《Advanced NanoBiomed Research》：Spatial Cell Death and Oxidative Stress Dynamics in Gas Plasma-Treated Tumor Tissues
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冷物理气体等离子体（gas plasma）产生多种活性氧与氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, ROS/RNS），已成为一种潜在的抗癌治疗方法。然而，其对肿瘤组织内部及深层的影响尚不清楚。本研究利用三种气体等离子体
冷物理气体等离子体（gas plasma）产生多种活性氧与氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, ROS/RNS），已成为一种潜在的抗癌治疗方法。然而，其对肿瘤组织内部及深层的影响尚不清楚。本研究利用三种气体等离子体处理的肿瘤模型（体内外Panc1胰腺癌组织、离体CT26结直肠癌组织及体内SSC7鳞状细胞癌组织），分析了细胞凋亡（apoptosis）、组织穿透性以及相关应激标志物。在所有模型中，均观察到TUNEL阳性细胞的显著增加，且细胞凋亡程度与气体等离子体的作用强度和持续时间相关，在肿瘤周边区域最为显著。氧化应激与亚硝基化应激标志物——8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG）和3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine, 3-NT）的免疫荧光定量分析显示，染色强度升高，且在距组织表面500?μm范围内尤为显著。最后，基于对健康小鼠皮肤进行气体等离子体处理后的组织病理学分析进行了安全性评估。虽然发现了一定程度的凋亡事件，但在暴露后的评估区域内，未观察到对邻近健康组织的显著不良影响，如坏死或脱靶组织损伤。这些发现支持了在测试条件下具有良好的安全性特征，这是未来临床转化的关键考量因素。
论文解读：气体等离子体治疗肿瘤的时空效应与安全性评估
研究背景与动机
恶性肿瘤是全球发病和死亡的主要原因之一。尽管手术、化疗和放疗取得了进展，但肿瘤耐药性、复发以及对正常组织的副作用限制了其疗效。肿瘤异质性和适应性使得治疗愈发困难，因此迫切需要开发有效且安全的替代或辅助疗法。冷物理气体等离子体（gas plasma）因其选择性消融肿瘤、诱导细胞氧化应激及微创特性受到关注。它能产生复杂的活性氧（ROS）和活性氮物种（RNS），通过诱导氧化应激、DNA损伤和程序性细胞死亡发挥抗肿瘤作用。然而，关于气体等离子体如何穿透实体肿瘤组织并在不同肿瘤微环境中诱导细胞死亡的动态过程，目前尚缺乏系统性评估。为了填补这一空白，研究人员旨在通过多种肿瘤模型，阐明气体等离子体治疗的空间动力学及其分子机制，为其临床转化提供依据。本项研究成果发表在《Advanced NanoBiomed Research》期刊上。
关键技术方法概述
研究人员构建了三种互补的肿瘤模型：基于鸡胚绒毛尿囊膜（TUM?CAM）的体内外胰腺癌模型（Panc1细胞）、小鼠皮下移植瘤离体结直肠癌模型（CT26细胞）以及小鼠原位鳞状细胞癌模型（SCC7细胞）。实验采用大气压等离子体射流（kINPen IND/MED），分别使用氩气（Ar）或氦?氧混合气体，设置导电（conductive, c）和非导电（non?conductive, nc）两种作用模式。通过TUNEL染色定量细胞凋亡，利用免疫荧光检测氧化应激标志物8?OHdG和亚硝基化标志物3?NT，并使用ImageJ软件分析荧光图像以确定凋亡细胞的空间分布和穿透深度。此外，利用Tivita系统对健康小鼠皮肤进行高光谱成像，评估微循环参数变化，并通过组织病理学（H&E染色）评估安全性。
研究结果
3.1 肿瘤模型系统
研究人员评估了多种治疗策略，涵盖从体外三维球体到体内实体瘤的不同层次。结果表明，癌症具有高度异质性，单一模型难以全面评估疗效。通过整合体内外、离体数据，能够比较不同气体等离子体活性成分的作用模式及应激生物标志物的响应，为跨模型比较提供了基础。
3.2 气体等离子体处理对肿瘤组织的影响：细胞凋亡与结构改变
在TUM?CAM胰腺癌模型中，气体等离子体处理后TUNEL阳性细胞显著增加，加入过氧化氢酶（catalase）后凋亡有所减弱，但未降至对照水平，表明除H?O?外还存在其他促凋亡因子。在离体CT26结直肠癌组织中，导电模式（pArg_c）比非导电模式（pArg_nc）诱导更多凋亡细胞，且这种效应在肿瘤周边最明显。加入广谱抗氧化剂N?乙酰半胱氨酸（NAC）后，导电模式下的凋亡细胞数显著降低，提示多种ROS共同参与。在体内SCC7模型中，单用气体等离子体或局部免疫调节剂IMQ均可诱导周边凋亡，但两者联合并未显示叠加或协同效应。
3.3 气体等离子体活性成分的穿透深度
通过测量TUNEL阳性细胞距组织边缘的距离，量化了气体等离子体的渗透能力。在胰腺癌模型中，气体等离子体将平均穿透深度从对照组的177?μm提升至300?μm，加入过氧化氢酶后降至217?μm。在结直肠癌模型中，导电模式的平均深度达314?μm，显著高于非导电模式的189?μm。加入过氧化氢酶或NAC均显著降低了穿透深度，尤其在NAC作用下，深度降至约100?μm，说明短寿命ROS和长寿命H?O?共同决定了气体等离子体在组织内的扩散范围。
3.4 氧化与亚硝基化应激标志物的定量
免疫荧光结果显示，气体等离子体处理显著提升了8?OHdG信号，表明DNA遭受氧化损伤。在胰腺癌和结直肠癌模型中，8?OHdG阳性细胞比例随处理强度增加而上升，且过氧化氢酶可将其恢复至基线水平。空间分布分析显示，8?OHdG信号在前500?μm深度最高，导电模式下信号更均匀并向内部延伸。相比之下，3?NT信号在各组间差异不显著，提示蛋白质硝化修饰相对较弱，主要由瞬态RNS介导。
3.5 不同气体与传统治疗的安全性比较
在健康小鼠皮肤模型中，单次10?min的气体等离子体处理（氩气或氦?氧）在6?h和24?h后均引起显著的TUNEL阳性细胞增多，且穿透深度随时间延长而增加（24?h时约380?μm），但组织学（H&E）检查未发现表皮或真皮的结构性损伤、炎症或坏死。相较之下，IMQ处理未引起类似凋亡或结构改变。高光谱成像进一步显示，气体等离子体可暂时改变局部血氧饱和度（StO?）和灌注（NIR），但这些血流动力学变化是短暂且局限的。
3.6 微循环参数随气体种类的变化
利用高光谱成像监测皮肤微循环，发现气体等离子体处理后30?min，局部氧合（StO?）和组织血红蛋白指数（THI）显著升高，深层灌注（NIR）下降。6?h和24?h后，NIR值回升，氦?氧混合气体还导致相对组织水指数（TWI）持续升高，提示气体成分对微环境的即时调节作用是可逆的。
讨论与结论
讨论部分指出，气体等离子体通过破坏癌细胞内的氧化还原平衡诱导凋亡。癌细胞因瓦氏效应（Warburg effect）常表现为基础ROS水平升高且抗氧化缓冲能力弱，使其更易受到外源性ROS的冲击。导电模式通过更强的放电电流和电场，将短寿命ROS输送至组织表面，引发细胞膜损伤和信号重编程；而长寿命的H?O?则负责深层渗透。过氧化氢酶仅部分阻断效应，说明除H?O?外，羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O?·?）等亦发挥关键作用。NAC作为谷胱甘肽前体，能够中和多种ROS，进一步验证了多重活性物种的协同机制。8?OHdG的显著升高证实了DNA氧化损伤是主要细胞杀伤途径，而3?NT水平变化不大，提示蛋白质硝化并非主要损伤形式。安全性评估表明，即便在长达10?min的处理时间内，健康皮肤亦未出现结构性坏死或长期炎症，显示出良好的组织相容性，符合临床转化对安全性的基本要求。
结论部分强调，气体等离子体处理可显著诱导肿瘤组织凋亡，其程度与处理强度和时间呈正相关，且主要集中在肿瘤周边。过氧化氢酶和NAC的部分保护作用揭示了H?O?、·OH和O?·?等多种ROS的共同参与。8?OHdG表达显著上调，且在前500?μm深度最为明显，而3?NT变化有限。组织穿透分析进一步证实气体等离子体能够重构肿瘤组织通透性。最重要的是，在测试条件下，气体等离子体对邻近健康组织未造成坏死或脱靶损伤，确立了kINPen产生的气体等离子体在临床应用中的安全性前提。
