申勤龙清肺培元颗粒通过抑制HDAC2介导的ULK1去乙酰化作用，缓解肺炎链球菌肺炎中的炎症反应、巨噬细胞自噬以及M1型巨噬细胞的极化

《Letters in Drug Design & Discovery》：Shenqinlong Qingfei Peiyuan Keli alleviates inflammation, macrophage autophagy and M1 polarization via inhibiting HDAC2-mediated ULK1 deacetylation in pneumococcal pneumonia

　　西园松|彭飞蒙|郭润泽|马秀霞|冯桑|徐丽兰
中国河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心，郑州

**摘要**
背景：
由于免疫缺陷，肺炎链球菌肺炎是获得性免疫缺陷综合征住院患者中最常见的诊断。需要药物来缓解这一群体的痛苦。本研究旨在探讨神秦龙清肺培元颗粒（QFPY）对免疫功能低下且患有肺炎链球菌肺炎的小鼠的治疗效果及其潜在机制。

**方法**
通过共免疫沉淀（co-IP）实验验证了组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）与Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）之间的相互作用，并使用Western blot检测目标蛋白的水平。通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的外周血T细胞亚群和巨噬细胞极化情况，透射电子显微镜观察巨噬细胞中的自噬体。此外，还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症细胞因子。使用猫白血病病毒（FLV）和肺炎链球菌III型建立免疫功能低下的小鼠模型，以探索QFPY在体内的治疗效果。

**结果**
HDAC2能够与ULK1相互作用并诱导其去乙酰化。与对照组相比，QFPY治疗增加了胸腺指数，降低了脾脏指数，改善了病理肺结构，并通过调节HDAC2/ULK1轴部分缓解了免疫功能低下小鼠的炎症反应。此外，QFPY还增加了外周血T淋巴细胞的数量，并促进了M1向M2巨噬细胞的极化。值得注意的是，QFPY通过调节HDAC2介导的ULK1去乙酰化部分增强了巨噬细胞中的自噬水平。

**结论**
QFPY调节了免疫功能低下且患有肺部感染的小鼠的免疫反应和炎症，并通过调节HDAC2诱导的ULK1去乙酰化部分促进了巨噬细胞中的自噬。

**引言**
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子。它感染免疫细胞，包括表达CD4受体的T淋巴细胞（主要是CD4+ T细胞）和单核细胞/巨噬细胞，最终导致免疫系统功能障碍并发展为AIDS。CD4+ T细胞计数显著减少是AIDS晚期的特征，这可能导致致命的机会性感染。2022年，约有3900万人感染HIV（PLWH），新增约130万例感染病例，约63万人死于HIV相关疾病。抗逆转录病毒治疗方案使PLWH的寿命延长，生活更接近正常。
呼吸道是该疾病最常受影响的部位。在疫情初期，肺部感染的发生率为100%，而在高效抗逆转录病毒治疗时代降至70%。细菌性肺炎，尤其是肺炎链球菌肺炎是最常见的诊断，肺部感染不仅是与AIDS相关的机会性感染，也是PLWH住院的最常见原因之一。肺驻留巨噬细胞负责清除吸入的颗粒物、入侵的病原体以及肺细胞产生的表面活性剂。在损伤情况下，M1（促炎）和M2（抗炎）巨噬细胞之间保持平衡，以防止组织过度反应。伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬是三种形式的自噬，其中溶酶体依赖的巨自噬是真核细胞适应代谢压力、清除危险物质的主要分解机制。巨自噬/自噬在多种抗菌先天防御机制中起着核心作用。一些病原菌被发现会干扰自噬机制以在受感染的宿主细胞中存活。此外，HIV-1病毒可以抑制受感染CD4+ T细胞和单核细胞中的自噬，从而逃避宿主免疫系统并帮助其复制。研究还发现，HIV-1在巨噬细胞中的复制激活会导致自噬流受阻，进一步有利于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株的存活。这些研究表明，针对患有细菌性肺炎的PLWH的自噬可能是一种新的治疗策略。

**乙酰化**
乙酰化是由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）执行的主要翻译后修饰之一，通常导致转录抑制。HDAC2属于这一高度保守的家族，已被发现可以调节癌症、慢性肾病、脂肪肝等疾病中的自噬。Unc-51样激酶1（ULK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与自噬的关键初始事件——自噬体的形成。马等人发现，短链脂肪酸可以通过调节HDAC2/ULK1轴缓解肾纤维化并促进肾小管细胞的自噬。神秦龙清肺培元颗粒（QFPY）是一种基于中医原理开发的现代中药配方，用于治疗免疫功能低下患者的呼吸系统疾病，特别是那些反复发生肺部感染的HIV/AIDS患者。我们的先前研究发现，QFPY可以改善患者的临床症状并降低并发症的发生率。然而，其潜在机制，特别是在细胞和分子水平上的免疫调节作用，仍大部分未被探索。重要的是，虽然HDAC2/ULK1轴被认为是其他疾病中自噬的调节因子，但其在调节肺泡巨噬细胞功能中的作用——特别是在HIV-1感染的独特免疫环境中——尚不清楚。此外，目前尚无研究探讨治疗药物是否可以通过靶向这一特定途径来重新编程巨噬细胞极化并恢复免疫功能低下的宿主的先天免疫防御。因此，我们假设QFPY在PLWH中的临床疗效至少部分通过HDAC2/ULK1-自噬途径实现，从而重新平衡肺泡巨噬细胞的极化。本研究首次将HDAC2/ULK1信号通路与HIV-1相关免疫缺陷背景下的巨噬细胞自噬和极化联系起来，探讨了一种中药配方的分子机制。我们的发现不仅为QFPY的临床应用提供了机制基础，还可能确定HDAC2/ULK1轴作为恢复脆弱人群免疫功能的新治疗靶点。

**材料与方法**
**细胞系**
人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞系从Pricella Life Science and Technology Co., Ltd.（武汉，中国）购买，并在添加了10%胎牛血清（Beyotime，上海，中国）的DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Rockville，MD，美国）中于37℃的培养箱（Thermo Fisher Scientific）中培养。

**活性成分分析**
QFPY含有人参、黄芩、蚓虫草、瓜蒌根、浙贝母、人工牛黄、陈皮和甘草。传统中药系统药理学平台（TCMSP）数据库（https://www.tcmsp-e.com/#/database）是一个独特的中药系统药理学平台，可用于检索中药成分。通过TCMSP搜索，筛选出口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18且排除无效成分的成分，我们收集了人参的22个成分、黄芩的33个成分、浙贝母的5个成分、人工牛黄的5个成分、陈皮的4个成分和甘草的88个成分。TCMSP筛选结果显示，瓜蒌根和蚓虫草中没有包含的成分。随后，在本研究中，分别从Batmanic-TCM数据库中获得了3个和6个成分（Scorecut-off > 20）。通过文献整理和TCMSP，共发现了16个蚓虫草成分。因此，QFPY共有170个活性成分。

**动物实验**
BALB/c小鼠（雌性，6-8周龄，18-20克）从Vitalriver（北京，中国）获得，并饲养在湿度为50%-70%的无特定病原体设施中。肺炎链球菌III型由河南儿童医院微生物学和病理学实验室提供，猫白血病病毒（FLV）悬液由河南中西医结合医院药学研究所提供。QFPY由河南中医药大学第一附属医院生产。60只小鼠随机分为6组（每组10只）：正常组、对照组、QFPY组、QFPY+腺病毒载体组（QFPY-VEC组）、QFPY+腺病毒HDAC2组（Q-HDAC2组）和QFPY+腺病毒HDAC2+腺病毒ULK1组（Q-HDUL组）。除正常组外，所有小鼠均腹腔注射0.1 mL FLV悬液，维持21天以建立免疫功能低下模型。2天后，免疫功能低下的小鼠通过鼻吸入注射35 μL肺炎链球菌III型溶液（病毒滴度：2×10^7 CFU/mL）。再过2天，QFPY组、QFPY-VEC组、Q-HDAC2组和Q-HDUL组每天通过灌胃给予4克/千克的QFPY，持续14天；首次给药后，通过尾静脉分别向各组注射腺病毒颗粒（5×10^7 PFU/小鼠）。最后一次给药后24小时对小鼠实施安乐死，收集胸腺、脾脏、肺和外周全血进行后续分析。动物实验获得了河南中医药大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会的批准（编号HNTCMDW-20230109）。

**Western blot**
使用ExKineTM Pro Animal Cell/Tissue Total Protein Isolation Kit（Abbkine，武汉，中国）从细胞和肺组织中分离总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime）评估蛋白浓度。然后对蛋白进行变性处理，将其加载到10% SDS-PAGE凝胶中进行电泳，分离后的蛋白转移到PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，美国）上。用5%无脂牛奶封闭后，膜依次与一级抗体、抗Beclin1（WL02508，1:1000，Wanleibio，武汉，中国）、抗LC3II/I（WL01506，1:1000，Wanleibio）、抗p62（WL02385，1:500，Wanleibio）、抗GAPDH（WL01114，1:1000，Wanleibio）、抗iNOS（ab178945，1:1000，Abcam，剑桥，英国）、抗Arg1（93668，1:1000，CST，马萨诸塞州，美国）、抗HDAC2（ab32117，1:2000，Abcam）、抗ULK1（ab229909，1:1000，Abcam）和抗乙酰赖氨酸（ab190479，Abcam，1:1000）以及HRP标记的抗IgG抗体（ab6721，1:5000，Abcam，剑桥，英国）孵育。最后，用ECL底物（Beyotime）孵育膜，并使用Image J软件分析蛋白条带。

**过表达载体的构建**
pCMV3-C-HA-ULK1、pCMV3-C-FLAG-ULK1、pCMV3-C-His-HDAC2和pCMV3-C-Flag-HDAC2真核过表达载体由SinoBiological（北京，中国）生产。根据协议使用Lipofectamine? 3000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）将这些载体转染到HEK293T细胞中。

**共免疫沉淀（co-IP）实验**
使用Pierce Classic IP试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行co-IP实验。简而言之，收获处理后的细胞后，裂解细胞并收集细胞裂解物。随后，将预处理的细胞裂解物与抗体（抗Flag（ab205606，1:30，Abcam）、抗HA（ab236632，1:30，Abcam）或抗His（ab18184，1:200，Abcam）孵育以形成免疫复合物。然后使用Pierce Protein A/G琼脂糖捕获免疫复合物并洗脱，洗脱后的复合物通过Western blot进行分析。

**胸腺和脾脏指数**
安乐死后，保存胸腺和脾脏组织并立即称重。使用以下公式计算胸腺和脾脏指数：胸腺指数 = 胸腺重量/体重（mg/g）；脾脏指数 = 脾脏重量/体重（mg/g）。

**苏木精和伊红（HE）染色**
使用4%甲醛溶液（Beyotime）固定肺组织，随后脱水、透明化、石蜡包埋并切成4-μM厚的切片。然后重新水化并用苏木精（Beyotime）和伊红（Beyotime）染色，再用中性树胶封片。在显微镜（Thermo Fisher Scientific）下拍摄照片。

**T细胞亚群分析**
根据制造商的说明书，将FITC抗CD3（ab34722，Abcam）、PE/Cy7抗CD4（ab210351，Abcam）和APC抗CD8α抗体（ab237168，Abcam）加入Trucount管（BD sciences，新泽西，美国）。用Magic? Fc受体阻断剂（Abace Biotechnology，北京，中国）阻断后，加入50 μL含有抗凝剂的外周全血，然后在4℃下孵育20分钟。最后使用流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）分析T细胞亚群。

**巨噬细胞极化分析**
收集新鲜支气管肺泡灌洗液（BALF）后，通过300×g离心5分钟收集BALF中的细胞，调整细胞浓度至1×10^6细胞/100 μL。用抗小鼠CD16/32抗体（E-AB-F0997A，Elabscience，武汉，中国）阻断后，加入PerCP/Cyanine5.5抗小鼠F4/80（E-AB-F0995J，Elabscience）、PE抗小鼠CD86（E-AB-F0994D，Elabscience）和PerCP/Cyanine7抗小鼠CD206抗体（F-AB-F1135H，Elabscience），按照制造商的说明进行操作。在4℃下孵育30分钟后，尽快使用流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）对细胞进行了分析。

**自噬体的检测**
肺组织经过固定、用磷酸盐缓冲液洗涤、脱水、包埋、切成超薄切片和染色等处理。最后，在透射电子显微镜（TEM）下分析了自噬体的数量。

**炎症细胞因子的检测**
肺组织用磷酸盐缓冲液洗涤以去除残留血液，然后将组织切成小块，并使用预冷的匀浆器（Thermo Fisher Scientific）进行匀浆。接着收集上清液，根据相应ELISA试剂盒（Elabscience）的说明书检测IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。

**统计分析**
所有数据均使用GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿）进行分析，测量数据以平均值±标准差（SD）表示。两组之间的平均值差异使用Student’s t检验进行分析，六组实验组之间的差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。P<0.05被认为具有统计学意义。

**结果**
**HDAC2上调抑制ULK1蛋白的乙酰化**
共免疫沉淀（co-IP）结果显示HDAC2可以与ULK1相互作用，HDAC2过表达降低了ULK1蛋白的乙酰化水平（图1A-C）。进一步的Western blot检测显示，HDAC2上调的HEK293T细胞中ULK1蛋白的表达水平较低（图1D）。此外，与正常对照组（NS）相比，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中HDAC2的蛋白表达增强，而QFPY处理可以逆转这种上调。经过HDAC2过表达或HDAC2和ULK1共表达的肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中HDAC2蛋白水平更高（图1E）。有趣的是，与NS组相比，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中ULK1蛋白水平下调；然而，QFPY处理挽救了这一效应。HDAC2过表达抑制了QFPY诱导的ULK1上调，在Q-HDUL组中通过ULK1共表达逆转了这一效应（图1F）。所有结果均证实HDAC2过表达可以降低ULK1的乙酰化并进一步抑制其表达，而QFPY可以在体内调节HDAC2/ULK1轴。

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**图1. QFPY调节ULK1的乙酰化和表达。** (A-B) 共免疫沉淀（co-IP）证实HDAC2可以与ULK1相互作用。 (C) 共免疫沉淀（co-IP）显示HDAC2上调增加了ULK1蛋白的乙酰化水平。 (D) Western blot检测显示HDAC2上调降低了ULK1的表达。 (E-F) Western blot检测了NS组、对照组（Control）、QFPY组、Q-VEC组、Q-HDAC2组和Q-HDUL组肺组织中的HDAC2和ULK1蛋白水平。D，Student’s t检验；E-F，单因素方差分析（one-way ANOVA）。*: P<0.05，与对照组相比；#: P<0.05，与HDAC2组相比。

**QFPY处理通过调节HDAC2/ULK1轴部分减轻肺损伤并调节免疫**
与NS组相比，对照组的胸腺指数下降，QFPY处理逆转了这一现象，而HDAC2上调部分抵消了HDAC2过表达导致的胸腺指数下降（图2A）。此外，对照组中增强的脾指数也部分被QFPY注射逆转，HDAC2过表达也挽救了这一效应，而ULK1共表达进一步缓解了这一作用（图2B）。此外，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中支气管和肺泡有渗出物，肺泡壁肿胀并伴有炎症渗出；然而，QFPY组的支气管和肺泡结构基本恢复正常，而HDAC2过表达逆转了这一情况；然而，在Q-HDUL组中，ULK1共表达减轻了HDAC2上调引起的肺损伤（图2C）。值得注意的是，QFPY处理还增加了肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠外周血中的CD3+和CD4+ T细胞数量；然而，HDAC2过表达减轻了上调的T细胞比例，而在肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠中过表达ULK1挽救了这一情况；尽管如此，各组中CD8+ T细胞的比例没有显著变化（图3A-D）。这些结果表明，QFPY处理通过调节HDAC2/ULK1轴部分调节免疫反应并减轻肺损伤。

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**图2. QFPY通过调节HDAC2/ULK1轴部分减轻肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺损伤。** (A) NS组、对照组（Control）、QFPY组、Q-VEC组、Q-HDAC2组和Q-HDUL组的胸腺指数。 (B) 六组小鼠的脾指数。 (C) 六组小鼠肺组织的组织学图像，用HE染色。A-B，单因素方差分析（one-way ANOVA）。*: P<0.05，与对照组相比；#: P<0.05，与HDAC2组相比。

**QFPY通过调节HDAC2/ULK1轴部分调节免疫**
ELISA检测结果显示，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平高于NS组；然而，QFPY处理减轻了这些现象，随后HDAC2上调挽救了这一效应；然而，ULK1共表达缓解了HDAC2上调诱导的促炎因子的释放（图5A-B）。QFPY组中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的水平呈上升趋势，但这些变化未达到统计学显著性（图5C-D）。此外，QFPY处理还降低了对照组支气管肺泡灌洗液（BALF）中M1型巨噬细胞的比例，同时增加了M2型巨噬细胞的比例，这一情况在Q-HDAC2组中得到逆转，而ULK1过表达进一步缓解了这一效应（图6A-C）。此外，QFPY处理还通过HDAC2/ULK1轴部分降低了M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达或增加了M2型巨噬细胞标志物Arg1的表达（图6D-E）。总之，这些结果表明QFPY通过调节巨噬细胞极化，在肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠中抑制炎症反应。

**讨论**
自噬是一种稳态机制，已被证明在控制微生物病原体感染中起作用。自噬对T细胞稳态也至关重要。自噬诱导剂雷帕霉素通过增强T细胞自噬，减少了HIV-1感染人源化小鼠的病毒载量并恢复了T细胞的抗病毒功能，突显了自噬诱导剂在治疗HIV-1中的潜力。HIV-1感染的CD4+ T细胞可以通过包膜糖蛋白诱导未感染 bystander CD4+ T细胞的自噬和最终凋亡，HIV-1也可以利用感染细胞中的自噬来对抗其降解。此外，对HIV感染个体和SIV感染猴子的脑部研究显示，自噬功能障碍与痴呆和脑炎有关，HIV感染下的自噬减少使细胞对促凋亡和其他有害信号敏感，从而导致神经毒性。我们的研究还发现，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的外周全血中CD3+和CD4+ T细胞的数量低于免疫正常小鼠。HIV-1不仅可以感染CD4+ T细胞，还可以感染表达CD4受体的单核细胞/巨噬细胞。由于艾滋病患者的免疫系统受损，细菌性肺部感染是住院的主要原因。肺驻留巨噬细胞对于清除吸入的污染物和入侵的病原体等至关重要。研究表明，HIV-1感染的巨噬细胞中自噬受到抑制，这有利于HIV-1的复制。我们的研究发现，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）中的巨噬细胞自噬也受损。此外，我们的研究进一步证实，组蛋白去乙酰酶HDAC2在FLV感染小鼠的肺组织中上调，而ULK1的表达受到抑制；此外，HDAC2通过翻译后修饰（去乙酰化）抑制了ULK1的表达，从而首次导致巨噬细胞自噬受损。
中医在中国有着悠久的历史，也为癌症治疗提供了新的治疗思路。QFPY是一种在中国临床使用的传统中药化合物。我们的研究表明，QFPY处理增加了肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的胸腺指数并降低了脾指数。此外，它还能恢复异常的肺结构，减少炎症渗出（降低促炎细胞因子），调节巨噬细胞极化以对抗过度炎症，并增加外周血中CD3+和CD4+ T淋巴细胞的比例。此外，我们的研究首次提供了证据，表明QFPY通过调节HDAC2介导的ULK1去乙酰化部分增强了巨噬细胞自噬。

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**图4. QFPY通过HDAC2/ULK1轴部分促进巨噬细胞自噬。** (A-C) Western blot检测了NS组、对照组（Control）、QFPY组、Q-VEC组、Q-HDAC2组和Q-HDUL组小鼠BALF中巨噬细胞的Beclin1、LC3II/I和p62蛋白水平。 (D) TEM显示了六组巨噬细胞中的自噬体，黑色箭头表示自噬体。A-C，单因素方差分析（one-way ANOVA）。*: P<0.05，与对照组相比；#: P<0.05，与HDAC2组相比。

**QFPY通过调节HDAC2/ULK1轴部分调节巨噬细胞极化**
ELISA检测结果显示，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的肺组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平高于NS组；然而，QFPY处理减轻了这些现象，随后HDAC2上调挽救了这一效应；然而，ULK1共表达缓解了HDAC2上调诱导的促炎因子的释放（图5A-B）。QFPY组中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的水平呈上升趋势，但这些变化未达到统计学显著性（图5C-D）。此外，QFPY处理还降低了对照组BALF中M1型巨噬细胞的比例，同时增加了M2型巨噬细胞的比例，这一情况在Q-HDAC2组中得到逆转，而ULK1过表达进一步缓解了这一效应（图6A-C）。此外，QFPY处理还通过HDAC2/ULK1轴部分降低了M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达或增加了M2型巨噬细胞标志物Arg1的表达。总之，这些结果表明QFPY通过调节巨噬细胞极化，在肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠中抑制炎症反应。

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**图5. QFPY通过调节HDAC2/ULK1轴部分抑制肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的炎症。** (A-B) ELISA检测了NS组、对照组（Control）、QFPY组、Q-VEC组、Q-HDAC2组和Q-HDUL组小鼠肺组织中的促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。 (C-D) ELISA检测了六组小鼠肺组织中的抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的水平。A-D，单因素方差分析（one-way ANOVA）。*: P<0.05，与对照组相比；#: P<0.05，与HDAC2组相比。

**讨论**
自噬是一种稳态机制，已被证明在控制微生物病原体感染中起作用。自噬对T细胞稳态也至关重要。自噬诱导剂雷帕霉素通过增强T细胞自噬，减少了HIV-1感染人源化小鼠的病毒载量并恢复了T细胞的抗病毒功能，突显了自噬诱导剂在治疗HIV-1中的潜力。HIV-1感染的CD4+ T细胞可以通过包膜糖蛋白诱导未感染 bystander CD4+ T细胞的自噬和最终凋亡，HIV-1也可以利用感染细胞中的自噬来对抗其降解。此外，对HIV感染个体和SIV感染猴子的脑部研究显示，自噬功能障碍与痴呆和脑炎有关，HIV感染下的自噬减少使细胞对促凋亡和其他有害信号敏感，从而导致神经毒性。我们的研究还发现，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的外周全血中CD3+和CD4+ T细胞的数量低于免疫正常小鼠。HIV-1不仅可以感染CD4+ T细胞，还可以感染表达CD4受体的单核细胞/巨噬细胞。由于艾滋病患者的免疫系统受损，细菌性肺部感染是住院的主要原因。肺驻留巨噬细胞对于清除吸入的污染物和入侵的病原体等至关重要。研究表明，HIV-1感染的巨噬细胞中自噬受到抑制，这有利于HIV-1的复制。我们的研究发现，肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的BALF中的巨噬细胞自噬也受损。此外，我们的研究进一步证实，组蛋白去乙酰酶HDAC2在FLV感染小鼠的肺组织中上调，而ULK1的表达受到抑制；此外，HDAC2通过翻译后修饰（去乙酰化）抑制了ULK1的表达，从而导致巨噬细胞自噬受损。
中医在中国有着悠久的历史，也为癌症治疗提供了新的治疗思路。QFPY是一种在中国临床使用的传统中药化合物。我们的研究表明，QFPY处理增加了肺炎链球菌肺炎免疫缺陷小鼠的胸腺指数并降低了脾指数。此外，它还能恢复异常的肺结构，减少炎症渗出（降低促炎细胞因子），调节巨噬细胞极化以对抗过度炎症，并增加外周血中CD3+和CD4+ T淋巴细胞的比例。此外，我们的研究首次提供了证据，表明QFPY通过调节HDAC2介导的ULK1去乙酰化部分增强了巨噬细胞自噬。
目前，这项研究存在几个局限性需要考虑。首先也是最重要的是，使用FLV诱导的免疫缺陷模型而不是直接HIV-1感染模型是一个关键限制。虽然FLV模型有效地创造了适合研究继发性细菌性肺炎的T细胞耗竭和免疫抑制状态，但它不能完全再现HIV-1感染的特定病毒学和免疫学特征，如CD4+ T细胞耗竭或慢性免疫激活的特定机制。因此，我们的发现直接应用于人类HIV-1情况的可行性需要进一步验证。未来的研究应旨在在更具体的HIV-1模型（如感染HIV-1的人源化小鼠）中确认这些结果，以加强我们结论的临床相关性。此外，QFPY是一种多组分草药配方，需要进一步分离和验证其确切的活性成分及其药代动力学/毒理学特性。此外，本研究的样本量设计为n=10，这可能是一个主要限制。未来需要在更大的队列中验证我们的结果。目前，自噬是通过标记物（Beclin1、LC3、p62）和TEM来评估的。额外的动态分析（例如，自噬通量与抑制剂的关系）可能进一步支持我们的结论，我们未来的研究计划中将包含此类实验。通过分子对接研究，我们发现葫芦果中的活性成分甲基棕榈酸能够与目标基因HDAC2相互作用（见补充图1A-C），这一点需要通过网络药理学分析和未来的实验来进一步验证。最后，将这些有前景的临床前发现转化为临床应用，需要在人类群体中进行广泛的安全性、最佳剂量和疗效研究。

总之，我们的研究为QFPY的免疫调节、抗炎（降低促炎细胞因子）和促进自噬作用提供了临床前证据和机制基础，这部分是通过调节免疫功能低下的肺炎链球菌肺炎小鼠体内的HDAC2/ULK1轴实现的。这些发现可能为未来开发针对免疫缺陷相关细菌性肺炎患者的支持性疗法提供参考。

**作者贡献声明：**
- Liran Xu：撰写、审阅与编辑、数据可视化、实验设计、资金筹集、概念构思。
- Xiyuan Song：撰写初稿、项目监督、资源协调、项目管理。
- Pengfei Meng：数据管理。
- Runze Guo：软件开发与数据分析。
- Xiuxia Ma：实验方法设计。
- Feng Sang：结果验证。

**出版同意：** 不适用。

**伦理批准与参与同意：**
动物实验遵循河南中医药大学第一附属医院动物护理和使用委员会的指导原则（编号HNTCMDW-20230109），并符合国家动物护理和伦理机构的指导规范。

**资金支持：**
本研究得到了国家“十三五”重大科技项目（2017ZX10205502）、河南省自然科学基金项目（232300420274）以及河南省“双一流”建设学科中医科学专项研究项目（HSRP-DFCTCM-2023–8–03）和河南中医药大学科研培育项目（MP2024-43）的资助。