完整的水层（见图S7）。这一观察结果与图4G中测量到的UV-臭氧处理后SNF的低水接触角一致。如图4H的插图所示，三个相邻的OH基团在SNF-UVO表面上形成了一个三角形排列，O-O距离为2.71 ?。这个值与APTES结构中的O-O距离2.73 ?非常吻合（见图4I的插图），表明在功能化过程中SNF-UVO和APTES之间有很高的兼容性。这表明在SNF-UVO上形成APTES单层是高度可行的。实际上，图4I展示了SNF-UVO上有序APTES单层的结构。在这种结构中，SNF-UVO的所有表面OH基团都已经去质子化，降低了表面的亲水性，这与图4G中测量的SNF-APTES水接触角的增加是一致的。

2.5 血清素传感

我们通过监测阈值电压随血清素浓度变化而发生的偏移来研究SNF生物传感器对血清素的检测灵敏度，见图5A。在测量过程中，栅极电压（VGS）从0扫描到-2.0 V，增量为-0.04 V，而漏源电压（VDS）固定在-0.9 V。图5显示了使用适配体功能化的SNF进行血清素传感的情况：(A) 不同血清素浓度（0 pM–1 μM）下SNF的转移特性IDS-VGS；(B) 校准后的响应（ΔVth）与血清素浓度的对数关系（N = 3个设备）；(C) 在相同浓度下，SNF生物传感器对血清素和代表性干扰物（雌二醇、皮质醇和孕酮）的转移曲线；(D) 适配体功能化的SNF与雌二醇、皮质醇和孕酮的特异性比较；(E) 适配体功能化的SNF用于血清素传感的示意图；(F) 非捕获适配体和(G) 捕获适配体的SNF生物传感器的优化结构和表面电荷分布。插图显示了相应的电荷密度差异，其中绿色和蓝色区域分别代表电子密度不足（正）和过剩（负）的区域。所有传感测量都是在静态暴露条件下进行的，设备依次暴露于逐渐增加的血清素浓度下以构建校准曲线。这种方法用于在受控条件下评估适配体功能化SNF平台的灵敏度和信号转导行为。转移特性随着血清素浓度的增加而一致地向左移动，范围从1 pM到1 μM。适配体具有高度负电荷的磷酸骨架，在血清素结合时会发生构象变化，将负电荷的骨架从半导体通道中拉开，从而降低局部负表面电位。在p型FET中，由于空穴载流子主导导电，这种表面电荷的减少减少了通道界面的静电排斥。结果，通道中积累的空穴减少，导致漏电流下降[30]。传感响应通过阈值电压偏移（ΔVth）来量化，使用与pH校准中描述相同的方法提取。图5B展示了SNF生物传感器对血清素浓度的校准响应。传感器响应在1 pM到1 μM的测试浓度范围内进行了评估。校准曲线显示响应随血清素浓度非线性增加，并在较高浓度时逐渐趋于饱和，这与之前的报告一致[42]。为了验证传感界面的特异性，使用了随机序列的适配体作为阴性对照。用随机序列修改的设备在所有测试浓度下显示出最小的信号变化，证实响应是由特定的适配体-血清素相互作用引起的，而不是非特异性结合或背景噪声。为了评估SNF生物传感器的选择性，使用结构相关的生物分子（孕酮、雌二醇和皮质醇，浓度为10 nM）进行了对照实验。图5C显示了SNF设备在不同分析物暴露后的转移特性（IDS-VGS），而图5D总结了相应的阈值电压偏移（ΔVth）。与血清素相比，这些分子仅产生了微小的ΔVth变化，表明适配体功能化的SNF表面对血清素具有选择性识别。为了进一步阐明生物传感机制，进行了密度泛函理论（DFT）计算（见图5F,G）。由于完整的血清素适配体包含44个核苷酸和超过一千个原子，直接在DFT水平上优化整个适配体-表面系统在计算上是不可行的。因此，使用了一个简化的分子片段-S-(CH2)6-OP3H2来代表表面结合的适配体的末端区域，并研究功能化基团与SNF表面之间的电子相互作用。这种简化表示捕获了传感界面附近的局部静电环境，这预计将主导FET设备的电响应。然而，应该注意的是，该模型并没有完全再现完整适配体的结构复杂性或完整的构象动态。相反，这些计算旨在提供关于在非捕获和捕获配置之间转换时表面电荷重新分布的定性见解。图5F表示了功能化基团在表面附近折叠时的非捕获适配体的结构。图5G展示了血清素结合时适配体的构象变化。血清素的结合诱导了磷酸骨架的重新排列，导致其呈现出直立的构象，远离表面，这一机制与之前报道的适配体-FET传感行为一致[43]。这种结构转变修改了传感界面的局部静电环境，并与实验观察到的随着目标浓度增加而降低的漏电流一致。电荷密度差异图（图5F,G中的插图）清楚地显示了捕获适配体情况下表面正电荷密度的减少（直立结构，图5G），这反映在其较低的正电荷密度（绿色区域）上。Bader电荷分析进一步表明，非捕获配置下的表面（图5F）比捕获配置下正电荷多0.27 e。此外，折叠配置在能量上比直立配置稳定约96 kJ mol?1，表明只有在与血清素结合时，直立构象才变得有利。这些结果提供了关于适配体构象变化如何调节SNF表面静电环境的定性见解。

3 结论

在这项工作中，我们开发了一种纳米结构的FET生物传感器，该传感器功能化了一种特定的DNA适配体，用于在人工汗液中无标记地检测皮摩尔浓度的血清素。SNF设备表现出稳定的电学特性，具有低阈值电压和最小的漏电流，能够在液栅测量中可靠地工作。通过AFM、XPS和水接触角测量确认了表面功能化，证实了适配体传感层的成功固定。所得到的生物传感器在人工汗液中检测血清素的灵敏度范围为1 pM到1 μM。使用随机序列的适配体和代表性小分子进行的对照实验进一步支持了适配体功能化SNF平台的选择性目标识别。补充的密度泛函理论（DFT）模拟提供了与目标结合期间适配体构象转变相关的静电变化的定性见解。SNF设备还显示出由于表面硅醇基团的质子化-去质子化而产生的显著pH响应。虽然这种行为是氧化物栅FET的固有特性，但在复杂的生物流体（如汗液）中可能会引入变异性。因此，血清素测量是在受控的电解质条件下进行的，以避免pH相关的混淆效应。通过集成pH参考晶体管、差分读出架构或多传感器阵列等缓解策略，可以实现实时补偿pH引起的偏移，并在动态环境中提高鲁棒性。总之，这些结果证明了纳米结构FET生物传感器在高离子强度环境中检测小分子的可行性。目前的工作重点是在使用人工汗液作为标准化电解质环境的条件下展示概念验证的传感性能。未来的工作将专注于研究设备间的可重复性、再生能力以及在更复杂的生物基质中的传感性能。

4 材料与方法

4.1 材料

(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、m-马来酰苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、血清素、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和6-巯基-1-己醇（MCH）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，无需进一步纯化即可使用。人工汗液（BZ320，Bio Chemazone，加拿大）被配制用于模拟人体汗液的离子组成，作为血清素传感实验的电解质介质，无需稀释。硫醇化的血清素DNA适配体和随机对照序列来自Integrated DNA Technologies（IDT，爱荷华州科拉尔维尔）。血清素适配体的序列为5’-/5ThioMC6-D/CCCGGGAATTCCGGAATTGGGGCAATTGATGAGG-GGGTCATGGG-3’ [42]。这种44个核苷酸的适配体是通过SELEX方法开发的，并由Liu等人[44]使用荧光测定法验证，即使在潜在干扰分子存在的情况下，也显示出对血清素的高亲和力和特异性。随机对照序列的设计长度和GC含量相似，为5’-/5ThioMC6 D/ CCA CCG CAG TCC GGT CGC TTG CTC GCT GTG TGG GTA GGT CG-3’ [45]。

4.2 纳米印迹SNF生物传感器的制造

在4英寸绝缘体上的硅晶圆上制造纳米印迹SNF的过程在图S4中描述，并基于我们之前的协议[21, 38, 46]进行了调整。最初的顶层硅层经过热氧化，达到最终厚度50 nm，中间有30 nm厚的二氧化硅（SiO2）。30 nm厚的SiO2为使用四甲基氨醇（TMAH）进行湿法蚀刻提供了坚固的硬掩模。接下来，我们采用纳米印迹光刻（NIL）技术，使用印章将纳米级特征转移到基底上。晶圆上旋涂纳米印迹热阻（Nanonex2100，Nanonex Inc. USA）以达到200 nm厚的层，然后在90°C下烘烤20分钟。纳米级图案通过将印章图案压在阻层上并在160°C下施加450 Psi的压力压印6分钟，然后在35°C下进行脱模处理。剩余的阻层图案通过反应离子刻蚀（RIE）工艺去除，使用200 W功率和2 Pa压力下的20 sccm氧气流，刻蚀速率为约3 nm/s，持续1分钟。随后进行了另一个RIE工艺，使用30 sccm CHF3流在200 W和3 Pa压力下持续3分钟，将印迹的阻层转移到SiO2层上。接着，以SiO2层作为硬掩模，使用四甲基氨醇（TMAH）（25%，90°C，1分钟）对下层硅进行各向异性湿法蚀刻，以定义硅纳米线和接触线。随后通过离子注入在接触线上掺杂硼，以降低电阻，同时SNF保持其原始的14–22 Ω·cm的电阻率。这种掺杂过程产生了p型SNF结构，具有p+/p+/p+的配置，其中纳米线通道完全耗尽。纳米线有意保持低掺杂水平，以保持高载流子迁移率。在晶圆上沉积了300 nm厚的二氧化硅层，使用低压化学气相沉积（LPCVD）来钝化接触线，以便在溶液中可靠工作并防止漏电流。LPCVD SiO2通过标准光刻和随后的1% HF蚀刻在10分钟内进行图案化，仅暴露传感区域和接触垫。然后通过光刻在纳米线上热生长了大约7 nm厚的二氧化硅层作为栅氧。源极和漏极接触垫通过光刻完成，随后沉积Al/Ti/Au（150/20/200 nm）金属堆叠，并通过标准剥离工艺进行退火，形成欧姆电接触。

4.3 SNF功能化

首先，SNF用UV臭氧（Ossila, Ltd., UK）处理7分钟，以清洁表面并增强表面的亲水性（见图S5）。清洁后的表面然后在真空室中通过气相沉积(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）在80°C下处理1小时，随后在同一温度下烘烤额外一小时。硅烷化处理后，设备用乙醇和去离子水冲洗，然后浸入1 mM的m-马来酰苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）溶液中，该溶液由二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）以1:9（体积比）混合而成，在室温下浸泡30分钟。在此步骤中，MBS的NHS酯基与APTES表面的胺基反应，引入了能够与巯基修饰分子偶联的马来酰亚胺官能团。为了固定血清素特异性适配体，在设备表面滴加10 μL的1 μM巯基化DNA适配体溶液，并在室温下孵育过夜。适配体附着后，表面用1 μM的MCH封闭30分钟以减少非特异性结合。随后设备用去离子水彻底冲洗，并在氮气下干燥以去除残留试剂。生物功能化策略的示意图见图S6。

4.4 表面表征

每个功能化步骤后，使用X射线光电子能谱（XPS）对表面进行表征。光谱采用AXIS Supra Plus光谱仪（Kratos Analytical，英国）进行测量，使用单色Al Kα辐射（1486.6 eV，100 W）。宽扫描范围为0至1200 eV，通过能量为160 eV（步长1.0 eV，时间120秒）；高分辨率扫描使用通过能量20 eV（步长0.1 eV，时间60秒，最多扫描5次）。原子力显微镜（AFM）用于观察SiO2表面的形貌。图像在空气中使用Dimension Icon AFM（Bruker）和ScanAsyst-Air模式以及相应的探针获得，扫描速率为1 Hz，每行256个样本，扫描尺寸为5 × 5 μm。水接触角测量在室温（25°C）下使用光学张力计（Theta Flex，Biolin Scientific，芬兰）进行。通过微量注射器在多个位置滴加5 μL的去离子水，每0.1秒捕捉一次液滴图像，并利用边缘检测和拉普拉斯-杨氏拟合方法分析表面张力。

4.5 pH值和血清素的电学测量

为了评估FET设备对pH值和血清素的传感性能，使用Keithley 2600B源测量单元（SMU）进行电学表征。测量在标准的三端设置中进行，包括源极、漏极和栅极。测量过程中，栅极电压（VGS）从0扫描到-2 V，使用Ag/AgCl参比电极（SD5；World Precision Instruments）；同时源极-漏极电压（VDS）保持在0至-2 V之间，以-0.5 V的步长递增。在每个VGS下记录相应的源极-漏极电流（IDS）。在整个测量过程中还监测了栅极漏电流（IGS）以确保最小泄漏。为了评估pH响应，在传感区域滴加了大约10 μL的磷酸盐缓冲液，其pH值范围为5至10。对于血清素传感，使用在不同浓度的人工汗液中制备的血清素溶液进行测量。所有测量均在室温下进行。对于每个浓度或pH值，结果取三个独立样本的平均值。

作者贡献

T.T.H.N.负责概念化、方法设计、数据分析、可视化、撰写初稿、审阅和编辑最终手稿。Q.T.T.负责数据分析、可视化和编辑。C.M.N.、M.A.H.、K.V.H.和S.J.负责方法设计、撰写、审阅和编辑最终手稿。D.C.P.、V.D.D.和S.I.审阅和编辑最终手稿。X.T.V.负责概念化、撰写、审阅和编辑最终手稿。N.T.N.负责概念化、监督、撰写、审阅和编辑最终手稿。所有作者参与了手稿的严格审阅过程。所有作者都已阅读并同意发表的手稿版本。

致谢

作者感谢昆士兰大学显微镜与微分析中心（CMM）的Microscopy Australia Facility以及昆士兰大学Australian National Fabrication Facility（ANFF）昆士兰节点提供的设施、科学和技术支持。T.T.H. Nguyen获得了澳大利亚技术科学与工程学院的资助。M.C. Nguyen获得了Griffith大学的高等学位研究奖学金。N.T. Nguyen和M.A. Huynh获得了澳大利亚研究委员会（ARC）的Discovery项目（DP220100261）和Laureate Fellowship（FL230100023）的资助。T.K. Nguyen获得了澳大利亚研究委员会DECRA Fellowship（DE240100408）和Griffith新研究员基金的资助。X.T. Vu和T.K. Nguyen获得了DAAD澳大利亚-德国联合研究合作计划（项目编号57655030）的资助。Q.T. Trinh获得了Laureate Fellowship（FL230100023）的资助。开放获取出版由Griffith大学通过Wiley - Griffith大学协议与Council of Australasian University Librarians合作实现。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。由于隐私或伦理限制，这些数据不能公开。